中国药科大学抗体糖组学.docx
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中国药科大学抗体糖组学
抗体——
一.
二.抗体水解
1.木瓜蛋白酶的水解片段
(1)裂解部位:
IgG铰链区H链链间二硫键近N端侧切断。
(2)裂解片段:
①两个Fab段(抗原结合段)
②一个Fc段(可结晶段)
2.胃蛋白酶的水解片段
(1)裂解部位:
铰链区H链链间二硫键近C端切。
(2)裂解片段:
①F(ab′)2包括一对完整的L链和由链间二硫键相连一对略大于Fab中Fd
的H链,称为Fd′含235个氨基酸残基;F(ab′)2具有双价抗体活性。
②Fc可继续被胃蛋白酶消化成更小的片段,失去其生物学活性。
3.抗体的生物学功能
抗体是体液免疫应答中发挥免疫功能最主要的免疫分子;
1特异性地结合抗原
2活化补体
3结合Fc受体,发挥不同的生物学作用
(1)介导Ⅰ型变态反应
(2)调理吞噬作用
(3)发挥抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC效应)
(4)通过胎盘
4.抗体的治疗机制
(1)中和作用:
用于感染性疾病,使病原体或其产生的毒素丧失致病力。
(2)示踪或导向作用:
使与其相连的功能性分子特异性地激活或封闭、破坏靶细胞或靶分子。
(3)竞争性抑制作用/拮抗作用:
与体内产生或体外进入的物质结合,阻止其与靶分子作用产生毒性损害。
(4)抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应(ADCC)及补体依赖性细胞溶解作用(CDC)
(5)通过内影像作用模拟抗原,使疫苗更具安全性及广泛性
五.鼠源单抗的使用限制
(1)鼠源性单克隆抗体的免疫原性
(2)半衰期短
(3)靶吸收差
(4)生产复杂,价格昂贵
六.基因工程抗体(GeneEngineeringAb)
鼠单克隆抗体的人源化的两个基本的原则
(1)保持或提高抗体的亲和力和特异性;
(2)大大降低或消除抗体的免疫原性。
A.人-鼠嵌合抗体:
(Human-mouseChimericAb)用人C区取代鼠C区,可以较好解决鼠
源性单克隆抗体诱发HAMA等不良反应,延长单克隆抗体的半衰期,
改善单克隆抗体的药物动力学。
B.改型抗体:
(HumanizationAntibody)又称人源化抗体,把嵌合抗体的鼠FR区替换成人
FR区,则可能减少单克隆抗体的免疫原性。
C.小分子抗体:
(SmallMolecularAb)完整的抗体分子,相对分子质量较大,难以穿过血
管壁,影响了靶部位对其的摄取。
小分子抗体可分为Fab抗体、单链抗体、
单域抗体、超变区多肽等四种。
(1)Fab抗体:
抗体的Fab段由重链V区(VH)及CH1功能区与轻链间以
二硫键形式连接而成,主要发挥抗体的抗原结合功能。
(2)单链抗体:
(SinglechainAb)在重链V区cDNA3′端与轻链V区cDNA5
′端之间,用一寡聚核苷酸接头(linker,14-25个aa为宜)
连接成单链可变区基因片段,再与相应的载体体外重组,转化
至受体细胞,表达出一具有抗原结合能力的单链抗体多肽。
(3)单域抗体:
(SingledomainAb)只有VH或VL一个功能结构域.单域抗
体的相对分子质量更小,更容易穿过靶组织,但由于VH单域
抗体不含有VL片段,VH的疏水面暴露较大面积,致使其抗
原亲和力大幅度下降,非特异性吸附有所增加。
(4)超变区多肽:
(hypervariableregionpolypeptide)只含有一个CDR多肽
的抗体。
相对分子质量很小,对组织细胞具有极强的穿透
性,但是由于只含有一个CDR区,它的结合抗原能力是
不完全及不稳定的,且在体内相当不稳定。
D.人源性抗体:
(1)噬菌体抗体库:
(phageAbLibrary)利用基因工程的方法可将全套
人抗体重链和轻链V区基因克隆出来,并在噬菌体表面表达、分泌,
经筛选后获得特异性抗体,这种技术称为噬菌体抗体库.
PS:
噬菌体抗体库技术与传统的杂交瘤技术相比具有明显的优越性:
①简便易行,节省时间;
②筛选的容量大;
③直接得到抗体基因,避免了杂交瘤细胞克隆不稳定的缺点;
④抗体库抗体可用原核细胞表达,无需组织培养,可大大降低单克隆
抗体生产的成本。
(2)Xenomouse(异源性或异基因鼠):
噬菌体抗体库制备的抗体通常为Fab
片段或ScFv抗体,由于没有Fc段,亲和力受到极大影响。
Xenomouse
原理就是:
将小鼠的全套抗体基因去除,同时将人的大部分轻链、重
链基因插入到小鼠的染色体当中,这样用抗原刺激小鼠时就可以发生人
抗体基因的重排,从而产生人源性抗体。
糖生物学(Glycobiology)——李谦
1.糖组(glycome):
是指细胞内所有的糖链(包括糖复合物)。
2.糖组学(glycomics):
是研究生物中所有糖类化合物的分子结构与生物功能的关系、糖类的生物合成与分解代谢规律、糖类工具酶的基因表达与调控机制以及糖脂、糖蛋白合成与组装机制等的一门学科。
3.转录因子(transcriptionfactors,TF):
在真核细胞核中,有许多蛋白质能够帮助RNA聚合酶转录RNA。
这类蛋白质统称转录因子或转录调节蛋白(transcriptionregulatoryprotein)。
4.反式作用因子(trans-actingfactor):
能直接或间接与顺式作用元件相互作用,进而调控基因转录的一类调节蛋白。
5.顺式作用蛋白(cis-actingprotein):
是以顺式作用方式调节基因转录的转录因子。
6.酵母双杂交系统(Yeasttwo2hybridsystem,Y2H):
是在酵母体内分析蛋白质-蛋白质相互作用的基因系统。
将欲研究的两个目标蛋白的编码序列分别与GAL4的结合域和激活域的编码序列融合,构建成两个杂交系统;再将这两个杂交系统共同转化至含有报告基因的酵母细胞株;若两个目标蛋白发生相互作用,则会使DNA-BD和DNA-AD在空间上靠近进而激活报告基因的表达。
7.酵母单杂交系统(Yeastonehybridsystem):
酵母单杂交技术是一种研究蛋白质和特定DNA序列相互作用的技术方法。
8.噬菌体展示(Phagedisplaytechniques,PDT):
其原理是将蛋白质文库整合到一个简单的噬菌体颗粒中,利用目的蛋白质与特异配基的亲和力,筛选和配基特异结合的蛋白质。
9.荧光共振能量转移(Fluorescenceresonanceenergytransfer):
10.串联亲和纯化(Tandemaffinitypurification,TAP):
是一种能够快速研究生理条件下蛋白质相互作用、揭示蛋白质复合体相互作用网络的新技术,如今已经成为研究蛋白质组学的一个被广泛采纳的工具。
11.免疫共沉淀(coimmunoprecipitation):
是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
12.蛋白质片段互补分析(proteinfragmentcomplementationanalysis,PCA):
(泛素蛋白可以分为两个片段,将编码这两个片段的基因分别与编码“诱饵”蛋白和“猎物”蛋白的基因在胞质内进行融合表达,如果“诱饵”蛋白和“猎物”蛋白发生相互作用,则泛素蛋白的两个片段得到重组而形成完整的泛素蛋白。
)
13.化学交联法(chemicalcrosslinking):
化学交联是共价连接不同化学功能基团的技术,是对蛋白质化学修饰的简单延伸。
14.蛋白质芯片(proteinmicroarray):
蛋白质芯片技术,是DNA芯片技术的扩展,即在固体支持物表面高密度地固定化排列探针蛋白点阵,以特异地捕获样品中的靶蛋白,然后通过检测器对靶蛋白进行定性或定量分析。
15.荧光共振能量转移(Fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET):
可以在活体细胞生理条件下对蛋白质间的相互作用进行实时的动态研究,已成为现代蛋白质组学研究的有力工具。
16.融合蛋白pull-down技术:
基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上(如Sepharose),当细胞抽提液经过该基质时,可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附,而没有被吸附的“杂质”则随洗脱液流出。
被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而回收下来。
17.染色体免疫沉淀技术Chromatinimmunoprecipitation(ChIp):
在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起,超声波将染色质打碎后,用所要研究的目的蛋白特异性的抗体沉淀这种交联复合体。
只有与目的蛋白结合的DNA片段才能够被沉淀下来
18.DNaseI足迹试验(DNaseIfootprintingassay):
DNaseI足迹试验是一种鉴别RNA聚合酶等蛋白质在DNA上结合位点的方法,蛋白质结合在DNA片段上,能保护结合部位不被DNase破坏,DNA分子经酶切作用后遗留下该片段(亦称“足迹”),进而可以确定它的序列。
在电泳凝胶的放射性自显影图片上,相应于蛋白质结合的部位没有放射性标记条带。
19.凝胶阻滞试验(DNA迁移率变动试验DNAmobilityshiftassay):
在凝胶电泳中,由于电场的作用,裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。
如果此时DNA分子与某种蛋白质结合,由于分子量增大,它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。
20.SELEX技术(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment,SELEX):
利用该技术可以从随机单链核酸序列库中筛选出特异性与靶物质高度亲和的核酸适体.
糖生物学的研究内容:
糖组学的研究远较基因组学、蛋白质组学复杂。
目前糖组学关注的焦点是糖蛋白,为了更好地与蛋白质组学相关联,将研究对象锁定为糖肽。
研究核心内容为:
①分析单物种生物所产生的所有聚糖;②以糖肽为研究对象确认编码糖蛋白的基因;③结合有效的理化和生化性质,研究糖蛋白糖链的性质。
主要分为三大部分:
结构糖组学、功能糖组学以及生物信息学,其中结构糖组学主要包括“糖捕获”技术、亲和层析技术等,功能糖组学主要包括微阵列技术等。
糖组学(glycomics):
是研究生物中所有糖类化合物的分子结构与生物功能的关系、糖类的生物合成与分解代谢规律、糖类工具酶的基因表达与调控机制以及糖脂、糖蛋白合成与组装机制等的一门学科。
糖基化(glycosylation)糖基化是在酶的控制下,蛋白质或脂质附加上糖类的过程。
此过程为四种共转译与后共转译修饰的步骤之一,发生于内质网。
蛋白质经过糖基化作用之后,可形成糖蛋白。
糖生物学研究的方法:
多糖的提取方法多糖的分离纯化多糖的分析与结构鉴定
1.
1.限制修饰系统(R-Msystem):
是一种存在于细菌(可能还有其他原核生物),可保护个体免于外来DNA(如噬菌体)侵入的系统,主要由限制内切酶和甲基化酶组成的二元系统。
Ps:
新合成的DNA为:
甲基化——半甲基化——甲基化
限制性内切酶:
(Restrictionendonucleases)生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。
同裂酶:
(isoschizomers)有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶子序列,这类酶称为同裂酶。
同裂酶产生同样的切割,形成同样的末端。
同尾酶:
(isocaudarner)这一类的限制酶来源各异,识别的靶字序列也不相同,但产生相同的粘性末端。
由同尾酶产生的DNA片段,是能够通过其粘性末端之间的互补作用彼此连接起来的。
总结:
限制性内切酶识别DNA分子的特定序列,并在两条链的切断。
限制性内切酶可以创建粘性末端,以帮助两个的DNA分子在体外形成的重组DNA。
2.
载体:
(vector)在基因工程重组DNA技术中将目的基因转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。
(外源DNA不具有复制原点,因此它不能复制,除非它被放置在具有复制起点的载体)
必备条件:
(1)含有复制起始位点,能够独立复制
(2)易于从宿主细胞分离
(3)有选择标记(如抗生素耐药性、蓝白筛选、插
入失活)
(4)有MCS
(5)安全
pBR322质粒载体(pBR322Plasmidvector):
具有两种抗生素抗性基因——氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。
(插入失活)
pUC质粒载体((pUCPlasmidvector):
这些质粒是基于pBR322的,从其中约40%的DNA,其中包括四环素抗性基因,已被删除。
感受态细胞(competentcell):
理化方法诱导细胞,使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。
(CaCl2法,电转法)
(插入失活原理:
如非重组的pBR322质粒DNA上的四环素和氨苄青霉素抗性基因都是正常的,表型为AprTcr。
带有这种质粒的受体菌可以在加有四环素和氨苄青霉素的双抗性平板上生长。
但是,如果在该质粒的四环素抗性基因内插入外援片段,就会造成四环素抗性基因失活,变成AprTcs,携带这种质粒的宿主菌可以在氨苄青霉素的平板上生长,而不能在四环素抗性平板上生长。
蓝白斑筛选法:
以β-半乳糖苷酶的产生作为颜色筛选标记的载体。
这类载体系统包括M13噬菌体、pUC质粒系统、pEGM质粒系统。
它们的共同特点是载体上携带一段细菌的lacZ基因,它编码β-半乳糖苷酶的一段146个氨基酸的α-肽,载体转化的受体菌为lacZΔM15基因型。
这样,载体同宿主通过互补,具有完整的β-半乳糖苷酶的活性。
如果在载体的lacZ基因中插入外源DNA,造成lacZ基因失活,不能合成α-肽,失去同宿主的互补,不能形成有功能的β-半乳糖苷酶,失去分解X-gal的能力。
在X-gal平板上,含阳性重组体的细菌为物色菌落(质粒载体)或无色噬菌斑(M13噬菌体载体);非重组体转化的细菌为蓝色菌落或蓝色噬菌斑。
)
噬菌粒载体(Phagemids):
噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。
它是包含了丝状噬菌体大间隔区域的质粒,是一种双链质粒,含噬菌体来源的复制子,在细菌的细胞中出现有辅助噬菌体的情况下,可被诱导成单链DNA噬菌粒,同时具有噬菌体和质粒的特征,可以像噬菌体或质粒一样复制。
它兼具丝状噬菌体与质粒载体的优点。
噬菌体载体(phagevectors):
噬菌体是一种能够将细菌DNA在细胞间转移的天然载体(噬菌体载体感染细胞效率远远高于质粒转化的细胞,所以用噬菌体载体克隆的产率通常较高。
)
M13噬菌体载体(M13phagevectors):
有LacZ’和MCS;此噬菌体的基因组是单链DNA,所以克隆入此载体的DNA片段可以在单链形式被回收;但感染的大肠杆菌细胞后,将DNA转化为双链复制形式,此双链复制的噬菌体DNA的形式被用于克隆。
λ噬菌体载体(λphagevectors):
两类λ噬菌体载体;一类是插入型载体,可将外来序列插中段;另一类是转换型载体,即可用外来DNA替代中段。
λ噬菌体载体构建基因文库
PS:
①溶菌性方式(lyticpathway):
在营养充足,条件适合细菌繁殖时,利用宿主菌中的酶类和原料,λDNA上基因可按调控的顺序表达合成构成噬菌体头、尾和尾丝所需的各种蛋白质,λDNA经多次复制合成许多子代λDNA,于是装配成许多子代的λ噬菌体,最后裂菌,释放出许多新的λ噬菌体。
②溶原性方式(lysogenicpathway):
进入细菌的λDNA可整合(integrate)入细菌的染色质DNA中,随细菌染色体DNA复制,传给细菌后代,这个稳定潜伏在细菌染色质DNA中的λDNA称为原噬菌体(prophage),含有原噬菌体的细菌称为溶源菌(lysogen)。
λDNA的整合是可逆的,原噬菌体可从宿主DNA中切出,进入溶菌性方式的繁殖。
柯斯质粒(Cosmids):
具有λ噬菌体和质粒载体的特性,是含有λ噬菌体的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。
柯斯质粒克隆大片段DNA
3.克隆基因的表达:
表达载体的两个要素:
(1)强启动子
(2)核糖体结合位点靠近起始密码子
诱导型表达载体:
在需要表达一个基因之前抑制该基因的表达是十分有利的。
一个原理在在细菌中大量表达真核蛋白对细菌具有毒害作用。
其次,即使这些蛋白没有毒性,他们积累到很高的水平,也会影响细菌的生长。
如果一个基因持续表达,也带该基因的细菌也不会大量表达,最终不能合成大量的蛋白产物。
解决的方法就是将克隆基因置于一个能够关闭的诱导型启动子下游以控制该基因的适时表达。
将待表达的基因置于T7噬菌体的启动子的调控之下,然后将该质粒导入一个携带严格控制T7RNA聚合酶基因的细胞。
产生融合蛋白的表达载体:
真核表达系统:
原因:
(1)大肠杆菌有时会认为真核基因编码的蛋白质为入侵者并摧毁他们。
(2)原核生物没有翻译后的修饰。
(3)产物可能会形成高度不溶的失活的微粒。
穿梭载体(Shuttlevector):
是指含有两个亲缘关系不同的复制子,能在两种不同的生物中复制的。
例如既能在原核生物中复制,又能在真核生物中复制的载体。
4.使用探针识别特定克隆
将平皿上的噬菌斑转移到硝化纤维过滤膜上,然后使用与目的基因互补的探针挑选目的基因。
第五章研究基因及其活性的分子生物学方法
5.1生物大分子的分离
5.1.1凝胶电泳(Gelelectrophoresis)
可用于分离不同种类的核酸或蛋白质。
DNA分子的磷酸集团使DNA带负电,在电流作用下向凝胶底部正极聚集。
结果是DNA分子在电流的作用下依据大小的不同而分离(不同大小DNA分子在溶剂和凝胶中受到的摩擦力大小不同):
大分子靠近凝胶顶部,小分子靠近底部。
再用荧光染料进行染色,在紫外灯下检测。
琼脂糖凝胶电泳(Agarosegelelectrophoresis)
脉冲场凝胶电泳(pulsed-fieldgetelectophoreis,PFGE)
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE)使用SDS,
(1)使所有多肽表面带负电荷,向阳极移动。
(2)屏蔽所有亚基本身所带电荷,所以它们的电泳迁移率只与分子质量大小有关,与本身所带电荷无关。
小分子易通过凝胶空隙,移动迅速。
不同大小的DNA、RNA和蛋白质可通过凝胶电泳技术得以分离。
核酸电泳中通常使用琼脂糖凝胶,蛋白质电泳中常使用聚丙烯酰胺凝胶。
5.1.2二维凝胶电泳(Two-dimensionalgelelectrophoresis)
第一步等电聚焦(isoelectricfocusing),样品通过凝胶,其中含有两性电解质,因而在凝胶两端间建立一个pH梯度。
带负电荷分子将向阳极移动,直至达到它的等电点(isoelectricpoint),停止移动。
第二步SDS-PAGE。
5.1.3离子交换柱层析(Ion-exchangechromatography)
用树脂分离带不同电荷数的物质。
带正电荷物质——阴离子交换色谱(如DEAE-Sephadex),带负电荷物质——阳离子交换色谱(如磷酸纤维素)。
最后用离子强度逐渐增加的溶液进行洗脱,(利用盐溶液中的阴离子与结合到树脂上的蛋白质竞争)
5.1.4凝胶柱层析(Gelfiltrationchromatography)
根据分子大小不同的一种分离方法。
小分子容易进入凝胶内部,所以通过层析柱慢;而大分子无法进入,所以通过的快。
5.2失踪标记法
可以检测到皮克级(pgor10-12gram)
5.2.1放射自显影(Autoradiography)
利用胶片的感光乳剂检测放射性核素物质的方法。
通过光密度计对放射自显影斑点进行扫描可进行准确定量。
5.2.2磷光成像(Phosphorimaging)
对物质的放射性活性定量比放射自显影技术更为精确。
放射性样品放于吸收β摄像的磷光成像屏上,成像屏上分支被β射线激发并保持激发态,激光扫描成像屏,被成像屏吸收的β射线能量被释放并被计算机探测器检测到,转化为图像。
5.2.3液体闪烁计数(LiquidScintillationCounting)
利用样品辐射的射线制造出可见光的光子,并被光电倍增管检测到。
(不可见射线→可见光)
5.2.4非放射性示踪标记(Non-radioactivetracers)
利用酶的倍增作用。
酶与用于检测目的分子的探针搭配使用,酶会制造出很多产物分子,因而放大了信号。
若酶的产物是化学发光物质,信号就再次被放大了。
5.3核酸杂交技术的应用(UsingNucleicAcidHybridization)
杂交:
一条核酸单链同另一条互补的碱基序列组成一条双链
5.3.1Southern印迹:
鉴定特异的DNA片段(SouthernBlots:
IdentifyingSpecificDNAFragments)
Southern印迹:
将DNA片段通过扩散作用从琼脂糖凝胶中转移到硝酸纤维素膜上,或直接把DNA点在膜上的过程。
首先用限制性内切酶对提取的基因组DNA进行酶切,最好使用EcoRⅠ或HindⅢ。
这些酶把基因组DNA切成上千个片段,对片段进行琼脂糖凝胶电泳,然后用碱性溶液处理DNA使其变性。
将单链DNA从凝胶中转移到硝酸纤维素膜上。
然后将膜与标记好的探针杂交并用标记示踪技术检测被标记上的条带。
5.3.2DNA指纹(DNAfingerprinting)与DNA分型(DNAtyping)
DNA指纹(DNAfingerprinting):
每个个体在碱基序列重复的模式上存在着差异。
事实上,两个重复模式完全一致的个体几乎是不存在的。
这意味着这些模式就想指纹一样,因此,被称为DNA指纹。
其实质就是Southern印迹。
DNA分型(DNAtyping):
用一组DNA探针检测个体的DNA不同位点,具有高度灵敏性。
Northern印迹(NorthernBlots):
检测基因活性
首先收集该生物的不同组织的样本,从中提取RNA,将RNA进行琼脂糖凝胶电泳,转移到合适的支撑物(载体)上(转膜)。
之后,将Northern印迹膜与cDNA探针杂交,产生条带。
条带的强度表明了其中含有的特定RNA相对量的多少。
原位杂交(situhybridization):
在染色体中的定位基因
原位杂交(situhybridization):
标记的基因同样可用来与染色体进行杂交,从而获知目标基因的定位以及在染色体上的位置,这一技术被称为原位杂交。
首先将细胞破碎,使染色体铺展,然后部分地使DNA变性从而制造出可与探针杂交的单链区域。
染色和杂交后,从染色结果可看出染色体的位置,而从杂交的结果可得出该基因定位于染色体上的位置。
5.3.4DNA测序(DNAsequencing)
两种精确测定DNA碱基序列的方法
1Sanger链终止法(TheSangerchain-terminationsequencingmethod)
引物延伸(合
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