干酪乳杆菌T1发酵方法及其热冲击研究.docx
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干酪乳杆菌T1发酵方法及其热冲击研究
干酪乳杆菌T1发酵方法及其热冲击研究
谢晨文,张兴利,刘筱雪,李晓,方帷,熊仁科,冯甦,张杰*
(1.四川大学生命科学学院,生物资源与生态环境教育部重点实验室,成都610065)
(2.四川龙蟒福生科技有限责任公司
项目基金号:
2015KJT0001-2014NC0016
摘要:
从青藏高原牧区的牦牛酸奶中分离出一株产细菌素的干酪乳杆菌T1(LactobacilluscaseiT1),作为添加剂加入食品中,能够抑制细菌的生长,具有食品防腐的作用。
从生产条件出发,探索其作为食品添加剂的最适发酵条件并进行5t发酵罐的扩大培养,以及针对菌粉制作过程常用喷雾干燥法进行的最适热冲击条件探索。
结果表明,L.caseiT1最适培养温度为32℃;控制pH5.5条件下发酵能有效促进菌体生长;按原培养基中碳源和氮源总含量的5﹪对培养基进行补料,发酵液OD600nm及活菌数也有较大提升;在5t发酵罐中扩大培养,活菌数达到8.3×109cfu·mL-1。
对提高L.caseiT1耐热性的热冲击研究结果显示,对照组L.caseiT1菌液不进行热冲击,直接置于60℃水浴锅中12min热致死,菌体存活率为0.01%,而按最适热冲击条件即52℃、30min条件下对L.caseiT1菌液热冲击后再置于60℃水浴锅中12min热致死,菌体存活率达到10%,表明合适的热冲击条件能有效解决乳酸菌在加工贮藏时成为技术瓶颈之一的活菌数稳定性问题。
关键词:
干酪乳杆菌;食品添加剂;发酵条件;热冲击
MethodoffermentationandthermalshockstudyofLactobacilluscaseiT1
Abstract:
AstrainofLactobacilluscaseiT1thatcanstablyproducebacteriocinwasisolatedfromtheTibetanPlateauyakyogurt.Asanadditiveintothefood,thereisacertainantibacterialandpreservative.WestudytheefficientpreparationtechnologyofhighactivityLactobacilluscasei.TheresultsshowedtheoptimalcultivationtemperatureofT1was32℃.pH5.5and5%mediumsupplementcaneffectivelypromotethegrowthofT1,andthenumberoflivebacteria-1received8.3×109cfu·mL-1whichwascultivatedin5tfermentationtank.ThethermalshockstudytoimprovethermalstabilityofT1showed:
compareingto0﹪ofsurvivalrateheatundertheconditionof60℃、12min,thermalshockundertheconditionof52℃、30min,thesurvivalrateundertheconditionof60℃、12minincreasedto10%,whichcaneffectivelysolvetheproblemoflivingbacteriumstabilityofLacticacidbacteriainprocessingandstoragewhichbecomesoneofthetechnicalbottleneck.
Keywords:
Lactobacilluscasei;foodadditives;FermentationConditions;thermalshock
近年来,由于消费者对食品中化学防腐剂的担忧,对安全无毒的乳酸菌细菌素作为食品保鲜及食品防腐剂的需求越来越大。
乳酸菌属于可食用的有益菌,在其生长代谢过程中,它可以产生有机酸、过氧化氢、二氧化碳、细菌素等多种天然抑菌物质,具有维持肠道内菌群平衡,提高机体免疫力,促进营养物质吸收等多种功能[1]。
尤其是乳酸菌产生的抑菌活性物质——细菌素,不仅可以改善肠道生态,海抑制多种致病菌的生长[2],能用于食品与饲料的防腐。
乳酸菌及其所产是目前公认的一类具有潜在开发能力的天然生物性食品防腐剂[3]。
据统计,过去十年发表的乳酸菌细菌素的文献中有29%与食品保鲜有关[4]。
Oliveira等[5]和Randazzo等[6]报告说,当粗提取物加入到莴苣样品中时,特别是与一些安全的处理方法结合时,有氧嗜温和嗜冷细菌得以减少。
DeSouzaBarbosa[7]使用曲霉杆菌产生的沙卡辛提取物,这种提取物跟单核细胞增多性李斯特菌在腊肠成熟期间接种,与对照组比较,熏蒸30天后成熟病原体减少2个指数级。
将乳酸菌制成食品添加剂常用的方法主要是冷冻干燥和喷雾干燥[8],尤其在食品工业中,与冷冻干燥相比,喷雾干燥具有设备简单、成本低等优点,适合益生菌大规模生产、运输和储存,是商业化制备益生菌产品普遍采用的方法,许多研究报道了喷雾干燥技术在制备益生菌产品中的应用[9]。
但喷雾干燥过程中,菌体会与高温空气充分接触,益生菌与高温空气充分接触,尽管时间短,但热力作用还是会导致菌体死亡,制备的干燥菌粉活菌数较低,因此耐热性成为了其成为功能食品产业的技术瓶颈[10]。
大量研究表明,乳杆菌受热激后,会通过自身的防御系统来调控相关基因的表达和代谢途径,产生一系列热激蛋白等分子以降低或消除高温胁迫的伤害即提高耐热性[11-15]。
罗璠[16]等从青藏高原牧区的牦牛酸奶中分离出一株产细菌素的干酪乳杆菌T1,相较于很多只能抑制革兰氏阳性菌的细菌素相比,干酪乳杆菌T1所产细菌素对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌都是抗菌活性,而且还能抑制黄曲霉素的生长;前期研究还表明,该细菌素有良好的热稳定性和pH稳定性,对蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶敏感,因此作为食品添加剂有较大的应用前景。
本研究主要目的是通过优化干酪乳杆菌T1发酵条件提升菌体生物量,并进行工业化发酵扩大培养,得到较高级数的菌体积累量和活菌数,以及通过找到合适热冲击条件提高菌体在喷雾干燥过程中的存活率,探索该菌作为食品添加剂在工业生产上的可能性,为该菌的商业化应用奠定基础,同时为其他益生菌制成制剂提供技术参考。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验菌株
供试菌株:
干酪乳杆菌T1菌种(L.caseiT1),分离筛选自青藏高原牦牛酸奶[16]。
1.1.2主要试剂
改良MRS培养基(g/L):
蛋白胨12.0g、酵母粉6g、牛肉膏6g、葡萄糖18g、乙酸钠5g、柠檬酸铵2.15g、吐温801mL、MgSO4·H2O0.58g、K2HPO42g、MnSO4·7H2O0.05g、琼脂15.0g(液体培养基不加)。
1.1.3主要仪器
分析天平JA1003(上海天平仪器厂);高压蒸汽灭菌锅YX-400A(上海三甲医疗器械厂);50L发酵罐09-50A-01(上海国强生化工程装备有限公司);5t发酵罐2000059(江苏省锡山市雪浪铆焊厂)。
1.2方法
1.2.1最适培养温度
在28℃~37℃之间设置5个温度梯度,分别为28、30、32、34、37℃。
将活化后的L.caseiT1菌株按1%(v/v)比例分别接入装有20mL改良后的MRS液体培养基的50mL锥形瓶中,分别在对应培养温度的培养箱中静置培养24h。
然后通过测定OD600nm值测定及活菌数比较不同培养温度下L.caseiT1菌株的生长情况,得出最适培养温度。
测定L.caseiT1发酵液活菌数时,将样品稀释至合适倍数后,取0.1mL稀释后的菌液涂布于装有改良后MRS的固体培养基平板上,然后37℃条件下在培养箱中培养24h,计算得出不同培养温度下各锥形瓶中L.caseiT1活菌数。
1.2.2pH对菌体生长影响及其生长曲线
在最适培养温度条件下探究四种不同pH条件下对L.caseiT1生长情况的影响,并得出L.caseiT1生长曲线。
由于锥形瓶中不方便进行发酵液pH的控制以及监测,本实验在配有pH控制系统及监测系统的50L发酵罐中进行。
乳酸菌在发酵过程中产酸使得pH值降低,实验选取四种pH条件发酵L.caseiT1对比生长情况:
将pH值控制在4.5、5.5、6.5及pH自然。
将活化后的L.caseiT1菌株按1%(v/v)比例分别接入四个装有30L改良MRS发酵液的50L发酵罐中,发酵罐A在发酵过程中pH处于自然条件下;发酵罐B中,当pH值低于4.5时通入氨水将pH控制在4.5;发酵罐C中,当pH值低于5.5时通入氨水将pH控制在5.5;发酵罐D中,当pH值低于6.5时通入氨水将pH控制在6.5。
32℃、100r/min条件下发酵,发酵起始后,每隔2h取样测定其600nm下OD值,得出生长曲线;并在4h、10h及16h时取样通过稀释涂布平板法测定活菌数。
1.2.3补料对菌体发酵的影响
在50L发酵罐中研究不同碳源以及氮源的补加量对L.caseiT1菌体生长、积累的影响。
在32℃、100r/min,pH5.5条件下发酵L.caseiT1。
参考高书锋[17]在菌体生长至对数生长期(4h时)进行补料,设计补料量分别为培养基中碳源和氮源总含量的0%(不补料)、2.5%、5%以及7.5%,一次性补加。
发酵至16h时,分别取样,测定OD600nm值并用稀释涂布平板法测定活菌数。
1.2.45t发酵罐扩大培养
为实现大规模、高效率生产,将优化后的发酵条件应用于5t发酵罐进行扩大培养。
保藏于甘油管中的L.caseiT1菌株按1%(v/v)比例接入试管中,在32℃、100r/min条件下置于摇床中活化12h,之后按1%(v/v)比例接入锥形瓶中32℃条件下静置于培养箱中培养。
在对数生长中期(10h)按5%(v/v)接种量经由50L发酵罐至5t发酵罐中进行发酵,各发酵罐皆在32℃、100r/min、pH5.5条件下发酵,并且5t发酵罐在发酵至对数生长期即4h时按原发酵液总碳源及氮源的5%补加葡萄糖以及蛋白胨,16h时取样测5t发酵罐中L.caseiT1活菌数。
1.2.5热冲击条件研究
针对发酵后续作为饲料添加剂的喷雾干燥,探究最适热冲击条件以提高菌体存活率。
选取50、55、60、65℃温度梯度,将锥形瓶中L.caseiT1发酵液水浴处理12min,选取致死率99%以上条件作为热致死条件。
然后从热冲击温度及热冲击时间两方面探究最适热冲击条件。
在最适温度条件下在锥形瓶中培养L.caseiT1至对数中期,分别取6mL菌液至5只灭菌后的试管中,编号1~5。
将1~4号4只试管分别在46、49、52、55℃水浴锅中水浴加热30min,5号试管继续在32℃培养箱中培养,不进行热冲击,作为对照组。
然后将1~5号5只试管放在32℃培养箱中培养1h,之后取出5只试管放入之前选取的热致死条件:
60℃水浴锅中热致死12min。
然后菌液稀释涂布于装有改良MRS固体培养基的平板中,24h后计算活菌数,通过比较得出最适热激温度。
最适温度培养L.caseiT1至对数生长中期后各取6mL至3只试管在最适热激温度下分别热冲击20、30及40min,放入32℃培养箱中培养1h后60℃热致死12min,然后稀释涂布平板,24h后计算活菌数,得出最适热冲击时间。
2结果与分析
2.1最适培养温度
结果表明,干酪乳杆菌T1在28℃~37℃下均有良好的生长,5个温度梯度中,OD600nm分别为0.603、0.615、0.652、0.571、0.545,32℃培养温度下L.caseiT1菌液OD600nm显著高于其他4个培养温度下的OD600nm值,表明L.caseiT1最适培养温度为32℃(如图1)
图1OD值-温度趋势
Figure1TendencyofODvalue-temperature
2.2生长曲线及pH对菌体生长影响
四种pH条件下发酵L.caseiT1的pH值变化见图2。
起始pH大致相同,分别为5.58、5.52、5.46以及5.55。
发酵罐ApH自然,由于菌体繁殖产酸,使得pH下降幅度很大,至发酵结束,发酵罐A中pH值大致在4.1;发酵罐B在12h时随着发酵产酸pH值到达4.5,随后通入氨水,pH值稳定在4.5;发酵罐C及发酵罐D因为0h时pH低于5.5及6.5,通过通入氨水分别将pH控制在5.5及6.5。
L.caseiT1的生长曲线见图3。
四种pH条件下菌株在经过较短的延滞期后,约从4h开始进入对数生长期,此时菌体活性最强,迅速生长;在16h左右达到生长高峰进入稳定期;24h左右开始进入衰亡期,在控制pH为5.5的发酵罐C中,约20h时进入衰亡期。
pH5.5的发酵罐C中,8h时菌体OD600nm值开始超过其他几种pH条件下的OD600nm。
在4h、10h以及16h时,各发酵罐中L.caseiT1活菌数见图4。
在对数生长中期的10h时以及对数生长末期的16h时,pH控制在5.5的发酵罐C的活菌数分别为3.1×109cfu·mL-1,以及5.3×109cfu·mL-1,远超其他几种pH条件下的活菌数。
pH5.5为L.caseiT1最适发酵pH。
图2pH变化
Figure2changeofpH
图3生长曲线
Figure3Cruveofgrowth
表1活菌数变化
Table1Numberoflivingbacteriachange
时间/h
pH自然
pH4.5
pH5.5
pH6.5
4
0.28
0.29
0.31
0.31
10
2.03
2.21
3.1
1.806
16
3.6
3.8
5.3
3.1
2.3补料对菌体发酵的影响
四种补料量对菌体OD600nm的影响见表2。
补料量5.0﹪的发酵罐16h后OD600nm及活菌数都是最大,分别为0.67(OD600nm)以及7.7×109cfu·mL-1,(活菌数);补料量继续增加至7.5﹪,菌体生长情况没有提高,反而有所下降;相比于0﹪(不补料)补料量,5.0﹪补料量OD600nm提高28.8﹪,活菌数提高42.6﹪,5﹪为最优补料量。
表2补料量对菌体OD600nm及活菌数的影响
Table2ChangofODvalueandNumberoflivingbacteriachangebymediumsupplement
补料量
OD值/OD600nm
活菌数/109(cfu·mL-1)
0﹪(不补料)
0.52
5.4
2.5﹪
0.55
6.3
5.0﹪
0.67
7.7
7.5﹪
0.51
5.2
2.45t发酵罐扩大培养
在5t发酵罐中发酵L.caseiT1菌体,16h测得活菌数为8.3×109cfu·mL-1,得较理想的活菌数,成功扩大培养L.caseiT1,表明L.caseiT1可用于工业级的大型发酵。
2.5热冲击条件研究
分别在50、55、60、65℃温度条件下,水浴处理12min,致死率分别为52.3%、86.7%、99.9%、100%,所以选取60℃、12min作为热致死条件。
对比不同热冲击温度46、49、52、55℃以及不热冲击后的热致死存活率见图4。
存活率分别为0.5%、0.4%、10%、0.3%与0.01%。
可以得出52℃为最适热冲击温度,对比不热冲击、直接热致死的0.01%存活率,存活率提升了1000倍,对比46、49、55℃热冲击温度后的热致死存活率,也有很明显的提升,说明52℃为最适热冲击温度,并且在此热冲击温度下热冲击,能很大的提高菌体的耐热性;46、49与55℃热冲击后菌体存活率虽然不如52℃热冲击高,但相较于不进行热冲击的5号试管0.01%的存活率仍有很大的提升。
对比热冲击时间:
分别在52℃水浴锅中热冲击20、30以及40min后,60℃、12min水浴锅加热热致死,再用稀释涂布平板法测定活菌数,分别为0.93×109、1.04×109与0.96×109cfu·mL-1,即30min热冲击时间更佳。
所以L.caseiT1最适热冲击条件为52℃、30min水浴加热,并且能很大程度的提高L.caseiT1的耐热性,能在一定程度上解决喷雾干燥中菌体存活率问题。
图4热冲击温度-存活率
Figure4Temperatureofthermalshock-survivalrate
3讨论与结论
20世纪初期,对乳酸菌细产的细菌素在食品方面的应用就开始受到广泛的关注,加上国际市场上关于食品和医疗产品的新政策和法规,改变了世界行业的前景。
对于符合高质量标准和安全性的天然产品的需求不断增长,特别是在“干净且安全”技术的卫生和食品中,例如在食品中使用天然防腐剂[17]。
乳酸菌细菌素作为食品防腐剂是研究最多的领域,添加方式可以是原位加入(例如通过添加产细菌素的细菌),也可以是以外源制剂的非原位形式[18](例如加入纯化的或半纯化的细菌素)。
例如,一些乳酸菌细菌素的添加已经在新鲜蔬菜和肉类中进行了实验,可用作食品添加剂(十年来的应用)。
从青藏高原地区传统发酵酸牦牛奶中分离筛选出产光谱抗菌性细菌素的L.caseiT1,作为食品添加剂能明显抑制细菌的污染,因此具有较大的作为食品防腐剂的开发潜力。
并且国内外现阶段对干酪乳杆菌扩大培养多见于50mL或5L摇瓶中,本实验从培养温度、pH、补料量等方面对发酵条件进行优化,同时成功进行了工业级的5t扩大培养,得到8.3×109cfu·mL-1活菌数,表明该菌能够在工业上大规模发酵;并针对现在乳酸菌制成菌粉在工业上常用的喷雾干燥对L.caseiT1进行了热激研究,52℃热冲击30min后菌体存活率也能达到10%,能够保证该菌制作成菌粉的活菌数,为将来该菌进一步应用到食品防腐剂奠定基础。
pH与生长曲线方面,发酵罐A在发酵6h~16h时段,为对数生长期,而其pH值下降最快也在6h~16h时段,说明菌体在6h~16h大量繁殖,并且产酸能力在此期间较强;而发酵罐C在24h后OD600nm值急速下降,分析原因可能是培养基养料不足导致;5%补料量使菌体OD600nm及活菌数达到最大,其次是2.5%补料量,而继续增加补料量达到7.5%,OD600nm及活菌数与0%(不补料)补料量大致相当,说明碳源及氮源的过量补充并不能提升菌体生长情况。
食品添加制剂在加工及贮藏等过程中如喷雾干燥制成菌粉时,易受外界不良环境如高温的影响,导致质量不稳定,活菌数下降,进而影响抑菌效果。
大量研究表明,适当的热冲击会诱导热激蛋白的产生,有助于干酪乳杆菌等菌体的耐热性[15]。
本实验研究了不同热冲击温度、热冲击时间对L.caseiT1耐热性的影响,并且由于热冲击后菌体表达热激蛋白需要一定的时间,本实验选择热冲击1h后再对菌体进行热致死实验。
实验前对发酵后没有热冲击的L.caseiT1进行60℃、12min热致死实验,发现L.caseiT1几乎没有活菌存活。
相同条件下的46、49及55℃热冲击后再进行60℃、12min热致死的活菌数存活率仅为0.5%、0.4%及0.3%,虽然较对照组存活率有所提升,但比较52℃的热冲击温度下的存活率为10%,存活率差别很大,说明L.caseiT1在较小的温度区间内热激蛋白才能充分表达,从而提高耐热性,即52℃、30min热冲击、然后在原培养温度(32℃)下静置1h后能有效提高L.caseiT1的耐热性,能较大的提高喷雾干燥高温条件的L.caseiT1菌体存活率,能有效解决乳酸菌细菌素在加工贮藏中活菌数稳定性的问题。
本研究对L.caseiT1生长特性进行了一定程度的研究,成功的进行较优质的扩大培养,并针对于加工过程中尤其是喷雾干燥的高温条件,探究了有利的热冲击条件,为以后L.caseiT1作为食品添加剂的工业生产及制备方面的应用提供了重要参考。
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