微生物产生的免疫抑制活性化合物S9818的研究Ⅰ 菌株的分类鉴定.docx
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微生物产生的免疫抑制活性化合物S9818的研究Ⅰ菌株的分类鉴定
微生物产生的免疫抑制活性化合物S-9818的研究Ⅰ.菌株的分类鉴定
中国抗生素杂志2000年第2期第25卷论著
作者:
田敏 张新宜 刘瑜 俞朵 吕淑君 李建明
单位:
田敏 张新宜 刘瑜 俞朵 吕淑君(四川抗菌素工业研究所,成都 610051);李建明(长征制药股份有限公司,四川乐山614006)
关键词:
他克莫司(FK506);千佛链霉菌新种;菌种分类
摘 要 从我国山东省济南市郊外千佛山土壤中分离到一株放线菌,编号SIIA-9818,气生菌丝灰白色或白色,基内菌丝分枝、无横隔、不断裂。
在大部分培养基上基丝为白色,不产可溶性色素,分生孢子丝直型,波曲或钩状,孢子椭圆型或圆柱形,孢子表面光滑,绝大部分碳源不能利用,生长温度偏低,细胞壁化学组份分析含L,L-二氨基庚二酸和甘氨酸,产生新型免疫抑制剂他克莫司(tacrolimus,FK506)。
根据分类研究,菌株SIIA-9818归属于链霉菌属,与已知近似菌株比较存在明显差异,定名为千佛链霉菌新种SIIA-9818(Streptomycesqianfoensissp.nov.SIIA-9818)。
TaxonomicstudyontheS-9818producingstrainSIIA-9818
TianMin, ZhangXinyi, LiuYu,YuDuo, LuShujun and LiJianming
(SichuanIndustrialInstituteofAntibiotics, Chengdu610051)
ABSTRACT StrainSIIA-9818wasisolatedfromsoilsamplescollectedintheQianfoMountainatJinan,Shandongprovince,China.Itformsstraight,flexibleorhookchainsofsporeswithgreyishwhiteorwhitecolored.Smooth-surfacedsporeswereovalorcylindrical.Itcannotusemanykindsofcarbohydrate.Temperaturerangeforgrowthislow.ChemicalcompositionofcellwallcontainsL,L-DAPandglycine.ThestrainproducesimmunosuppressantcompoundFK506.Basedontheresultsofmorphological,physiologicalandchemotaxonomiccharacteristicstudies,strainSIIA-9818wasplacedinthegenusStreptomycesandidentifiedasanewspeciesofStreptomyces,proposedthenameStreptomycesqianfoensissp.nov.
KEYWORDS FK506; Streptomycesqianfoensissp.nov.; Taxonomy
他克莫司(tacrolimus,FK506)是1984年由日本藤泽制药公司的研究人员以淋巴细胞IL-2(白细胞介素-2)的产生为靶位筛选到的与环孢素(CsA)具相似免疫作用机理的微生物产物,该新型免疫抑制剂抑制各种免疫反应的活性较CsA强10~100倍。
1993年以商品名Prograf在日本上市,并于1994年获FDA批准在美国用于肝脏移植。
在以粘附分子LFA-1(淋巴细胞功能相关抗原-1)及其配体ICAM-1(细胞间粘附分子-1)的结合抑制为靶位,从微生物次级代谢产物中寻找免疫抑制剂的筛选***过程中,我们从山东省济南市郊外千佛山的土壤中分离到一株放线菌,编号SIIA-9818。
该菌次级代谢产物S-9818经结构论证,证明与FK506同质。
结构鉴定结果另文报道。
本文报道活性化合物S-9818产生菌SIIA-9818的分类鉴定结果。
1 材料和方法
1.1 菌株来源
从我国山东省济南市郊外千佛山土壤中分离获得,编号SIIA-9818。
1.2 形态观察
在燕麦汁琼脂(ISP3)培养基平板上划线涂菌并插入盖玻片,28℃培养7~30d,用光学显微镜和扫描电子显微镜观察菌丝,孢子丝及分生孢子的形态特征。
1.3 培养特征
主要采用国际链霉菌计划(ISP)和Waksman所推荐的培养基[1],28℃培养7~30d,观察其培养特征并进行描述。
1.4 生理生化反应
采用国际链霉菌计划(ISP)推荐的方法,碳源利用实验以ISP9为基础培养基,28℃培养3~30d,观察并记录结果。
1.5 细胞壁化学组份分析
参照Lechevalier等推荐的方法进行[2]。
2 结果
2.1 形态特征
SIIA-9818菌株在ISP2、ISP3、ISP4及ISP7培养基上培养7~14d,生长丰茂,基丝分枝,无横隔,不断裂,直径:
0.8~1.0μm,分生孢子丝直型,波曲或钩状,孢子椭圆形或圆柱形,0.6~0.9×0.9~1.3μm,孢子表面光滑(图1、2)。
2.2 培养特征
SIIA-9818菌株在酵母麦芽浸汁琼脂培养基上生长丰富,孢子灰白色,基丝棕色,产棕色可溶性色素,该菌在其它各种培养基上的培养特征见表1。
2.3 生理生化特征
SIIA-9818菌株在蛋白胨-明胶培养基上能液化明胶,牛奶胨化不凝固,淀粉水解阴性,不利用纤维素,硝酸盐还原阴性,不产生类黑色素和H2S。
碳源利用情况:
仅利用水杨苷和卫茅醇,微弱利用D(+)甘露糖,不利用葡萄糖、蔗糖、棉子糖、D-果糖、甘露醇,D-半乳糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、L-鼠李糖、肌醇和乳糖。
适应于低温生长,10~28℃生长丰茂,高于37℃不生长。
图1 SIIA-9818菌株孢子丝(×3500)
图2 SIIA-9818菌株孢子(×10500)
表1 SIIA-9818菌株的培养特征
培养基 生长情况孢子丝基内菌丝可溶性色素 酵母麦芽浸汁琼脂丰茂 灰白色棕色棕色 (ISP2) 燕麦汁琼脂(ISP3)丰茂 灰白色白色棕色 无机盐淀粉琼脂丰茂 灰白色白色无 (ISP4) 甘油-天门冬素琼脂贫乏 白色 白色无 (ISP5) 蛋白胨-酵母膏琼脂贫乏 无 无色无 (ISP6) 酪氨酸琼脂(ISP7)中度 灰白色棕色浅棕色 查氏蔗糖琼脂中度 白色 白色无 查氏葡萄糖琼脂中度 灰白色白色无 天冬素葡萄糖琼脂中度 白色 白色无 高氏1号琼脂贫乏 白色 白色无 营养琼脂贫乏 无 白色无 苹果酸钙琼脂不生长 2.4 细胞壁化学组份
SIIA-9818菌株细胞壁含L,L-二氨基庚二酸(L,L-DAP)和甘氨酸。
3 菌种鉴定
菌种SIIA-9818其细胞壁组分含L,L-DAP和甘氨酸,结合其形态特征,证明该菌株应归属于链霉菌属[3],将该菌株与已知近似的链霉菌及已知的FK506产生菌比较,结果见表2、3。
比较结果可看出菌株SIIA-9818与各近似菌株相比均存在不同程度的差异。
谷氏链霉菌S.gougerotii[4]孢子梭状、在ISP2、ISP3、ISP4培养基上气丝生长少,在ISP2、ISP3培养基上不产可溶性色素,而SIIA-9818菌在ISP2、ISP3、ISP4培养基上生长非常丰茂,在ISP2和ISP3培养基上可产生棕色可溶性色素。
S.gougerotii菌株可利用D-木糖、葡萄糖、甘露醇、D-果糖作为生长碳源,而SIIA-9818菌株对以上各碳源均不能利用。
与另一近似菌白直丝链霉菌S.alborectus[5]相比,它们孢子丝均为直型或柔曲状,孢子椭圆至柱形,孢子表面光滑,在ISP2、ISP3、ISP4培养基上生长丰茂,ISP5培养基上生长贫乏,在大部分培养基上基丝白色或淡黄色,可溶性色素无或很少,淡黄,但S.alborectus菌株在ISP3培养基上不产可溶性色素,而SIIA9818菌株产棕色色素。
S.alborectus菌株可利用葡萄糖、D-果糖和D-半乳糖,在ISP1培养基上有黑色素产生,有水解淀粉和还原硝酸盐的能力,而SIIA-9818菌却与之相反,两者的代谢产物也不相同,SIIA-9818菌株产FK506,S.alborectus菌株的代谢产物为维吉霉素。
SIIA-9818菌株与其他已知的FK506及其结构类似物FK520,FK523的产生菌相比,相似性也很小,FK520和FK523的产生菌为吸水链霉菌[6],FK506的另一产生菌S.tsukubaensis(筑波链霉菌)[7]与SIIA-9818菌在形态特征上极为相似,在生理生化及碳源利用方面几乎完全相同,但S.tsukubaensis菌在各培养基上基内菌丝颜色为淡粉红至红橙黄,淡棕色,而SIIA-9818菌除在ISP2和ISP7培养基上基丝为棕色外,在其他培养基上基丝均为白色或无色。
其属水平相关性DNA-DNA同源性研究结果也显示菌株SIIA-9818不属于吸水链霉菌,也不属于筑波链霉菌。
由此,我们认为菌株SIIA-9818为链霉菌属中的一个新种,建议定名为Streptomycesqianfoensissp.nov.(千佛链霉菌新种)。
该菌株保藏于国家菌种保藏委员会抗生素菌种保藏中心。
表2 SIIA-9818菌与已知近似菌种形态及培养特征比较
SIIA-9818S.gougerotii
(谷氏链霉菌)S.alborectus
(白直丝链霉菌)S.tsukubaensis
(筑波链霉菌)形态特征孢子丝直,波曲或钩状,孢子椭圆形或圆柱形,孢子孢子丝直型,孢子梭状,孢子表面光滑,基丝有时断裂。
孢子丝直,柔曲,孢子椭圆形至长圆形,孢子表面光滑。
孢子丝直,柔曲孢子长椭圆形或圆柱形,孢子表面光滑。
表面光滑。
培养特征 ISP2Am:
丰茂,灰白色Am:
少,白或淡黄Am:
丰茂,绒状,浅褐灰色Am:
中度,淡灰色 Sm:
棕色Sm:
无色至灰黄色Sm:
薄,无色至黄褐色Sm:
暗红橙黄色 Sb:
棕色Sb:
无Sb:
淡黄褐色Sb:
暗红橙黄色 ISP3Am:
丰茂,灰白色Am:
少,白或淡黄Am:
丰茂,粉状白色Am:
中度,灰色 Sm:
白色Sm:
无色至灰黄色Sm:
薄,无色至淡黄色Sm:
淡粉红 Sb:
棕色Sb:
无Sb:
无Sb:
无 ISP4Am:
丰茂,灰白色Am:
少,白或淡黄Am:
丰茂,白色Am:
中度,淡黄桔至浅灰色 Sm:
白色Sm:
无色至灰黄色Sm:
黄灰色Sm:
深橙黄色 Sb:
无Sb:
无Sb:
很少,淡黄Sb:
无 ISP5Am:
贫乏、白色Am:
少,白或淡黄Am:
贫乏、白色Am:
中度,淡粉红至白色 Sm:
白色Sm:
无色至灰黄色Sm:
淡黄色Sm:
淡粉红 Sb:
无Sb:
无Sb:
很少,淡黄Sb:
无 查氏蔗糖琼脂Am:
中度,白色 Am:
中度、白色Am:
贫乏 Sm:
白色 Sm:
无色Sm:
淡粉红 Sb:
无 Sb:
无Sb:
无 天冬素葡萄糖Am:
中度,白色Am:
薄,白色Am:
丰茂,白色Am:
贫乏,白色 琼脂Sm:
白色Sm:
无色至微黄色Sm:
无色至淡黄Sm:
淡棕色 Sb:
无Sb:
无Sb:
很少,淡黄Sb:
无表3 SIIA-9818菌株与已知近似菌种生理生化及碳源利用比较
菌种名称 SIIA-9818S.gougerotii
(谷氏链霉菌)S.alborectus
(白直丝链霉菌)S.tsukubaensis
(筑波链霉菌)碳源利用 L-阿拉伯糖-±-- D-木糖-+±- 葡萄糖-++± 蔗糖---± 肌醇-±-- L-鼠李糖-±-- 棉子糖---- 甘露醇-+-- D-果糖-++- D-半乳糖- +-生理生化特性 ISP1--+- 明胶液化++++ 牛奶凝固---- 牛奶胨化++(快)++ 淀粉水解-++- 硝酸盐还源--+- 生长温度10~28℃生长丰茂,
高于37℃不生长 5~37℃生长18~35℃生长,
28℃为最适生长温度 代谢产物FK506kabicidinvirginiamycinFK506 (卡比杀菌素)(维吉霉素) -:
不利用; +:
利用; ±:
利用可疑。
致谢:
本菌种鉴定工作得到四川抗菌素工业研究所胡润茂研究员的指导,特此深表感谢!
该模型的建立及样品筛选为国家新药研究基金资助项目,文号:
97Q04。
田敏,女,生于1965年,学士,副研究员。
参考文献
1,ShirlingEB,GottliebD.Methodsforcharacterizationofstreptomycesspecies.IntSystBacteriol,1966;16:
313
2,MaryP,LechevalierH.Biologyoftheactinomycesandrelatedorganism.BiolActinomycetes,1976;11:
78
3,阎逊初.放线菌的分类和鉴定.北京:
科学出版社,1992:
60
4,阎逊初.放线菌的分类和鉴定.北京:
科学出版社,1992:
560
5,OgataK,MatsuuraM,IrieH,etal.AnewspeciesofStreptomycesproducingVirginiamycinfamilyantibiotics.JAntibiot,1978;31:
1313
6,HatanakaH,IwamiM,KinoT,etal.FR-900520andFR-900523,novelimmunosuppressantsisolatedfromaStreptomyces.JAntibiot,1988;41:
1586
7,OkuharaM,TanakaH,GotoT,etal.Tricyclocompounds,aprocessfortheirproductionandapharmaceuticalcompositioncontainingthesame.USPatent4894366,1990
1999年7月12日收稿
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