酸性纤维素酶对红茶菌产膜量的影响周鹏宇.docx
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酸性纤维素酶对红茶菌产膜量的影响周鹏宇
本科生毕业论文(设计)
题目:
酸性纤维素酶对红茶菌产膜量的影响
姓名:
周鹏宇
学院:
食品药品学院
专业:
食品质量与安全
班级:
061
学号:
2006674131
指导教师:
孙永康职称:
讲师
2010年6月8日
安徽科技学院教务处制
目录
摘要………………………………………………………………………………………1
关键词……………………………………………………………………………1
前言………………………………………………………………………………1
1材料与方法…………………………………………………………………………1
1.1材料………………………………………………………………………………2
1.1.1原料……………………………………………………………………………2
1.1.2试剂……………………………………………………………………………2
1.1.3仪器与设备……………………………………………………………………2
1.2方法………………………………………………………………………………2
1.2.1技术路线…………………………………………………………………………2
1.2.2操作要点…………………………………………………………………………2
1.3检测方法………………………………………………………………………3
1.3.1葡萄糖标准浓度曲线绘制………………………………………………………3
1.3.2酸性纤维素酶活力的测定………………………………………………………3
1.3.3纤维素膜重的称量………………………………………………………………4
2结果与分析……………………………………………………………………5
2.1酸性纤维素酶不同加入时间对红茶菌产模量的影…………………………………5
2.2不同浓度的纤维素酶对红茶菌产模量的影…………………………………………5
2.3红茶菌不同接种量对红茶菌产膜量的影响………………………………………5
2.4不同培养基加入量对红茶菌产膜量的影响…………………………………………5
2.5初始pH的不同对红茶菌产膜量的影……………………………………………6
2.6不同温度对红茶菌产膜量的影响…………………………………………………6
2.7酸性纤维素酶对红茶菌产膜量影响因素的优选…………………………………6
3讨论…………………………………………………………………………7
3.1酸性纤维素酶加入时间确定…………………………………………………8
3.2纤维素酶浓度的确定…………………………………………………………8
3.3红茶菌接种量的确定…………………………………………………………8
3.4培养基加入量的确定…………………………………………………………8
3.5初始pH的确定…………………………………………………………………8
3.6发酵液温度的确定…………………………………………………………………9
4结论………………………………………………………………………9
致谢…………………………………………………………………………………9
参考文献……………………………………………………………………………10
酸性纤维素酶对红茶菌产膜量的影响
食品质量与安全:
周鹏宇
指导老师:
孙永康
摘要:
本文对酸性纤维素酶在不同条件下对红茶菌产膜量的影响进行了研究。
通过单因素实验和正交实验对红茶菌发酵过程中加入酸性纤维素酶的各种发酵参数进行优化选择。
实验结果表明在46℃、初始pH5.0、0.12%酸性纤维素酶、红茶菌10%、培养基加入量60%的条件下纤维素酶对红茶菌产膜情况影响效果最好,可有效的抑制纤维素膜的产生。
关键词:
红茶菌,酸性纤维素酶,产膜量,发酵,影响
前言
红茶菌是一种有着悠久历史的传统功能性饮料。
具有多种保健作用,也是一种很有利用价值的天然微生物发酵产品。
茶菌中有益的微生物主要由乳酸菌,酵母菌,醋酸菌组成[1],通过其的特殊作用,将糖、茶等原料经过生物技术发酵工艺转化为极其丰富的营养物质(如葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、D-葡萄糖二酸-1,4内酯、乳酸、醋酸、维生素、多糖、蛋白等),使糖茶水成为一种甘甜可口的饮料[2]。
其功能主要体现在清理肠胃、消除疲劳、增强食欲、帮助消化、防治高血压和动脉硬化、预防和治疗糖尿病、以及防癌抗癌以及增强机体免疫力等[3]。
据专家预测,21世纪的饮料市场将是茶饮料的世界。
中国是世界茶叶的发源地,也是世界上最大的茶叶生产国。
尽管我国茶饮料工业起步较晚,但发展势头十分强劲。
基于红茶菌的保健作用,人们对各种红茶菌饮料的开发研究产生了格外的兴趣。
同时红茶菌发酵产物中的细菌纤维素在食品、造纸、医疗等有着广泛的应用,国内外学者对如何提高细菌纤维素产量也作了相应的研究[4]。
在对红茶菌饮料的开发生产时,在发酵过程中产生的细菌纤维素膜一直是阻碍各生产企业对其的品质提升以及扩大再生产的重要因素[5]。
解决这一问题就显得十分重要,然而对于红茶菌饮料发酵过程中所产生的细菌纤维素膜的解决的研究确寥寥无几。
因此对红茶菌发酵时产生的细菌纤维素膜的防治的研究具有重要的经济意义。
本文根据细菌纤维素膜的成分特点,在红茶菌发酵时加入酸性纤维素酶,并且在不同条件下研究酸性纤维素酶对红茶菌产膜量的影响。
通过实验找出最佳工艺参数为解决红茶菌饮料生产时的产膜问题提供参考。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1原料
红茶菌:
安徽科技学院食品微生物实验室保藏;
红茶:
市售;
白砂糖:
市售食品级。
1.1.2试剂
柠檬酸、柠檬酸钠、酒石酸钾纳、无水硫酸钠、苯酚、3,5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、羧甲基纤维素钠、葡萄糖,以上均是分析纯试剂。
酸性纤维素酶-湖南利尔康生物有限公司。
1.1.3仪器与设备
FA2104电子天平:
上海精密科学仪器有限公司;
YP3001N电子天平:
上海精密科学仪器有限公司;
HH-B11电热恒温培养箱:
上海跃进医疗器械厂;
LS-B50L立式压力蒸汽灭菌器:
上海华线医用核子仪器有限公司;
SD-28加热水浴锅:
上海精宏实验设备有限公司;
GZX-9076MBE数显干燥箱:
上海博讯事业有限公司医疗设备厂。
1.2方法
1.2.1技术路线
酸性纤维素酶
↓
红茶糖水的配制→红茶菌的扩培→接种发酵→过滤→称重
1.2.2操作要点
1.2.2.1红茶糖水的配制
以茶叶,蔗糖,蒸馏水质量比为1:
20:
500的比例,将其加热煮沸,然后过滤至棕色瓶中(用8层纱布封口)灭菌后备用。
1.2.2.2红茶菌的扩培
取4.0g茶叶,320g蔗糖,蒸馏水2000mL,在一起加热煮沸,然后滤去茶叶并将茶糖水移至棕色瓶中(用8层纱布封口),最后放入高压杀菌锅中灭菌15min。
取出灭菌过的培养基,在无菌操作台中将红茶菌小心接种在棕色瓶中。
将接种过的红茶菌培养基放入37℃的恒温箱发酵培养7天。
1.2.2.3酸性纤维素酶的加入时间对红茶菌产膜量的影响
以红茶菌接种量20%,培养基量为总体积的70%,发酵温度37℃,在红茶菌接种当时即0天、1,2,3,4,5,6,7天时向发酵液中加入0.12%的酸性纤维素酶进行试验,测定结果。
1.2.2.4纤维素酶浓度对红茶菌产膜量的影响
红茶菌接种量20%,培养基量70%,发酵温度37℃,在接种红茶菌的同时加入0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24浓度的纤维素酶进行试验,测定结果。
1.2.2.5不同红茶菌接种量对红茶菌产膜量的影响
按培养基量为总体积的70%,同时加入0.12%酸性纤维素酶,发酵温度37℃的条件下进行茶菌接种量分别为5%、10%、15%、20%、25%、30%时对产膜量的影响试验。
1.2.2.6培养基量对红茶菌产膜量的影响
同时向培养基的量为45%、50%、55%、60%、65%、70%中加入20%的红茶菌和0.12%的酸性纤维素酶在发酵温度37℃的条件下进行试验,测定结果。
1.2.2.7初始pH对红茶菌产膜量的影响
按培养基量为70%,同时加入20%红茶菌液和0.12%酸性纤维素酶在发酵温度37℃的条件下,调节各培养基的初始pH分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0进行试验,测定结果。
1.2.2.8温度对红茶菌产膜量的影响
以培养基量为70%,同时加入20%红茶菌和0.08%酸性纤维素酶,在发酵温度分别为35℃、37℃、40℃、43℃、46℃、50℃、53℃下进行试验,测定结果。
1.2.2.9正交试验的建立
根据各单因素试验结果按照表1和表2进行正交试验。
1.3检测方法
1.3.1葡萄糖标准浓度曲线绘制
1.3.1.11lmg/mL标准葡萄糖溶液
精确称取105℃干燥2h的分析纯葡萄糖0.5000g加水溶解,稀释定容至500mL。
1.3.1.2葡萄糖标准浓度曲线的绘制
分别取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL的1mg/mL的葡萄糖标准溶液和2mL3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS试剂)于不同编号的25mL容量瓶中。
并用去离子水将各容量瓶补至4mL。
在沸水浴中反应10min,冷却后定容到25mL。
在λmax=492nm下,用紫外分光光度计测定吸光度值,以吸光度值为纵坐标,葡萄糖含量为横坐标,绘制标准曲线[6]。
葡萄糖标准曲线如图1所示。
其回归方程为y=27.999x-0.1085,线性相关系数R2=0.9988,线性很好可以用此进行纤维素酶活力测定。
1.3.2酸性纤维素酶活力的测定
1.3.2.1酸性纤维素酶酶液制备
取酸性纤维素酶粉2.09g加200mL的去离子水,搅拌均匀后,于40℃水浴中保温45min,用脱脂棉过滤到三角瓶中密封置冰箱中冷藏待用[7]。
1.3.2.2酶活力测定方法
采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法[8]在45℃、pH5.0、酶促反应30min条件下测得酶活力为1334IU/g。
1.3.3纤维素膜重的称量
将菌膜取出后用清水进行漂洗,在自然状态下放置风干半小时后于分析天平上称量其膜重量。
图1葡萄糖标注曲线
Fig1Thecurveofglucosestandardconcentration
表1正交试验因素和水平
Table1Thefactorsandlevelsoftheorthogonalexperiment
水平
因素
初始pH
温度(℃)
红茶菌接种量(%)
酸性纤维素酶浓度(%)
1
4.5
40
10
0.08
2
5.0
43
20
0.12
3
5.5
46
30
0.16
表2L9(34)表
Table2L9(34)
试验号
A
初始pH
B
温度(℃)
C
红茶菌接种量(%)
D
酸性纤维素酶浓度(%)
1
1
1
1
1
2
1
2
2
2
3
1
3
3
3
4
2
1
2
3
5
2
2
3
1
6
2
3
1
2
7
3
1
3
2
8
3
2
1
3
9
3
3
2
1
2结果与分析
2.1酸性纤维素酶加入时间对红茶菌产模量的影响
以红茶菌接种量20%,培养基量为总体积的70%,发酵温度37℃,在不同的时间下向发酵液中加入0.12%的酸性纤维素酶进行试验,测得试验结果见表3。
表3酸性纤维素酶不同加入时间对红茶菌产模量的影响
Tab.3EffectofaddingacidcelluloseenzymeatdifferenttimeonfilmproductionofKampuchea
加入时间(d)
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
膜重(g)
0.0098
0.0095
0.0098
0.0100
0.0097
0.0103
0.0102
根据表3可知酸性纤维素酶的不同加入时间对红茶菌产模量影响不大。
随着纤维素酶的加入时间的推迟各试验组红茶菌的产模量均在0.0098g附近稍有波动。
考虑到试验效率选取红茶菌接种的同时加入酸性纤维素酶。
2.2浓度的纤维素酶对红茶菌产模量的影响
红茶菌接种量20%,培养基量70%,发酵温度37℃,在接种红茶菌的同时加入不同浓度的纤维素酶进行试验,根据试验方法测得膜重如下表4所示:
表4不同浓度酸性纤维素酶的加入对红茶菌的产膜量的影响
Tab.4EffectofaddingacidcelluloseenzymeatdifferentconsistenceonfilmproductionofKampuchea
纤维素酶浓度
0%
0.04%
0.08%
0.12%
0.16%
0.20%
0.24%
膜重(g)
0.0542
0.0351
0.0203
0.0100
0.0000
0.0000
0.0000
由表4可知随着酸性纤维素酶浓度的增加红茶菌产膜量逐渐的减少。
当酸性纤维素酶浓度达到0.16%或大于0.16%时红茶菌产膜量为零即无膜产生,即当酸性纤维素酶在0.16%时可有效的抑制红茶菌纤维素膜的产生。
考虑试验成本,本试验选取酸性纤维素酶浓度为0.16%。
2.3红茶菌接种量对红茶菌产膜量的影响
按培养基量为总体积的70%,同时加入0.12%酸性纤维素酶,发酵温度37℃的条件下进行不同红茶菌接种量对产膜量的影响试验。
根据试验方法测得各组试管膜重如下表5所示:
表5红茶菌不同接种量对红茶菌产膜量的影响
Tab.5EffectofaddingdifferentamountofKampucheaonfilmproductionofKampuchea
红茶菌接种量(%)
5
10
15
20
25
30
膜重(g)
0.0000
0.0000
0.0074
0.0115
0.0287
0.0312
由表5可知随着红茶菌接种量的增加红茶菌产膜量有着增加的趋势。
红茶菌接种量为5%、10%时均无膜产生,其后膜重逐渐增加。
当红茶菌接种量超过25%时,膜重量变化减小。
选取红茶菌接种量在10%以内。
2.4培养基加入量对红茶菌产膜量的影响
同时向不同量的培养基中加入20%红茶菌和0.12%酸性纤维素酶在发酵温度37℃的条件下进行试验,测得各组试管膜重如下表6所示:
表6不同培养基加入量对红茶菌产膜量的影响
Tab.6EffectofaddingdifferentamountofsubstrateonfilmproductionofKampuchea
培养基量(%)
45
50
55
60
65
70
膜重(g)
0.0000
0.0000
0.0000
0.0000
0.0082
0.0102
根据表6所示可知培养基加入量小于60%时,各组试验结果膜重量均为零即都无膜产生。
培养基量为65%时有膜产生,其后随着培养基加入量的逐渐增加膜重量也相应的随之增加。
本试验选取培养基加入量为60%以内。
2.5初始pH的对红茶菌产膜量的影响
按培养基量为70%,同时加入20%红茶菌液和0.12%酸性纤维素酶在发酵温度37℃的条件下,调节各培养基的初始pH进行试验,根据试验方法测得各组试管膜重如下表7所示:
表7初始pH的不同对红茶菌产膜量的影响
Tab.7EffectofdifferentinitialpHonfilmproductionofKampuchea
pH
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
膜重(g)
0.0320
0.0235
0.0184
0.0103
0.0000
0.0109
0.0258
根据表7可知初始pH的不同对红茶菌产膜量有影响。
初始pH在3.0~5.0之间随着pH的增大,红茶菌产膜量逐渐减少;当初始pH大于5.0时,随着pH的继续增加红茶菌产膜量又有所增加。
初始pH为5.0时膜重为零即无膜产生,所以本试验选取初始pH为5.0。
2.6温度对红茶菌产膜量的影响
以培养基量为70%,同时加入20%红茶菌和0.08%酸性纤维素酶,在不同的发酵温度下进行试验,测定各组试管膜重结果如下表8所示:
表8不同温度对红茶菌产膜量的影响
Tab.8EffectofdifferenttemperatureonfilmproductionofKampuchea
温度(℃)
35
37
40
43
46
50
53
膜重(g)
0.0380
0.0209
0.0134
0.0086
0.0000
0.0000
0.0000
根据表8中的数据可以看出随着温度的逐渐升高红茶菌的产膜量呈逐渐降低的趋势。
当温度达到46℃后,称取膜重量均为零即都没有膜产生。
考虑到能耗与试验条件达到的难易,本试验采用发酵温度为46℃。
2.7酸性纤维素酶对红茶菌产膜量影响因素的优选
通过单因素试验可知,酸性纤维素酶的浓度、红茶菌接种量、发酵液pH、温度是决定酸性纤维素酶对红茶菌产膜量影响的主要因素。
所以在单因素试验基础上选择酸性纤维素酶的浓度、红茶菌接种量、初始pH、温度四个因素,并选取三个适宜的水平进行正交试验。
在培养基量为60%,红茶菌接种同时加入酸性纤维素酶的条件下,通过正交试验的到各组膜重量见表9。
表9正交试验结果
Table9Theresultsofsensoryevaluation
试验号
A
初始pH
B
温度
C
红茶菌接种量
D
酸性纤维素酶浓度
膜重
1
1
1
1
1
0.0201
2
1
2
2
2
0.0086
3
1
3
3
3
0.0000
4
2
1
2
3
0.0000
5
2
2
3
1
0.0235
6
2
3
1
2
0.0000
7
3
1
3
2
0.0175
8
3
2
1
3
0.0000
9
3
3
2
1
0.0314
0.0287
0.0376
0.0376
0.0750
T=0.1011
0.0235
0.0321
0.0400
0.0261
0.0489
0.0314
0.0410
0.0000
0.0096
0.0125
0.0125
0.0250
0.0078
0.0107
0.0133
0.0087
0.0163
0.0105
0.0137
0.0000
R
较优水平
0.0085
A2
0.0021
B3
0.0011
C1
0.0250
D3
因素主次
D>A>B>C
从正交试验计算极差的大小可以看出在试验水平范围内,各因素对红茶菌产膜量的影响力为D>A>B>C,即酸性纤维素酶浓度对红茶菌产膜量影响最大,其次是发酵液的pH、发酵温度,红茶菌接种量对红茶菌产膜量的影响最小。
根据正交试验感官评定结果和极差分析,膜重量最小的组合分别是A1B3C3D3、A3B2C1D3、A2B1C2D3、A2B3C1D2,最优组合是A2B3C1D3,该组合在正交试验中没有出现,需要做验证试验。
验证试验结果五组处理中红茶菌产膜量均为零,考虑到因素对红茶菌产膜量的影响力大小与试验成本,选择最佳发酵参数为A2B3C1D2,即酸性纤维素酶浓度为0.12%,初始pH为5.0,温度46℃,红茶菌接种量为10%。
3讨论
3.1酸性纤维素酶加入时间的确定
酸性纤维素酶的不同加入时间对红茶菌产膜量没有太大的影响。
观察各试验组结果可知,虽然酸性纤维素酶的加入时间不同但膜重量变化不大。
各组试验结果均在0.0098g附近波动,且波动值在称量误差5%以内。
若不再接种红茶菌的同时加入酸性纤维素酶则会增大工作量,同时增大了污染杂菌的风险,因此本试验选取在同一时间接种红茶菌和加入酸性纤维素酶。
张永凤等[9]液态淋浇食醋发酵生产中细菌纤维素膜的防治研究中所选取的时间为在接种军中的同时加入酸性纤维素酶相同。
3.2酸性纤维素酶浓度的确定
随着酸性纤维素酶浓度的逐渐加大红茶菌的产膜量逐渐减少。
酸性纤维素酶浓度小了则达不到抑制膜产生的效果;大了则增加了试验的成本。
本实验中酸性纤维素酶浓度为0.16%时可以有效地抑制细菌纤维膜的产生。
这与张永凤等[9]液态淋浇食醋发酵生产中细菌纤维素膜的防治研究中的0.08%有所不同,主要是因为所选用的酸性纤维素酶不同且在不同的实验条件下酸性纤维素酶的活力有所不同。
3.3红茶菌接种量的确定
随着红茶菌接种量的增加红茶菌产膜量有着增加的趋势。
这是因为随着红茶菌接种量的增加红茶菌生长的对数期时间减少,对数期消耗的营养成分减少导致稳定期时间延长,致使发酵产物纤维素膜有所增加。
同时当菌种量大于25%以后增长趋势明显减小,是由于接种量基数相对过大使得菌种生长的对数期极短且相互之间相差不大导致的。
因此当膜量在控制范围内时可适当的增加红茶菌的接种量来增加发酵后的风味。
结合单因素试验与正交试验的结果,确定红茶菌接种量为10%。
3.4发酵液初始pH的确定
红茶菌的最适pH为4.5[10],纤维素酶最适pH为5.0[11]。
初始pH在3.0~4.5之间随着pH的增大,红茶菌产膜量逐渐减少在此pH内随着pH的增大红茶菌与纤维素酶活力都有所增加,但纤维素酶活力增加速度大于红茶菌增加速度。
初始pH从4.5~5.0膜重继续减少是由于在此pH内纤维素酶活力继续增加而红茶菌活力开始降低引起的。
随着pH的继续增加红茶菌产膜量又有所增加。
这是因为随着pH的增加纤维素酶与红茶菌的活力都有所降低,但纤维素酶活力降低的速度大于红茶菌活力的降低速度。
结合单因素与正交试验结果,本试验确定初始pH为5.0。
3.5发酵温度的确定
红茶菌最适生长温度35℃[12]。
在试验温度范围内,随着温度的逐渐升高红茶菌的产膜量呈逐渐降低的趋势。
这是由于在此温度范围内随着温度的升高逐渐达到纤维素酶的最适温度使得纤维素酶活力逐渐增强;同时随着温度的升高红茶菌的活力逐渐降低所引起的。
随着温度的升高,为了达到温度所消耗的能源也增多,因此在达到试验目的的同时降低温度可减少能耗。
结合单因素与正交试验结果,本试验选择发酵温度为46℃。
4结论
通过单因素试验和正交试验结果,考虑到试验的成本与效率得出酸性纤维素酶对红茶菌发酵过程中抑制产膜的最佳工艺参数为在接种红茶菌的同时加入酸性纤维素酶浓度为0.12%,初始pH为5.0,温度46℃,红茶菌接种量为10%,培养基量60%。
在此参数条件下红茶菌整个发酵过程中均无膜产生。
致谢
在毕业论文的整个过程中,我虽然尽心尽力,查阅大量资料,投入大量时间和精力,但终因学识有限,在设计、实验以及论文修改等方面仍有很多自己难以解决的问题,孙永康老师毫无保留的
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- 酸性 纤维素酶 红茶 菌产膜量 影响 周鹏宇