水质 粪大肠菌群的测定 滤膜法HJ 3471.docx
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水质粪大肠菌群的测定滤膜法HJ3471
中华人民共和国国家环境保护标准
HJ347.1-2018
部分代替HJ/T347-2007
水质粪大肠菌群的测定滤膜法
Waterquality—Determinationoffecalcoliform—Membranefiltration
(发布稿)
本电子版为发布稿。
请以中国环境出版集团出版的正式标准文本为准。
2018-12-26发布2019-06-01实施
生态环境部发布
目次
前言ii
1适用范围1
2规范性引用文件1
3术语和定义1
4方法原理1
5干扰和消除1
6试剂和材料2
7仪器和设备2
8样品3
9分析步骤3
10结果计算与表示5
11精密度和准确度6
12质量保证和质量控制6
13废物处理7
14注意事项7
附录A(资料性附录)粪大肠菌群检验记录及报告格式8
i
前言
为贯彻《中华人民共和国环境保护法》和《中华人民共和国水污染防治法》,保护生态环境,保障人体健康,规范水中粪大肠菌群的测定方法,制定本标准。
本标准规定了测定地表水、地下水、生活污水和工业废水中粪大肠菌群的滤膜法。
本标准是对《水质粪大肠菌群的测定多管发酵法和滤膜法(试行)》(HJ/T347-2007)
滤膜法部分的修订。
本标准首次发布于2007年,原起草单位为中国环境监测总站。
本次为第一次修订。
本次修订的主要内容如下:
——完善了方法原理的表述;
——增加了检出限;
——增加了规范性引用文件、术语和定义、干扰和消除、仪器和设备、样品采集、样品
保存、精密度和准确度、质量保证和质量控制、废物处理等章节;自本标准实施之日起,《水质粪大肠菌群的测定多管发酵法和滤膜法(试行)》(HJ/T
347-2007)废止。
本标准的附录A为资料性附录。
本标准由生态环境部生态环境监测司、法规与标准司组织制订。
本标准起草单位:
辽宁省环境监测实验中心。
本标准验证单位:
大连市环境监测中心、丹东市环境监测中心站、锦州市环境监测中心站、辽阳市环境监测站、铁岭市环境保护监测站和沈阳市疾病预防控制中心。
本标准生态环境部2018年12月26日批准。
本标准自2019年6月1日起实施。
本标准由生态环境部解释。
ii
水质粪大肠菌群的测定滤膜法
1适用范围
本标准规定了测定水中粪大肠菌群的滤膜法。
本标准适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水中粪大肠菌群的测定。
本方法的检出限:
当接种量为100ml时,检出限为10CFU/L;当接种量为500ml时,
检出限为2CFU/L。
2规范性引用文件
本标准引用了下列文件或其中的条款。
凡是不注日期的引用文件,其有效版本适用于本
标准。
GB/T14581水质湖泊和水库采样技术指导
HJ494水质采样技术指导
HJ/T91地表水和污水监测技术规范
3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。
3.1
粪大肠菌群fecalcoliforms
又称耐热大肠菌群(thermotolerantcoliforms)。
44.5℃培养24h,能在MFC选择性培养基上生长,发酵乳糖产酸,并形成蓝色或蓝绿色菌落的肠杆菌科细菌。
3.2
菌落形成单位colony-formingunits(CFU)
单位体积样品中的细菌群落总数。
4方法原理
样品通过孔径为0.45μm的滤膜过滤,细菌被截留在滤膜上,然后将滤膜置于MFC选
择性培养基上,在特定的温度(44.5℃)下培养24h,胆盐三号可抑制革兰氏阳性菌的生长,粪大肠菌群能生长并发酵乳糖产酸使指示剂变色,通过颜色判断是否产酸,并通过呈蓝色或蓝绿色菌落计数,测定样品中粪大肠菌群浓度。
5干扰和消除
5.1活性氯具有氧化性,能破坏微生物细胞内的酶活性,导致细胞死亡,可在样品采集(8.1)
1
时加入硫代硫酸钠溶液(6.6)消除干扰。
5.2重金属离子具有细胞毒性,能破坏微生物细胞内的酶活性,导致细胞死亡,可在样品采集(8.1)时加入乙二胺四乙酸二钠溶液(6.7)消除干扰。
6试剂和材料
除非另有说明,分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂或生物试剂,实验用水为蒸馏水或去离子水。
6.1MFC培养基。
胰胨
10g
蛋白胨
5g
酵母浸膏
3g
氯化钠
5g
乳糖
12.5g
胆盐三号
1.5g
1%苯胺蓝水溶液
10ml
1%玫瑰红酸溶液(溶于8.0g/L氢氧化钠液中)
10ml
将上述培养基中的成分(除苯胺蓝和玫瑰红酸外),溶解于1000ml水中,调节pH至7.4,分装于三角烧瓶内,于115℃高压蒸汽灭菌20min,储存于冷暗处备用。
临用前,按上述配方比例,用灭菌吸管分别加入已煮沸灭菌的1%苯胺蓝水溶液1ml及1%玫瑰红酸溶液(溶于8.0g/L氢氧化钠液中)1ml,混合均匀。
如培养物中杂菌不多,则不加玫瑰红酸亦可。
加热溶解前,加入1.2%~1.5%琼脂可制成固体培养基。
也可选用市售成品培养基。
配制好的培养基避光、干燥保存,必要时在5℃±3℃冰箱中保存,分装到平皿中的培养基可保存2~4周。
配制好的培养基不能进行多次融化操作,以少量勤配为宜。
当培养基颜色变化,或脱水明显时应废弃不用。
6.2无菌滤膜:
直径50mm,孔径0.45μm的醋酸纤维滤膜,按无菌操作要求包扎,经121℃
高压蒸汽灭菌20min,晾干备用;或将滤膜放入烧杯中,加入实验用水,煮沸灭菌3次,15min/次,前2次煮沸后需更换水洗涤2~3次。
6.3无菌水:
取适量实验用水,经121℃高压蒸汽灭菌20min,备用。
6.4硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)。
6.5乙二胺四乙酸二钠(C10H14N2O8Na2·2H2O)。
6.6硫代硫酸钠溶液:
ρ(Na2S2O3)=0.10g/ml
称取15.7g硫代硫酸钠(6.4),溶于适量水中,定容至100ml,临用现配。
6.7乙二胺四乙酸二钠溶液:
ρ(C10H14N2O8Na2·2H2O)=0.15g/ml
称取15g乙二胺四乙酸二钠(6.5),溶于适量水中,定容至100ml,此溶液可保存30d。
7仪器和设备
7.1采样瓶:
1L、500ml或250ml带螺旋帽或磨口塞的广口玻璃瓶。
2
7.2高压蒸汽灭菌器:
115℃、121℃可调。
7.3恒温培养箱:
允许温度偏差44.5℃±0.5℃。
7.4过滤装置:
配有砂芯滤器和真空泵,抽滤压力勿超过-50kPa。
7.5pH计:
准确到0.1pH单位。
7.6培养皿:
直径90mm。
7.7一般实验室常用仪器和设备。
注:
玻璃器皿及采样器具试验前要按无菌操作要求包扎,121℃高压蒸汽灭菌20min备用。
8样品
8.1样品采集
点位布设及采样频次按照GB/T14581、HJ/T494和HJ/T91的相关规定执行。
采集微生物样品时,采样瓶(7.1)不得用样品洗涤,采集样品于灭菌的采样瓶中。
样品采集量可根据水体实际情况而定,一般不少于250ml。
采集河流、湖库等地表水样品时,可握住瓶子下部直接将带塞采样瓶插入水中,约距水面10~15cm处,瓶口朝水流方向,拔瓶塞,使样品灌入瓶内然后盖上瓶塞,将采样瓶从水中取出。
如果没有水流,可握住瓶子水平往前推。
采样量一般为采样瓶容量的80%左右。
样品采集完毕后,迅速扎上无菌包装纸。
从龙头装置采集样品时,不要选用漏水龙头,采水前将龙头打开至最大,放水3~5min,
然后将龙头关闭,用火焰灼烧约3min灭菌或用70%~75%的酒精对龙头进行消毒,开足龙头,再放水1min,以充分除去水管中的滞留杂质。
采样时控制水流速度,小心接入瓶内。
采集地表水、废水样品及一定深度的样品时,也可使用灭菌过的专用采样装置采样。
在同一采样点进行分层采样时,应自上而下进行,以免不同层次的搅扰。
如果采集的是含有活性氯样品,需在采样瓶灭菌前加入硫代硫酸钠溶液(6.6),以除去活性氯对细菌的抑制作用(每125ml容积加入0.1ml的硫代硫酸钠溶液);如果采集的是重金属离子含量较高的样品,则在采样瓶灭菌前加入乙二胺四乙酸二钠溶液(6.7),以消除干扰(每125ml容积加入0.3ml的乙二胺四乙酸二钠溶液)。
注:
15.7mg硫代硫酸钠(6.4)可去除样品中1.5mg活性氯,硫代硫酸钠用量可根据样品实际活性氯
量调整。
8.2样品保存
采样后应在2h内检测,否则,应10℃以下冷藏但不得超过6h。
实验室接样后,不能立即开展检测的,将样品在4℃以下冷藏并在2h内检测。
9分析步骤
9.1样品过滤
根据样品的种类判断接种量,最小过滤体积为10ml,如接种量小于10ml时应逐级稀释。
3
先估计出适合在滤膜上计数所使用的体积,然后再取这个体积的1/10和10倍,分别过滤。
理想的样品接种量是滤膜上生长的粪大肠菌群菌落数为20~60个,总菌落数不得超过200个。
当最小过滤体积为10ml,滤膜上菌落密度仍过大时,则应对样品进行稀释。
1:
10稀释的方法为:
吸取10ml样品,注入盛有90ml无菌水(6.3)的三角烧瓶中,混匀,制成1:
10稀释样品。
样品接种量参考表见表1。
表1
接种量参考表
接种量(ml)
样品类型
100
10
1
0.1
10-2
10-3
10-4
10-5
水源水
▲
▲
▲
地表水
湖泊(水库)
▲
▲
▲
河流
▲
▲
▲
生活污水
▲
▲
▲
废水
工业废水
处理前
▲
▲
▲
处理后
▲
▲
▲
地下水
▲
▲
▲
用灭菌镊子以无菌操作夹取无菌滤膜(6.2)贴放在已灭菌的过滤装置(7.4)上,固定好过滤装置,将样品充分混匀后抽滤,以无菌水(6.3)冲洗器壁2~3次。
样品过滤完成后,再抽气约5s,关上开关。
9.2培养
用灭菌镊子夹取滤膜移放在MFC培养基(6.1)上,滤膜截留细菌面向上,滤膜应与培养基完全贴紧,两者间不得留有气泡,然后将培养皿倒置,放入恒温培养箱内,44.5℃±0.5℃
培养24h±2h。
9.3对照试验
9.3.1空白对照
每次试验都要用无菌水(6.3)按照步骤9.1和9.2进行实验室空白测定。
9.3.2阳性及阴性对照
将粪大肠菌群的阳性菌株(如大肠埃希氏菌Escherichiacoli)和阴性菌株(如产气肠杆菌Enterobacteraerogenes)制成浓度为40~600CFU/L的菌悬液,分别按照9.1~9.2步骤培养,阳性菌株应呈现阳性反应,阴性菌株应呈现阴性反应,否则,该次样品测定结果无效,应查明原因后重新测定。
4
10结果计算与表示
10.1结果判读
MFC培养基上呈蓝色或蓝绿色的菌落为粪大肠菌群菌落,予以计数。
MFC培养基上呈灰色、淡黄色或无色的菌落为非粪大肠菌群菌落,不予计数。
结果判读参考图片见图1。
阳性菌落阴性菌落(箭头指示处)
无菌落生长
图1结果判读参考图片
10.2结果计算
样品中的粪大肠菌群数(CFU/L),按照公式
(1)进行计算:
C=
C1⨯1000
(1)
f
5
式中:
C——样品中粪大肠菌群数,CFU/L;
C1——滤膜上生长的粪大肠菌群菌落总数,个;1000——将过滤体积的单位由ml转换为L;f——样品接种量,ml;
注:
若平行样结果都在20~60CFU/L范围内,最终结果取平均值以几何平均计算。
10.3结果表示
测定结果保留至整数位,最多保留两位有效数字,当测定结果≥100CFU/L时,以科学计数法表示。
粪大肠菌群检验记录及报告格式参见附录A。
11精密度和准确度
11.1精密度
6个实验室对低浓度(地下水,浓度均值为2.0×102CFU/L)、中浓度(地表水,浓度均值为1.6×105CFU/L)和高浓度(生活污水,浓度均值为1.6×107CFU/L)三个不同浓度粪大肠菌群的实际样品和有证标准样品(浓度为3670MPN/L,可接受范围为330~7710MPN/L)进行了6次重复测定:
实验室内相对标准偏差范围分别为5.3%~12%、0.81%~
2.1%、0.51%~4.2%和7.7%~9.8%;实验室间相对标准偏差分别为6.8%、3.9%、4.0%和3.6%;
实验室间95%置信区间见表2。
表2实验室间95%置信区间
低浓度(CFU/L)
中浓度(CFU/L)
高浓度(CFU/L)
标准样品(CFU/L)
均值
95%置信区间
均值
95%置信区间
均值
95%置信区间
均值
95%置信区间
2.0×102
1.4×102~
1.6×105
9.8×104~
1.6×107
8.2×106~
6.1×102
3.8×102~
2.9×102
2.6×105
3.0×107
9.9×102
11.2准确度
6个实验室对含粪大肠菌群浓度为3670MPN/L(可接受范围为330~7710MPN/L)的标准样品进行了6次重复测定:
相对误差范围为-19%~-32%;相对误差最终值为:
-23%±10%。
注:
微生物检测数据为偏态分布,其测定结果全部经以10为底对数转换后进行计算。
12质量保证和质量控制
12.1培养基检验
更换不同批次培养基时要进行阳性和阴性菌株检验,将粪大肠菌群测定的阳性菌株(如
大肠埃希氏菌Escherichiacoli)和阴性菌株(如产气肠杆菌Enterobacteraerogenes)配成适
宜浓度,按样品过滤(9.1)的要求使滤膜上生长的菌落数为20~60个,然后按培养(9.2)
6
的要求进行操作,阳性菌株应生长为蓝色或蓝绿色菌落,阴性菌株应生长为灰色、淡黄色、无色或无菌落生长。
否则,该次样品测定结果无效,应查明原因后重新测定。
12.2对照试验
12.2.1空白对照
每次试验都要用无菌水做实验室空白测定(9.3.1),培养后的培养基上不得有任何菌落生长。
否则,该次样品测定结果无效,应查明原因后重新测定。
12.2.2阳性及阴性对照
定期按照9.3.2进行阳性及阴性对照试验,阳性菌株应呈现阳性反应,阴性菌株应呈现阴性反应,否则,该次样品测定结果无效,应查明原因后重新测定。
13废物处理
使用后的废物及器皿须经121℃高压蒸汽灭菌30min或使用液体消毒剂(自制或市售)灭菌后,器皿方可清洗,废物作为一般废物处置。
14注意事项
当样品浑浊度较高时,应选用其他方法。
7
附录A(资料性附录)
粪大肠菌群检验记录及报告格式
表A.1
粪大肠菌群测定检验记录
项目名称:
检验日期:
年
月
日
检验方法
方法依据
灭菌锅型号
出厂编号
培养箱型号
出厂编号
培养基灭菌温度(℃)
培养温度(℃)
样品编号:
过滤体积
ml
滤膜上生长的菌落总数
个
稀释倍数(D)
倍
结果
CFU/L
检验者:
校对:
审核:
注:
可根据实际工作需要自行设计表格,至少要包括上述信息。
表A.2
粪大肠菌群测定数据报告格式
样品来源
采/送样日期
分析日期
样品数量
样品状态
监测点位
样品编号
监测频次
标准方法名称
标准方法编号
测定值:
监测结果:
备注
注:
可根据实际工作需要自行设计表格,至少要包括上述信息。
8
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