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生化大实验指导书
《生物化学大实验》
参考资料
《生物化学综合大实验》课程组
2014年12月
资料来源:
1、张龙翔张庭芳李令媛.《生化实验方法和技术》,1997年,第2版;
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实验一SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
——蛋白质分子量的测定
试剂配制
1、凝胶贮液:
Acr29g,Bis1g,加水至100ml,即为浓度30%的凝胶贮液。
2、10%过硫酸铵
过硫酸铵1g,加水至10ml。
SDS100mg
巯基乙醇0.1mL
甘油1mL
溴酚蓝2mg
pH7.2磷酸盐缓冲溶液0.5mL
加蒸馏水至总体积10mL
4、4X分离胶buffer
Tris36.3g,HCl调pH到8.8,然后加入SDS0.8g,加水至200ml。
5、4X浓缩胶buffer
Tris3.0g,HCl调pH到6.8,然后加入SDS0.2g,加水至50ml。
6、电泳buffer
Tris30.28g
Gly144.13g
SDS10g
加水至10L,毋需调pH。
7.0.2mol/L,pH7.2磷酸盐缓冲溶液:
取280mL0.2mol/L磷酸二氢钠溶液,加入720mL0.2mol/L磷酸氢二钠溶液,混匀后在pH计上调至pH7.2.
8.染色液:
0.25g考马斯亮蓝R-250,加入454mL50%甲醇和46mL冰乙酸。
9.脱色液:
75mL冰乙酸,875mL蒸馏水与50mL甲醇混合。
10.标准蛋白质
操作方法
一、安装垂直板电泳槽、凝胶制备
凝胶制备方法如下:
15%(分离胶)
4%(浓缩胶)
水
1.25ml
3ml
凝胶贮液
2.5ml
0.65ml
4X分离胶buffer
1.25ml
4X浓缩胶buffer
1.25ml
Temed
5微升
5微升
10%过硫酸铵
50微升
50微升
总体积各为5ml,根据需要可调整。
首先配置分离胶,用异丙醇封胶,待胶凝固后,用水把异丙醇洗掉,然后配置浓缩胶,插入梳子,等待凝固。
思考题
1、为什么SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法可以测定蛋白质的分子量?
2、在用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量时,应注意哪些问题?
实验二血红蛋白凝胶过滤层析
【实验目的】
通过本实验学习凝胶过滤层析的操作技术,掌握凝胶过滤层析的原理及其应用。
【实验原理】
凝胶过滤(gelfiltration)是一种利用凝胶按照分子大小分离物质的层析方法,又称分子筛层析(molecularsievechromatography)或排阻层析(exclusionchromatography)。
1.凝胶介质
目前常用于凝胶过滤的的凝胶类介质主要有4大类,即葡聚糖凝胶,商品名(Sephardex)、琼脂糖凝胶,商品名(Sepharose)和聚丙烯酰胺凝胶,商品名(bio-gel)和琼脂糖-聚丙烯酰胺混合凝胶等层析介质。
它们都是不溶于水的高聚物,内部有很微细的多孔网状结构。
以Sephardex为例,它是由一定平均分子量的葡聚糖与环氧氯丙烷交联生成的高聚物,网眼的大小由葡聚糖的分子量与环氧氯丙烷的用量来控制。
葡聚糖的分子量越大、环氧氯丙烷用量越大,则交联度越大,凝胶的网眼越小。
Sephadex有很强的亲水性,在水或缓冲液中能吸水膨胀。
交联度越大,网眼越小,吸水量也越少。
实际工作中常用每克干胶吸水量(mL)的10倍(G值)表示葡聚糖凝胶的交联度,可根据被分离物质分子的大小和工作目的,选择适合的凝胶型号。
2.凝胶过滤的原理
凝胶过滤层析(凝胶过滤)是把样品加到充满凝胶颗粒的层析柱中,然后选择适当的缓冲液进行洗脱。
凝胶本身是一种分子筛,凝胶颗粒有一定得孔径,它可以把待分离样品按分子大小不同进行分离,好像过筛,可以把大颗粒与小颗粒分开。
但这种过筛与普通的筛子不同。
凝胶过滤的主要装置是填充有凝胶颗粒的层析柱。
将凝胶颗粒在适宜溶剂中浸泡,使其充分吸收膨胀,然后装入层析柱中,加入欲分离的混合物,然后再用同一溶剂洗脱,在洗脱过程中颗粒直径接近或大于凝胶颗粒网孔直径的大分子,不能进入凝胶颗粒中的静止相,只能留在凝胶颗粒之间的流动相中,因此先流出层析柱;反之,小分子则可自由出入凝胶颗粒,因而流速慢以至最后流出柱外,从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。
本实验利用凝胶过滤的特点,先向层析柱中加入FeSO4溶液,形成一个还原带,然后加入血红蛋白样品(血红蛋白与高铁氰化钾的混合液)。
由于血红蛋白分子量大,在凝胶床中流速快,当其流经还原带时,褐色的高铁血红蛋白立即变为紫红色的亚铁血红蛋白。
亚铁血红蛋白继续下移,与缓冲液溶解的O2结合,形成鲜红色的氧合血红蛋白。
铁氰化钾是小分子量化合物,呈黄色带远远地落在后边。
这样,就可以形象直观地观察到凝胶过滤的分离效果。
3.凝胶过滤的优点及用途
凝胶过滤的操作条件温和,适于分离不稳定的化合物;凝胶颗粒不带电荷,不与被分离物质发生反应,因而溶质回收率接近100%;而且设备简单、操作方便、分离效果好、重现性强,凝胶柱可反复使用。
所以,凝胶过滤常用于测定相对分子质量、脱盐、蛋白质等大分子的分离纯化。
【实验仪器及试剂】
1.仪器:
层析柱(Ф1cmx20cm)、真空泵、真空干燥器、抽滤瓶、恒温水浴。
2.试剂:
(1)磷酸缓冲液(PH7.0):
称取Na2HPO4·2H2O2.172g,NaH2PO4·2H2O1.076g,溶于蒸馏水中,定容至1000mL。
(2)Na2HPO4-EDTA-Na2溶液:
称取2.69gEDTA-Na2,3.56gNa2HPO4·2H2O,加蒸馏水溶解并定容至100mL。
(3)40mmol/LFeSO4溶液:
称取FeSO4·7H2O1.11g溶于100mL水中(用时现配)。
(4)SephadexG-25,或G-75
(5)固体铁氰化钾〔K3Fe(CN)6〕
(6)抗凝血(哺乳动物血样,以1:
6的比例加入2.5%柠檬酸钠,置于4℃冰箱中保存)。
【实验步骤】
1.凝胶溶胀:
取10gSePhadexG-25,加200mL蒸馏水充分溶胀(在室温下约需6小时或在沸水浴中溶胀5小时)。
待凝胶溶胀平衡后,用倾泻法除去细小颗粒,再加入与凝胶等体积的pH7.0磷酸缓冲液,在真空干燥器中减压除气,准备装柱。
2.装柱:
将层析柱垂直固定,旋紧柱下端的螺旋夹,在柱内加入少量磷酸缓冲液或直接把处理好的凝胶连同适当体积的缓冲液用玻棒搅匀,然后边搅拌边倒入层析柱中,同时开启螺旋夹,控制一定流速。
最好连续装完凝胶,若分次装入,需用玻棒轻轻搅动柱床上层凝胶,以免出现界面影响分离效果。
装柱后形成的凝胶床至少长30cm,使胶床表面保持2-3cm液层。
注意:
整个操作过程中凝胶必须处于溶液中,不得暴露于空气,否则将出现气泡和断层,应当重新装住。
3.平衡:
继续用磷酸缓冲液洗脱,调整缓冲液流速,平衡20-30分钟。
4.样品制备:
(1)取1mL鸡的抗凝血放入小烧杯中,加5mLpH7.0的磷酸缓冲液,再加入27.5mgK3Fe(CN)6固体,用玻棒搅动使其溶解,即得褐色的高铁血红蛋白溶液。
(2)吸取lmLFeSO4溶液和lmLEDTA-Na2-NaHPO4溶液,于小烧杯中混匀。
(注意:
还原剂混合液要新鲜配制,尽可能缩短其与空气接触的时间)。
5.上样:
旋开层析柱上端旋扭,待胶床上部的缓冲液几乎全部进入凝胶(即缓冲液液面与胶床平面相切)时,立即加入0.4mL上述混合液,待其进入胶床表面仅留约lmm液层时,加入0.5mL缓冲液,再当胶床表面仅留约lmm液层时,吸取0.5mL血红蛋白样品溶液,小心地注入层析柱胶床面中央,注意切勿冲动胶床。
慢慢打开螺旋夹,待大部分样品进入胶床、床面上仅有lmm液层时,用乳头滴管加入少量缓冲液,使剩余样品进入胶床,然后用液管小心加入3~5cm高的洗脱缓冲液。
6.洗脱:
继续用磷酸缓冲液洗脱,调整流速,使上下流速同步保持每分钟约6滴。
7.凝胶的回收:
实验完毕用洗脱液把柱内有色物质洗脱干净,保留凝胶柱重复使用或回收凝胶。
【实验结果】
(1)观察并记录实验现象。
(2)收集红色的洗脱液
思考题
1、凝胶过滤层析常用介质有哪些?
凝胶过滤层析技术有何优点与用途?
2、蛋白质凝胶过滤层析应注意哪些问题?
实验三酶的特异性以及温度、pH对酶活性的影响
(一)酶的特异性
【实验原理】
酶具有高度的特异性,一种酶只能催化一种化合物或某一类化合物,如淀粉酶,只能催化淀粉水解,而不能使蔗糖水解。
本实验以唾液淀粉酶分别对淀粉及蔗糖的不同作用,来说明酶的特异性。
【实验试剂】
1.唾液淀粉酶的制备:
用烧杯取蒸馏水或自来水,含于口中,1-2分钟后,吐入50mL烧杯中,备用。
2.0.3%NaCl的0.5%淀粉液
3.0.5%蔗糖液
4.Benedict试剂
A、取CuSO417.3g溶于100mL热蒸馏水中,冷后稀释至150mL;
B、取柠檬酸钠173g及Na2CO3(无水)100g,加水600mL加热使之溶解,冷后稀释至850mL;
C、将A液缓慢注入B液中,混匀备用。
(可长期保存)。
【实验步骤】
1.取试管两支,一支加入0.5%淀粉液2mL,另一支加入0.5%蔗糖液2mL;
2.于两支试管中各加入制备好的唾液1mL;
3.将两支试管同时放入37℃恒温水浴箱中保温;
4.15分钟后,取出两试管,各加入Benedict试剂1mL;
5.将两试管同时放入沸水中煮沸6分钟;
6.取出两试管,观察记录颜色的变化,并注意有无红色沉淀产生,为什么?
(二)温度对酶活性的影响
【实验原理】
酶促反应同一般化学反应一样都需要在一定的温度下进行,使酶促反应速度最大时的温度称为此酶的最适温度,低于此温度,酶促反应速度缓慢,高于最适温度,酶蛋白变性失活。
本实验以入唾液淀粉酶在不同温度下分解淀粉为例,说明温度对酶活性的影响。
【实验试剂】
1.唾液淀粉酶的制备:
用烧杯取蒸馏水或自来水,含于口中,1-2分钟后,吐入50mL烧杯中,备用。
2.0.3%NaCl的0.5%淀粉液
3.KI-I溶液
【实验步骤】
1.取三支试管并编号,同时各加入5mL0.5%淀粉液及1mL唾液混匀;
2.将管1、管2、管3同时分别放入冰浴、37℃水浴、沸水浴中;
3.15分钟后,取出各管,分别加入碘液数滴,观察并记录各管颜色变化,并解释此现象。
(三)pH对酶活性的影响
【实验原理】
在一定条件下,酶活性最高时的pH值称为最适pH,偏离此pH,酶活性就会有所下降,不同酶的最适pH不同。
例如,胃蛋白酶的最适pH为1.5-2.5,胰蛋白酶的最适pH为8等。
本实验以入唾液淀粉酶(最适pH6.8)在不同pH条件下水解淀粉为例,说明pH对酶活性的影响。
【实验试剂】
1.唾液淀粉酶的制备:
用烧杯取蒸馏水或自来水,含于口中,1-2分钟后,吐入50mL烧杯中,备用。
2.pH1.5溶液:
取0.2MNa2HPO4·2H2O溶液41.2mL加入0.1M柠檬酸38.8mL,然后用浓HCl调至pH1.5左右;
3.pH6.8溶液:
取0.2MNa2HPO4·2H2O溶液61.8mL加入0.1M柠檬酸溶液18.2mL;
4.pH9.8溶液:
取0.2MNa2HPO4·2H2O溶液77.8mL加入0.1M柠檬酸溶液2.2mL,然后用0.1NNaOH调至pH9.8。
【实验步骤】
1.取试管3支并编号,如下表加入各试剂;
2.3支试管同时放入37℃恒温水浴箱内保温;
3.15分钟后,取出3支试管,分别加入碘试剂数滴,每加1滴,注意摇匀,观察并记录颜色变化。
思考题
1、以淀粉酶为例,说明酶作用有何特异性。
2、以淀粉酶为例,说明温度、pH对酶活性有何影响。
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