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氟虫腈及其代谢物
摘要
本论文从不同溶剂(正己烷、乙腈、乙酸乙酯)提取、不同的提取方式(匀浆、超声、振摇)、不同的净化方式(Flotisil硅酸镁、NH2、GCB、PSA、C18)等方面对回收率的影响得出以下主要结果。
1、通过溶剂(正己烷、乙腈、乙酸乙酯)对氟虫腈及其代谢物的分析选择乙腈作为最佳提取溶液。
2、考察不同提取方式(匀浆、超声、振摇)对氟虫腈及其代谢物的提取分析选择振摇样品30min为最佳提取方式。
3、根据几种不同的固相萃取柱的作用不同,选择使用Flotisil(硅酸镁)萃取柱进行净化为最佳的净化方式。
4、根据氮吹温度(65~70℃、70~75℃、75℃以上)回收率比较,及氟虫腈及其代谢物性质选择最佳温度为60~70℃。
建立了一种快速提取、净化、使用超高效液相色谱-质谱串联联用(UPLC-MS/MS)对氟虫腈及其代谢物的新方法。
用乙腈作为提取液提取,置于摇床上振摇30min,经过Flotisil(硅酸镁)净化后,使用UPLC-MS/MS仪器的MRM进行分析。
回收率在70~110%之间,相对标准偏差为6.5%,小于10%。
关键词:
UPLC-MS/MS;氟虫腈及其代谢物;农药残留;
Abstract
Inthispaper,fromdifferentsolvents(normalhexane,acetonitrile,ethylacetateextraction,differentextractionmethods(homogenate,ultrasound,vibrationwave),differentpurification(Flotisilmagnesiumsilicate,NH2,GCBandPSA,C18)ontherecoveryrateofthemainresultsareasfollows.
1、通过溶剂(正己烷、乙腈、乙酸乙酯)对氟虫腈及其代谢物的分析选择乙腈作为最佳提取溶液。
1)throughtheanalysisofthesolvents(hexane,acetonitrile,ethylacetate)totheanalysisofthechoiceofacetonitrileasthebestextractionsolution.
2、考察不同提取方式(匀浆、超声、振摇)对氟虫腈及其代谢物的提取分析选择振摇样品30min为最佳提取方式。
2)theextractionofdifferentextractionmethods(homogenization,ultrasound,vibration)ontheextractionandanalysisoffluorideanditsmetaboliteswereselectedasthebestextractionmethodof30min.
3、根据几种不同的固相萃取柱的作用不同,选择使用Flotisil(硅酸镁)萃取柱进行净化为最佳的净化方式。
3)accordingtothedifferentroleofseveraldifferentsolidphaseextractioncolumn,choosetouseFlotisil(magnesiumsilicate)extractioncolumnforthebestpurificationmethod.
4、根据氮吹温度(65~70℃、70~75℃、75℃以上)回收率比较,及氟虫腈及其代谢物性质选择最佳温度为60~70℃。
4)accordingtothenitrogenblowingtemperature(65~70degreesC,70~75degreesC,above75degrees)recoveryrate,andthenatureofthefluorineanditsmetabolitestoselectthebesttemperaturefor60~70.
建立了一种快速提取、净化、使用超高效液相色谱-质谱串联联用(UPLC-MS/MS)对氟虫腈及其代谢物的新方法。
用乙腈作为提取液提取,置于摇床上振摇30min,经过Flotisil(硅酸镁)净化后,使用UPLC-MS/MS仪器的MRM进行分析。
回收率在70~110%之间,相对标准偏差为6.5%,小于10%。
Anewmethodfortherapidextraction,purificationandtheuseofultraperformanceliquidchromatographytandemmassspectrometry(UPLC-MS/MS)forthedetectionoffluorideanditsmetaboliteswasestablished.Withacetonitrileasextractionliquidextraction,placedinbedshakingfor30min,afterpurificationFlotisil(magnesiumsilicate)usingUPLC-MS/MSinstrumentofMRManalysis.Recoveryratein70~110%,therelativestandarddeviationis6.5%,lessthan10%.
关键词:
UPLC-MS/MS;氟虫腈及其代谢物;农药残留;
Keywords:
UPLC-MS/MS;fluorine;cyanideanditsmetabolites;pesticideresidues;
第1章绪论
1.1研究背景
农药,是如今的农业发展中主要用于防止病、虫与杂草对作物危害不可少的一种特殊物质,它对提高农作物产量具有非常关键的作用。
而伴随着全球农业科技的快速发展与进步,农药的种类与数量也随之不停的增长,化学农药的施用已经逐渐成为预防以及治理病虫害的一种常用方法。
农药被施加到农作物之后,大部分的农药会因为多种其他的原因而被转化,但是作物内部仍然残存着少部分的农药试剂。
人类假如经常性的食用含农药超标的农作物,会严重的损害了人体健康,而这也正是农药试剂残留量问题的缘由。
而在这几年里,因为有不少的农户忽略了对化学农药试剂的正确使用,而使农药残留以及污染问题、状况常常发生;农药的残留量不仅严重超标,而且每一年还有不断增加的倾向。
同时,伴随着种植以及栽培技术的不断创新,农残这一个问题将会变得更加严峻,而这也将会对人类的生命健康构成非常严重的潜在危害与威胁。
农药残留,也就是指:
当农药于使用后的一段时间里面,由于没能够被分解而残留于农作物、收获物、生物体以及土壤亦或者大气里的少量农药原体、有毒有害代谢物质、降解物以及杂质在内的一个总称[1]。
被使用在作物中的农药,有一部分会依附在作物上,而一部分又就会散落于土壤、水体以及大气当中;而残留于环境中的农药,又会有一少部分被各种植物所吸收;它们可以直接借助植物蔬果、水体抑或者大气而进入到人体以及禽畜的体内;又或者通过庞大的食物链的流动,最终都会进入到人体以及禽畜体内。
其中氟虫腈作为一种新型农药已被广泛推广使用于各种农作物和蔬菜。
1.2研究目的及意义
1.2.1研究目的
随着农产品的需求量的增长,为了促进农产品的收成,农药的使用越来越普及、广泛。
其中农药的残留、生态污染、储存和加工过程的污染以及病原体已经成为了食品安全问题最为关键的影响因素。
然而农药的残留不仅仅对于人类的生命健康还带给动植物极大的影响,危害生命健康。
解决农残问题是保障农业产品的食品安全、提高农产品品质的关键。
本文是以农药中的氟虫腈以及代谢物类的药物作为研究对象,探察出检测方法中的优化方案,凭借对农药残留分析的技术和超高液相色谱联合质谱(UPLC-MS/MS)技术所能达到一定的认识和了解。
其中本文优化了提取方法、提取溶剂、氮吹温度、净化柱的选择与质谱条件并通过超高液相色谱质谱联仪检测蔬菜水果中4种氟虫腈及其代谢物药物残留量。
在提取与净化步骤中,对提取溶剂、提取振摇时间、洗脱液用量以及固相萃取柱进行研究,以便能够达到操作简单方便、检测效率明显提高、灵敏度高、分析时间短、定性定量的准确、各项技术指标均满足残留检测要求的目的,以期为氟虫腈及其代谢物药物残留量的检测研究增加一定的参考依据。
1.2.2研究意义
建立一种快速提取、净化、使用超高效液相色谱-质谱串联联用(UPLC-MS/MS)对氟虫腈及其代谢物的新方法。
采取最优选择项优化技术,并广泛应用到类似农药的农药残留当中,实验中还考虑到了基质效应,以该实验测出的基质效应为依据,方便日后再次测定氟虫腈及其代谢物类的残留量。
1.3本章小结
本章主要讲述了研究的背景,研究的目的及意义。
研究背景描述了农药残留的危害,而目的是找到检测农残的快速检测方法,其意义在于能够方便日后检测。
第2章文献综述
2.1农药残留的现状及危害
2.1.1农药的影响
2.1.1.1对环境的影响
使用农药后,农药会流入河流、湖泊和池塘从而污染水资源,使得其水质变酸,从而导致河流、湖泊和池塘里的生物死亡或生病,特别对于鱼类的影响最为严重。
2.1.1.2对农药使用者的影响
如果使用农药时使用方法不当,则可能会造成皮肤烧伤,腹泻或呕吐,严重时更加会造成生命健康的威胁。
2.1.1.3食物中的农药残留
大部分的农药都是有毒的,在使用农药后,农作物都会带有农药残留,令农作物中含有毒素。
若果未遵守该农药的停药期规定,而提前采收,则会使得农药残留。
或者使用不被允许使用在该农作物的农药,从而导致农药被该农作物吸收。
例如在生姜种植时使用“神农丹”。
2.1.2农药的分类以及危害
2.1.2.1有机磷农药
有机磷农药属于广谱杀虫剂,主要有乐果、敌敌畏、敌百虫、氟虫腈等60余种。
此类农药具有高效、易分解的性质,而且品种多,防治的对象以及效果都很可观,是我国农药使用数量而且生产总量最大的一类。
因为有机磷非常不稳定,而且挥发性相当强,在自然环境中很容易分解,进入生物体内容易被酶分解,所以不污染环境,而且在食物中的残留时间也短,因此引起的慢性中毒少,多为急性中毒。
有机磷农药的毒性会危害人体的神经系统,人们倘若吃了施放了有机磷农药的生果、农作物等,容易造成肌肉震颤、高血压、心跳加快等等的症状,甚至昏迷死亡。
而本实验中研究的氟虫腈则是典型的有机磷农药。
2.1.2.2有机氯农药
有机氯农药属于高残毒农药,其中六六六、DDT等在我国早已禁用,但是至今仍然有违规使用的情况,特别是毒杀芬、七O五四、林丹、氯丹等仍然在继续使用。
有机氯的脂溶性非常强,而且不易水解和降解,非常的稳定,聚集在人体脂肪内,而且在自然环境中和食物中都能够长期的残留,停用后自然环境要至少要经过25~110年才能够复原。
食品受到有机氯的污染通常是从生活在水里浮游生物的捕食开始[8],然后经由鱼类、虾类捕食浮游生物,到了最后进入以水产动物为食的鸟类、人体,它的富集程度已经达到了800多万倍。
蔬菜水果以及其余的农作物都可以残留有机氯,而且动物性食品被污染的概率则大大的高于植物性食品[8],而且不会因为其贮藏、加工、烹调而减少,很容易的进入到人体从而积蓄下来。
有机氯农药可导致急性或者慢性中毒。
急性中毒可引发中毒者中枢神经的症状。
因为此农药会贮藏在人体脂肪当中,所以急性中毒的可能较低、症状低微,一般为浑身没劲、头晕、反胃、睡不着;慢性中毒则可以造成人的肝、肾和神经系统损伤,DDT还具有致癌性。
2.1.2.3氨基甲酸酯类农药
氨基甲酸酯类农药是应用很广的新型杀虫剂与除草剂,如克百威、抗蚜威、残杀威、西维因、杀螟丹等,在阳光和空气中就易于分解。
其毒性与有机磷非常的相似,但毒性较之比较轻,恢复得也快。
一旦品尝了含有氨基甲酸酯类农药的蔬菜水果等农作物,中毒的人会发生和有机磷中毒比较一致的,但是因为其毒性比较轻,一般几小时就可以自行恢复。
2.1.2.4拟除虫菊酯类农药
拟除虫菊酯类农药是由人工合成的一类农药,以天然的除虫菊酯为原型,其杀虫效果较好,而且低残留低毒性,没有致癌和突变作用。
主要有杀灭菌脂(速灭杀丁)、氯氰菊脂(灭百可)、溴氰菊脂(敌杀死)等,对人类的毒性比较低,但是其具有蓄积性,中毒的表现症状为神经系统症状和皮肤刺激症状。
2.2超高效液相色谱-质谱/质谱联用技术(UPLC-MS/MS)概述
UPLC-MS/MS主要是由超高效液相色谱(UltraPerformanceLC,UPLC)、接口装置(同时也是电离源)、质谱仪(MS)和质谱工作站软件等四部分组成。
2.2.1 UPLC-MS/MS的原理与特点
超高效液相色谱(UltraPerformanceLiquidChromatogra-phy,UPLC)技术是应小粒径填料(粒径<2μm)和超高压(压力>105kPa)的要求而专门设计的,这种技术维持了原本的高效液相色谱技术的基本原理,不过这种技术的分离效能以及分离的效率都达到了非常大的提高,并且能够很突出地提高色谱峰的分离度以及增加检测的灵敏度,特别在质谱联用中更加可以突出这技术优越的性能。
液质联用(LC-MS/MS)分析技术的逐渐成熟,了更为检测物体内代谢物的分析提供加简单、方便、迅捷的分析方法[6],推动了药物代谢动力学的进步趋势。
UPLC基本保持了HPLC的基本原理,其理论依据于范迪姆特(VanDeemter)经验方程。
在HETP=Adp+B·v-1+C(dp)2v式中,HETP是理论塔板高度,A为涡流扩散系数传质因子,v为流动相线速度。
可以直观地,dp是填料粒径,B为分子径向扩散系数,C为由该方程得出结论:
减少颗粒度不仅仅增加了柱效,同一时间还具有提速的效果。
根据色谱柱中添加的固定相粒度dp的降低,色谱柱的理论塔板高度H同时得到了有效的降低,因其柱效提高,并且可以得到越加宽的线速度范围,从而达到分离以及分析的快速、精准和高效。
超高效液相色谱使用了1.7μm颗粒度的色谱柱作为它的填料,并且提高了了分析的通量、色谱峰大小及灵敏度,从而改进了一般情况下超高效液相色谱技术的缺点。
2.2.2UPLC-MS/MS技术的展望
超高效液相色谱技术是一项比较新颖的检测方法,其在敏锐性、分离和分析速率等这些性能都比传统的HPLC好。
UPLC-MS联用技术将超高效液相色谱技术的超强分离性能和质谱技术的高鉴别特点联合一起,发展成为了一个完美的现代分析技术,并且可以相当好地适应到如今药物研究新发展。
依据现今技术的不断进步,UPLC-MS一定可以在药品的研究方向中凸显出远比现在好的应用前景,并且必将作为其发展的重要动力。
2.3氟虫腈及其代谢物概述
2.3.1氟虫腈及代谢物简介
氟虫腈,英文的通用名称为Fipronil,锐劲特(Regent)是其商标的名称,化学名称(RS)-5-氨基-(2.6-二氯-4a-三氟甲基苯基)-4-三氟甲基亚磺酰基吡唑-3-腈基吡唑,氟虫腈是由法国的罗纳普朗克农化公司在1987年所开发研制的苯基吡唑类新型高活性杀虫剂,主要用于防治蔬菜、水稻、烟草、棉花、蓄牧业、公共卫生、贮存用品及地面建筑中各类别的作物害虫以及卫生害虫。
氟虫腈是作为一类比较创新且性能好的的灭虫农药,在全国范围内乃至国际上都被大量的利用。
但是经由环境毒理学的探究竟然分析出了氟虫腈及其代谢物对于生态环境存在比较潜伏的不安全性,并且拥有对于神经系统有慢性毒性的作用。
目前,氟虫腈已被我国列入为出口蔬菜残留监控的项目之一,但还没有相关的限量标准与残留分析方法标准。
美国、日本、澳大利亚等国也对该农药极为的关注,均对其在食品中残留进行了规定。
氟虫腈及其类似物是一类具有广谱杀虫效果的农药,对昆虫具有胃毒作用,毒性较低,但过量的残留必然会对人畜或其他生物产生不良影响。
据报道,氟虫腈原药对小鼠具有一定的肝毒性、神经毒性等,对水生动物、家蚕、蜜蜂等都具有较强的毒性,氟虫腈能够过量刺激啮齿类动物的甲状腺激素分泌,而有可能形成甲状腺癌;氟虫腈对人体的神经、消化和循环系统等都有明显的毒副作用。
另一方面,氟虫腈在外界环境中能够代谢生成毒性更高的氟虫腈砜和氟虫腈亚砜等化合物。
最常见的为氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜四种,其结构式见图2-1。
氟虫腈R=SOCF3
氟甲腈R=CF3
氟虫腈砜R=SO2CF3
氟虫腈亚砜R=SCF3
图2-1氟虫腈及其代谢物结构图
2.3.2氟虫腈及其代谢物在环境的归趋
2.3.2.1氟虫腈在水体中的降解
氟虫腈在水溶液降解过程中,水环境的pH是引起降解的主要影响因子,水解动力学符合第一降解方程。
氟虫腈在酸性(pH5.5)和中性条件下稳定,而在pH9.0下的半衰期是770h、pH10.0是114h、pH11.0是11h、pH12.0是2.4h。
RPA200766是惟一检测到的水解产物,水解反应的机理是-OH亲核加成到极性的腈键,产生亚胺键并能互变异构成氨基化合物。
在氙灯照射下氟虫腈在酸性(pH5.5)水溶液中的降解产物有MB46513和RPA104615(结构见表2-2),光解反应常数为0.11h-1(MB46513)和0.05h-1(RPA104615),降解反应的过程中是脱硫反应和氧化反应[1]。
但是在简单的水生态系统和模拟的稻田生态系中,氟虫腈主要形成MB46513和MB46136以及一些微量的极性产物,这一结果可能与环境中的微生物有关[2]。
朱国念等发现在稻田生态系统的水体中氟虫腈主要通过光解和水解作用降解为MB46513和RPA200766;水体中的降解为光解>水解>还原作用;稻田环境中氟虫腈4种主要代谢物比原药降解快[3]。
表2-1氟虫腈及其已知代谢物结构通式
2.3.2.2氟虫腈在土壤中的环境行为
在稻田生态系统中,在土壤中则以氧化产物MB46136和水解产物MB45950(结构见表2-1)为主,由于土壤微生物的存在,可以认为氟虫腈在土壤中的降解是生物和非生物因子共同作用的结果;在水稻植株中转化为氧化产物MB46136和还原产物MB45950,表明植株体内氧化-还原酶系的代谢作用是氟虫腈降解和转化的主要因子。
在稻田生态系中,代谢产物的出现比氟虫腈亲体化合物滞后2~3d;土壤中的降解过程中水解>氧化>光解>还原作用;植株中的降解过程中氧化>还原作用[3]。
2.3.3.3氟虫腈毒性作用机理
氟虫腈与第一代氯离子通道阻断性杀虫剂来相比,氟虫腈显然具有更加优越的选择性。
氟虫腈是作用于α-氨基丁酸受体(GABA),从而起到阻断由GABA控制的神经膜氯离子通道的作用,所以对多种经济害虫都具有防治作用。
研究人员用原始培养的大鼠背神经后根神经节元进行单通道电压箱的实验,通过实验阐明了氟虫腈对于GABA单通道的作用机制,氟虫腈能够缩短开放GABA的时间,并且延长GABA关闭的时间,即降低通道开放的频率来达到抑制GABA的效果,是引起的全细胞电流的原因[4-6]。
2.4果蔬样品前处理技术
果蔬样品前处理以及检测是产品中农药残留分析的两个主要部分,其中果蔬样品前处理在整个分析过程中起着异常关键的作用。
对于UPLC-MS/MS而言,样品的前处理技术尤其关键,如果前处理净化不彻底会对分析仪器的灵敏度造成很大影响,进而影响结果的准确性和重现性。
目前,前处理方法主要包括固相萃取、QuEChERS方法(分散固相萃取)、液相萃取、固相微萃取、基质固相分散、液相微萃取、超声辅助萃取、微波辅助萃取、加压溶剂萃取以及凝胶渗透色谱。
固相萃取和QuEChERS方法以其优越的重现性、准确性和高效性被越来越广泛地应用于菜和水果中农药残留的同时测定[7]。
2.4.1固相萃取
2.4.1.1固相萃取法概述
固相萃取法,又称Solid-PhaseExtraction,简称SPE,是近几年来快速发展起来的一种样品的前处理技术,经由固液萃取与柱液相色谱技术互相结合得来,其主要用于样品的分离、纯化与富集,固相萃取与传统的液液萃取比较,固相萃取法明显提高了分析物的回收率,并且更加有效的将干扰组分与分析组分分隔,从而达到了减少样品前处理的过程、步骤,使得操作更简便、更省时。
2.4.1.2固相萃取法的基本原理和方法
固相萃取法(SPE)基本原理和方法:
固相萃取法(SPE)是基于液-固相色谱理论,使用选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行分离、纯化与富集,是一种包括了固相以及液相的物理萃取过程,也可以把其视作一种简单的色谱过程。
SPE利用了选择性吸附和选择性洗脱的液相色谱法分离原理。
比较常用的方法是使液体的样品通过某种吸附剂,保留其中被测的物质,再选择使用适当强度的溶剂洗去杂质,然后用少量的良溶液去洗脱被测物质,达到快速分离净化以及浓缩的目的。
或者可同时吸附被测物质与杂质,然后再选择使用合适的溶剂来选择性地洗脱被测物质。
2.4.2QuEChERS方法(分散固相萃取)
2.4.2.1QuEChERS方法概述
QuEChERS方法(Quick快速、Easy简便、Cheap节约、Effective、Rugged耐用、Safe安全)是近几年来在国际上发展起来最为先进的一种对于农产品检测的快速样品前处理技术,其在2003年被美国农业部Anastassiades教授等开发出来的一种先进的技术。
2.4.2.3QuEChERS方法原理
QuEChERS方法的原理:
使用乙腈作为提取剂萃取,然后使用萃取盐使得液-液分层,之后使用分散固相萃取,然后使用PSA以及其他吸附剂进行净化处理,从组分里除去脂肪酸、碳水化合物、色素,经过离心处理后,取得上层液进行分析。
其简单来说,原理跟固相萃取(SPE)和高效液相色谱(HPLC)相类似,其都利用了吸附剂的填料与基质当中的杂质相互的作用,吸附其中的杂质并且以此来达到净化除杂的目的。
2.4.2.3QuEChERS方法的优点
使用QuEChERS方法的优点比较多,其中优点可以在其名称中直接看出Quick快速、Easy简便、Cheap节约、Effective、Rugged耐用、Safe安全,另外此方法还具有以下的优势:
(1)回收率比一般的方法要高,对于含有大量极性以及挥发性强的农药种类的回收率基本大于85%;
(2)准确度以及精确度较高,并且可以使用内标法进行校正;
(3)能够使用分析的农药种类多、范围广,其中包括非极性与极性的农药种类都能够利用该技术得到比较好的回收率;
(4)该方法分析速度快,能够在30min之内完成6个样品的处理;
(5)各种溶剂的使用量相对较小,对于环境污染小,价格比较廉价而且不需使用含氯化物的溶剂;
(6)操作起来简单方便,不需要受过专业培训或较高技能就能够很好地完成工序;
(7)乙腈加到容器后便马上密封,工作人员接触的机会大大减少,减少对人体的危害;
(8)在样品的制备过程当中基本不使用玻璃器皿,装置非常的简单。
2.4.3液相微萃取
2.4.3.1液相微萃取概述
液相微萃取(LiquidPhaseMicroextraction,LPME)技术被开发于1996年,作为一项新型的环保样品前处理技术,其伴随着环境的分析技术的进步而发展起来,其具有快速、灵敏度高以及精确的优点。
该技术集萃取、浓缩和
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