分子实验室试验操作.docx
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分子实验室试验操作.docx
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分子实验室试验操作
分子实验室行为规则
分子生物学实验室,首先要保持一个整洁的环境。
微小的污染就有可能影响整个实验结果。
1.保持个人及环境整洁
2.每种仪器和材料使用完后要归位
3.实验材料不要放在书桌台上,以免污染个人学习空间
4.试验结束后,不用的材料要及时处理,有毒物质特殊处理,不要随便倒入水槽中,保持操作台的干净整洁
5.本实验室所用的许多试剂如酶类等都需要低温保藏,拿取注意尽量快速,并放置于冰盒使用,不要在外部环境停留过久。
6.很多试剂比较昂贵,使用时不要污染,每取一次要换取样匙或枪头等
7.希望大家珍惜使用各种实验仪器和物品
在实验过程中,遇到问题及时向周围的老师和同学请教。
我们要为自己创造一个团结和谐的工作环境。
实验室基本仪器和使用注意事项
微波炉:
由于经常在其中溶化凝胶,可能污染有EB,请勿在其中加热其他物品
光学显微镜:
使用前后将镜头搽干净,勿忘关闭电源,盖上罩布
冰箱:
使用时请注意将冰箱门关紧,如有过多结霜及时处理
离心机:
样品管要平衡好后使用
天平:
请勿超过量程,使用后保持清洁,称量匙使用后清洗干净
电泳槽:
使用后清洗干净
复日成像系统:
使用前后将台面用酒精棉搽洗,使用后及时将UV灯关闭,以延长其使用寿命
超净台:
使用时可将操作用品放置其上,使用后请保持台面清洁,并清理出自己物品,以防影响其他人员使用
水槽:
请勿将固体垃圾倒入其中,平时注意保持其干净。
总之,好的工作环境要大家共同创造和维护,希望各位能尽自己一份力量。
本实验室保藏的基因工程菌株和载体
菌株
有关特征
来源
大肠杆菌
(E.coliC600)
常用于制备裂解物和增殖λgt10的琥珀抑制型菌株
染色体上具有nal基因
上海来益生物药物研发中心
大肠杆菌
(E.coliJM110)
一种琥珀抑制型F’菌株,该菌株对GATC序列的腺嘌呤不甲基化,支持M13噬菌体载体的生长。
该菌株中的F’带有lacZΔM15,后者可使得与再λZAP中编码的β-半乳糖苷酶的氨基端进行α-互补。
上海来益生物药物研发中心
大肠杆菌
(E.coliBL21(DE3))
该菌株用于高效表达T7噬菌体启动子控制下的基因表达。
T7噬菌体RNA聚合酶位λ噬菌体DE3区,该区整合于BL21的染色体上。
上海来益生物药物研发中心
大肠杆菌
(E.coliDH5α)
有一种用于铺制平板培养质粒和hsdR17、recA1、endA1gyrA96thi-1relA1黏粒的重组缺陷琥珀抑制型菌株。
其中lacZΔM15突变可于pUC载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α互补
上海来益生物药物研发中心
质粒
大小(kb)
有关性状
来源
pBluscriptⅡKS+
2.9
ampr,lacZ+,KS
上海来益生物药物研发中心
pLY1
3.8
ampr
本实验室构建
质粒
大小(kb)
有关性状
来源
pYG5
3.9
ampr
上海来益生物药物研发中心
pLY1
3.8
ampr
本实验构建
pLY2
4.8
ampr
本实验构建
质粒
有关特征
来源
pUC19
2.686Kb,LacZ
本实验室
pKC1139
为大肠杆菌和链霉菌穿梭质粒,
Amr,G418r
由中国科学院北京微生物研究所谭华荣博士馈赠
pLY32
pUC19带有含aveD基因共888bp的片段
本实验构建
pLY33
pUC19带有含△aveD约620bp的片段
本实验构建
pLY34
pKC1139带有含△aveD约620bp的片段
本实验构建
菌株
有关特征
来源
大肠杆菌
(E.coliDH5α)
SupE44supF58hsdS3(rBmB)dapD8LacY1glnV44(gal-uvrB)47tyrT58gyrA29tonA53(thyA57)
本实验室
大肠杆菌
(ET12567/pUZ8002)
RP4因子
上海生物工程研究中心
除虫菌素链霉菌
(Streptomycesavermitilis)
doramectin产生菌
本实验室
大肠杆菌相关操作
培养基:
LB培养基(g/L)
胰蛋白胨
10
酵母抽提物
5
NaCl
10
pH
自然
LB固体培养基,另加入1.6%的琼脂粉
2×YT培养基(g/L)
胰蛋白胨
16
酵母提取物
10
NaCl
5
pH
7.0
去离子水先定容至900ml,振荡完全溶解,再用5mol/L的NaOH调pH至7.0,再定容至1L,在15磅蒸汽灭菌20min
菌种的培养和保藏
(1)大肠杆菌接种于LB培养基,37℃振荡培养过夜,带质粒的菌株在培养时,培养基中加入相应的抗生素,以保证质粒的存在。
(2)菌种一般采用甘油冷冻保存法,即将新鲜菌悬液加入等体积无菌20%甘油,混匀后置于-20℃保藏;也可斜面和平板保存,在一个月内使用有效,不可斜面或平板连续传代;也可冻干管保存,预先准备好斜面交于保藏人员保存。
保存菌株要做好标记并记下来源。
微量制备大肠杆菌染色体
所需溶液配制:
(1)TE缓冲液[5]:
Tris-HCl
10mmol/L,
EDTA
1mmol/L,
pH
8.0
(2)50×TAE[5](电泳缓冲液)(/L):
Tris
242g,
冰醋酸
57.1ml
EDTA(0.5mol/L,pH8.0)
100ml,
加去离子水定容至1000ml
(3)酚/氯仿溶液(1﹕1,V/V)
重蒸酚经过0.01mol/LTris-HCl溶液(pH8.0)平衡后和氯仿等体积混合,上面覆盖一层含有0.2%巯基乙醇的0.1mol/LTris-HCl溶液(pH8.0),该溶液4℃保存。
操作方法:
(1)将生长过夜的平板菌落接种于有5mlLB培养基的试管中,37℃振荡培养过夜;
(2)取1.5ml菌液于Eppendorf离心管,离心(4000rpm,10min,4℃),弃去上清,吸干残余液体,使沉淀尽可能干燥;
(3)加入467μl的TE缓冲液(pH8.0)重悬菌体,然后加入30μl10%SDS和9μl(10mg/ml)的蛋白酶K,混匀,37℃水浴1h;
(4)加入等体积的苯酚/氯仿(v/v,1∶1),混匀,离心(12000rpm,2min);
(5)取上层清液于另一离心管,若中间蛋白层较厚,重复(4)操作;
(6)加入1/10体积的醋酸钠(3mol/L,pH5.4)和0.6体积的异丙醇,轻轻混匀至DNA沉淀;
(7)用封口毛细管缠起染色体DNA;
(8)用1ml70%的乙醇洗涤染色体DNA30s;
(9)重悬染色体于1mlTE缓冲液,经适当稀释后,经琼脂糖凝胶电泳检测,并分别于260nm和280nm测DNA样品的A值,样品保存于4℃冰箱中。
用光路为1.0cm比色杯测量DNA的浓度时,可根据如下公式计算[6]:
DNA(μg/ml)=A260×50×稀释倍数
碱变性法微量制备质粒
所用溶液配制:
(1)TE缓冲液[5]:
Tris-HCl
10mmol/L,
EDTA
1mmol/L,
pH
8.0
(2)50×TAE[5](电泳缓冲液)(/L):
Tris
242g,
冰醋酸
57.1ml
EDTA(0.5mol/L,pH8.0)
100ml,
加去离子水定容至1000ml
(3)酚/氯仿溶液(1﹕1,V/V)
重蒸酚经过0.01mol/LTris-HCl溶液(pH8.0)平衡后和氯仿等体积混合,上面覆盖一层含有0.2%巯基乙醇的0.1mol/LTris-HCl溶液(pH8.0),该溶液4℃保存。
(4)碱变性法微量制备质粒用溶液[1]:
SolutionI:
葡萄糖50mmol/L,EDTA10mmol/L,Tris-Cl25mmol/L,pH8.0
SolutionII:
NaOH0.2mol/L,SDS1%现制现用
SolutionIII:
5mol/LKAc60ml,冰乙酸11.5ml,重蒸水28.5ml
操作方法:
(1)将生长过夜的平板菌落接种含一定浓度相应抗生素LB培养液中,37℃振荡培养过夜;
(2)取1.5ml菌液于Eppendorf离心管,离心(12000rpm,30s),弃去上清,吸干残余液体,使沉淀尽可能干燥。
(3)将细菌沉淀重新悬浮于100μl溶液Ⅰ,于涡旋混合器上剧烈振荡使菌体分散。
(4)加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ,盖紧盖子后,轻轻颠倒管子数次使溶液Ⅱ与菌体充分接触,以便细胞裂解至透明粘稠状,冰浴约5分钟;
(5)加150μl溶液Ⅲ,剧烈振荡后,放置3~5min,使白色絮状物充分沉淀,冰浴约5分钟。
(6)离心(12000rpm,5min),小心吸取上清,转移到另一个离心管中,加入等体积的苯酚/氯仿(1:
1)
(7)离心(12000rpm,2min),小心吸取上清,转移到另一个离心管中,加入20μl氯仿,于旋涡混合器上短时间混合。
(8)离心(12000rpm,2min),小心吸取上清,转移到另一个离心管中,加入0.6倍体积异丙醇(或2倍体积分析纯的无水乙醇),振荡混合,沉淀双链DNA,室温放置10min。
(9)离心(12000rpm,5min),弃去上清,吸干残余液体。
(10)70%乙醇洗涤质粒沉淀一次,吸干残余液体,使沉淀干燥。
(11)用50μl含无DNA酶的RNase(20μg/ml)的TE重新溶解沉淀,于37℃保温2h除去RNA。
电泳检测。
提取的质粒于-20℃保存。
注:
(6)(7)步可根据需要操作或省略
DNA的酶切
无论是大肠杆菌的染色体或质粒,进行酶切验证是必不可少的。
将酶切反应液于适当温度反应1~2h,加入1/10体积的loadingbuffer终止反应,然后于琼脂糖凝胶电泳检测。
DNA酶切反应体系
Composition
Volume(μl)
Plasmid
1~7
ddH2O
6~0
10×Buffer
1
RestrictionEnzyme
0.5
TotalVolume
10
E.coli质粒的纯化
操作方法:
(1)加入等体苯酚/氯仿抽提1~2次,振荡混匀,离心(12000rpm,2min),取上清液。
(2)用氯仿抽提1次,振荡混匀,离心(12000rpm,2min),取上清液。
(3)加入1/10体积的3mol/L乙酸钠和0.6倍体积的异丙醇,混匀,室温放置10min。
(4)离心(12000rpm,5min),弃去上清,吸干残余液体。
(5)用1ml70%乙醇洗涤沉淀1次,吸干残余液体,使沉淀干燥。
(6)用25μl的TE缓冲液重新溶解沉淀。
大肠杆菌感受态细胞的制备[5]
(一)CaCl法
所用溶液配制:
CaCl2溶液:
100mmol/L,pH8.0
操作方法:
(1)用新鲜生长的平板单菌落或甘油冷冻保存菌液50μl接种装有2mlLB液体培养基的小试管,37℃振荡培养过夜。
(2)以1%接种量将菌液接种装有20mlLB液体培养基的250ml三角瓶,于37℃振荡培养2~4h,控制A600在0.3~0.5。
(3)将菌液于冰浴放置10min,离心(4℃,8000rpm,5min)沉淀菌体,倾去培养基,倒置离心管,使残余的培养基流出。
(4)将菌体悬浮于10ml冰浴预冷的0.1mol/LCaCl2溶液,置于冰浴30min。
(5)离心(4℃,8000rpm,5min)沉淀菌体,倾去上清液,倒置离心管,使残余的液体流出。
(6)悬浮感受态细胞于1ml冰浴预冷的0.1mol/LCaCl2溶液中,置于4℃冰箱过夜。
新鲜制备和4℃存放过夜的感受态细胞都可直接用于转化。
或用液氮速冻后置于-70℃保存。
(二)TSS法
1.2×TSS:
LB培养基含20%PEG4000,10%DMSO,40~100mmol/LMg2+,pH6.5
2.TSE缓冲液:
Tris-HCl25mmol/L,EDTA25mmol/L,蔗糖0.3mol/L,pH8.0
1.用新鲜生长的平板单菌落或甘油冷冻保存菌液接种装有5mlLB液体培养基的小试管(10×150mm)于37℃摇床培养过夜;
2.将200l菌液接种装有20mlLB液体培养基的250ml摇瓶,37℃,225r/min培养约2小时,控制OD600在0.3~0.4;
3.直接加入20ml冰预冷的2×TSS,或是移入50ml离心管,4℃,8000r/min离心10分钟,所得沉淀用2ml冰预冷的TSS悬浮,分装置于-70℃保存。
(三)TF法
TF缓冲液(g/450ml)
PIPES
1.5,
CaCl2·2H2O
1.1
KCl
9.3,
pH
6.7
补加蒸馏水至450ml,高压灭菌。
5.995gMnCl2·4H2O溶解于55ml蒸馏水中,0.22μm微孔滤膜过滤除菌后,取50ml与上述配制的450ml溶液混合。
(1)从平板上挑取单菌落接种于2mlLB液体培养基中,37℃振荡培养过夜。
(2)以0.2%的接种量接种于100mlSOB液体培养基中,18℃振荡培养,控制OD600在0.4~0.8,对于E.coliJM109约20h。
(3)冰浴10min,离心(5000r/min,10min,4℃),弃去上清。
(4)加入33ml预冷的TF缓冲液,将菌体重新悬浮,冰浴10min。
(5)离心(5000r/min,10min,4℃),弃去上清。
(6)加入8ml预冷的TF缓冲液,将菌体重新悬浮。
(7)缓慢加入0.6mlDMSO(终浓度为7%),混匀,冰浴10min。
(8)分别于每个Eppendorf离心管中装入100μl。
置于液氮中速冻,-80℃保存。
大肠杆菌质粒的转化(CaCl2法)[5]
(1)吸取100μl感受态细胞于预先置于冰浴的Eppendorf离心管,加入适量质粒DNA,用手指轻叩管底使混合,置于冰浴30min。
(2)于42℃恒温水浴“热激”60s~90s,立即置于冰浴2min。
(3)加入0.8mlLB培养基,混匀,然后移入一个小玻璃试管,于37℃振荡培养1h后,取100μl涂布于含有IPTG和X-gal的LB/Amp的平板上(蓝白塞选所用培养基)。
(4)挑选白色转化菌落进一步分析。
为验证感受态细胞的活性,将感受态细胞涂布于不含抗生素的平板作为对照,并将常用质粒进行转化也作为对照平板。
转化(蔡启封论文)
取宿主菌BL21(DE3)按1:
150接种至3mlLB,370C培养过夜,按1/100的比例接种过夜培养液至3mlLB,37℃摇至OD650为0.4~0.5(约3hr)。
取1.5ml菌液,冰浴30sec,3500转离心5min。
加入T1buffer(NaCl10mmol/L,MnCl250mmol/L,NaAC-HClpH5.610mmol/L)300ul,冰浴20min,3500转离心5min。
沉淀加T2buffer(MnCl2100mmol/L,NaAC-HClpH5.610mmol/L,CaCl275mmol/L)30ul,用tip冲匀菌体后,加2ul酶连反应液,分散均匀后冰浴30min,42oC水浴(静置)90sec,转置冰浴1~2min,加1.0mlLB置37oC静置培养1.0h,3000转离心5min,弃上清液留至100ul,涂于LB+Kan(Kanamycine100ug/ml)琼脂平板,37oC倒置培养过夜。
DNA片段的回收
所用溶液配制
(1)PBS缓冲液[5](g/L):
NaCl
8,
KCl
0.2,
Na2HPO4
1.44,
KH2PO4
0.24,
pH
7.4
(2)Glass-milk溶液(100mg/ml):
取1gsilica(Sigma)悬浮于10mlPBS(pH7.4)缓冲液中,室温放置2小时后倒掉上清,加入10mlPBS缓冲液,搅拌,放置2小时,最后于2000g×2min离心,将沉淀悬浮于5ml6mol/LNaI和5mlddH2O中,1ml等量分装,4℃保存
(3)NewWash缓冲液:
NaCl
50mmol/L,
EDTA
2.5mmol/L(pH7.5),
Tris
10mmol/L(pH7.5),
乙醇
50%(V/V)
操作方法:
(1)将DNA电泳凝胶于长波长(302nm)紫外灯下,切出含所需DNA片段的凝胶,装入预先称重的eppendorf离心管,称出凝胶重量;
(2)加入三倍凝胶重量的6mol/LNaI,于45℃水浴保温5min,期间,振荡离心管1~2次,使凝胶完全溶解;
(3)取出GlassMilk溶液于涡旋混合器剧烈振荡使GlassMilk悬浮均匀,吸取5μlGlassMilk溶液到上述的离心管,于涡旋混合器混匀。
置于冰浴5~10min,并每隔1~2min振荡离心管,使GlassMilk均匀悬浮,使得DNA吸附。
(4)离心(15,000rpm,5s),沉淀GlassMilk,倾去上清液。
(5)加入200μl冷冻保藏(-20℃)的NewWash溶液于涡旋混合器悬浮GlassMilk,离心(15,000rpm,5s)洗涤三次,最后一次需吸干管底残余的NewWash溶液。
(6)加入5~10μl无菌蒸馏水,振荡使GlassMilk悬浮,放置45℃水浴保温2min,洗脱吸附的DNA,离心(15,000rpm,5s),将洗脱液移入一个新的离心管,洗脱三次,合并三次洗脱液。
(7)离心(15,000rpm,5s),沉淀可能带入的GlassMilk,将洗脱液移入一个新的离心管。
此时,洗脱液可直接用于连接或酶切反应。
质粒与外源片段的连接
连接反应组成
应组成
体积
Vector
0.1µg
外源DNA片段
0.3~1.0µg
ddH2O
补足8.5µl
45℃水浴5min,立即至于冰浴2min
10×T4buffer
1µl
T4DNAligase
0.5µl
连接液于16℃过夜反应,然后进行转化。
注意:
载体和外源片段的摩尔比为1:
3~10比较好,提高连接效率。
连接体系在10~15µl为宜。
平端连接需要在此基础上加大载体和外源片断以及连接酶的用量。
放线菌相关操作
培养基:
MS琼脂培养基(g/L)
甘露醇
20
黄豆粉
20
琼脂粉
20
pH
自然
先将甘露醇溶解于适量水中,再加入到含有相应量琼脂和黄豆粉的三角瓶内,115℃,15min灭菌2次,两次之间振荡瓶子。
微量元素溶液(10×)(mg/100ml):
ZnCl2
40
Na2B4O7·10H2O
10
FeCl3·6H2O
200
(NH4)6Mo7O24·4H2O
10
CuCl2·2H2O
10
MnCl2·4H2O
10
高氏1号(G1)培养基(g/L):
可溶性淀粉
20
NaCl
0.5
K2HPO4
0.5
KNO3
1.0
MgSO4·7H2O
0.5
FeSO4
0.01
纯化琼脂粉
20
pH
7.4
R2YE培养基(g/L):
蔗糖
103
K2SO4
0.25
MgCl2·6H2O
10.12
葡萄糖
10
Difco酪蛋白氨基酸
0.1
TES
5.73
微量元素溶液(10×)
2ml
酵母抽提物
5
称取2.02克纯化琼脂放入250ml三角瓶中,倒入80ml上述溶液,塞上棉塞后高压灭菌。
使用时,将培养基融化,然后在每瓶中加入以下灭菌溶液:
KH2PO4(0.5%)
1ml
NaOH(1mol/L)
0.7ml
CaCl2(5mol/L)
0.4ml
软琼脂培养基:
同R2YE培养基,但琼脂粉含量为0.6%。
酵母、麦芽抽提物、葡萄糖(YMB)培养基(g/L):
酵母抽提物
4
葡萄糖
4
麦芽抽提物
10
微量元素溶液(10×)
200l
pH
7.2
YMA培养基:
在YMB培养基中加入纯化琼脂2%
YMA软琼脂培养基:
在YMB培养基中加入纯化琼脂0.6%
YEME液体培养基(g/L):
酵母抽提物
3
Polypepton
5
麦芽抽提物
3
葡萄糖
10
蔗糖
250
pH
自然
产孢培养基YMS(g/L)
酵母抽提物
1.5
可溶性淀粉
10.0
KNO3
1.0
琼脂粉
16
pH
7.2
P(原生质体制备)缓冲液(g/L)
蔗糖
103
K2SO4
0.25
MgCl2·6H2O
2.02
微量元素溶液
2ml
先加水定容至800ml,分装成80ml的等分样品,然后高压灭菌。
使用前,每瓶加入以下无菌组分:
KH2PO4(0.5%)
1ml
TES(5.73%,pH6.5)
10ml
CaCl2·2H2O(3.68%)
10ml
放线菌的培养和保藏:
链霉菌菌种通常接种于YMS,于28℃恒温培养4~6天,直至孢子丰满。
短期保藏采用斜面保存法:
将长好的斜面换上无菌橡皮疫苗瓶塞,装入塑料袋扎紧开口后,置于4℃冰箱或室温条件下保存1个月左右。
较长期的保存方法一般采取甘油冷冻保存法:
将孢子制备成孢子悬浮液,加入等体积无菌40%甘油,混匀后置于-20℃保藏。
长期保存采用冷冻干燥法法:
将孢子与脱脂牛奶混匀,分装冷冻玻璃管后,置于冷冻干燥机冻干,然后抽真空封口,置于4℃保藏。
带质粒的菌也可采用上述方法保存,但在培养菌种时,培养基应含有相应的抗生素,以保证质粒的存在。
除虫链霉菌染色体的提取
所用溶液:
SET缓冲液:
75mMNaCl,25mMEDTApH8,20mMTris-HClpH7.5
操作方法:
(1)用新鲜斜面孢子或0.1ml冷冻孢子液接种装有20mlYMB培养基的250ml的玻璃三角瓶中,于28℃,220rpm振荡培养36hr。
(2)离心(TG16-W,转子:
12×1.5ml,10000rpm,10min)收集菌丝体,用无菌水离心洗涤一次。
(3)菌丝体(约2g)重悬浮于5mlSET,经旋涡振散。
(4)加入溶菌酶至终浓度4mg/ml,于37℃水浴酶解1hr。
(5)加1ml10%的SDS和50l10mg/ml的蛋白酶K,于55℃水浴2hr,期间不时振荡。
(6)加4ml5mol/LNaCl和10ml氯仿,于
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