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双水相法萃取分离淀粉酶体系的初步研究要点
第28卷第3期
黑龙江大学自然科学学报
JOURNALOFNATURALSCIENCEOFHEILONGJIANGUNIVERSITY
Vol.28No.3June,2011
2011年6月
双水相法萃取分离α-淀粉酶体系的初步研究
董海莉,平文祥,葛菁萍
(黑龙江大学生命科学学院,微生物黑龙江省高校重点实验室,哈尔滨150080)
要:
采用PEG1500/(NH4)2SO4双水相体系,对双水相萃取法分离纯化米曲霉α-淀粉酶
pH值、PEG浓度、(NH4)2SO4浓度、NaCl浓度对α-进行了研究。
探讨了PEG分子量、淀粉酶的分
配系数Ka及回收率Yt的影响,并通过正交实验确定了几个因素的最优组合。
结果发现在pH=
摘
6.5,PEG1500浓度17%(重量比),(NH4)2SO4浓度12%,加入10%NaCl溶液的双水相体系中,α-淀粉酶分配系数Ka为3.738,酶回收率Yt为85.315%。
PEG1500/(NH4)2SO4双水相体系是一种高效、便捷的体系,为大规模的工业提纯α-淀粉酶提供了理论依据。
关键词:
双水相体系;分离;α-淀粉酶;正交实验
中图分类号:
Q503
文献标志码:
A
文章编号:
1001-7011(2011)03-0378-05
0引言
PhaseSystem,ATPS)指不同种类聚合物溶液混合或者聚合物水溶液和盐溶双水相萃取技术(AqueousTwo-[1]
液混合后,当聚合物和盐浓度达到一定值时混合液静置后分层产生的两液相或多液相系统,是近年来出现的很有发展前途的新型生化分离技术。
工业用酶的大量制备常采用硫酸铵盐析法、离心喷雾干燥法等方法,存在样品回收率低、分离材料或设备昂贵、样品处理量小、单一方法分离纯数较低等问题。
与一些传统的分离方法ATPS有以下特点:
体系含水量高,相比,两相界面张力极低,有助于保持生物活性和相际质量传递;上下相密度
[2]
能耗低;不存在有机溶剂残留。
目前已经有多差较小;分相时间短;易于连续操作和工程放大;处理容量大,
[3-6]
。
米曲霉α-种抗生素、核酸、病毒和蛋白质已成功的通过双水相进行分离淀粉酶在食品行业有着广泛的应
[7-8]
。
经盐析方法分离得到的米曲霉α-用,目前工业生产多采用固态发酵进行米曲霉α-淀粉酶的生产淀粉酶
常因含有较多杂质,且不能直接应用于食品工业中而有着局限性。
本文旨在研究米曲霉α-淀粉酶在PEG/(NH4)2SO4双水相中的分配行为和主要影响因素,为工业提取理论α-淀粉酶提供理论依据。
1
1.1
材料与方法
材料与试剂
C10,材料:
菌株米曲霉(Aspergilleasoryzae)HDF-分离自齐齐哈尔市拜泉县采集的农家豆酱中,黑龙江大
学生命科学学院微生物重点实验室保存。
PEG1500、PEG4000、(NH4)2SO4、NaCl、试剂:
PEG400、可溶性淀粉、牛肉膏、蛋白胨培养基;发酵培养基(g·L-1):
蛋白胨10、NaCl固体5,pH=7.0。
牛肉膏3、可溶性淀粉5、
-1
察氏培养基(g·L):
硝酸钠2、磷酸氢二钾1、氯化钾0.5、硫酸镁0.5、硫酸亚铁0.01、蔗糖30、琼脂20、自然pH。
1.2
仪器与设备
仪器:
岛津紫外可见分光光度计UVmini-1240岛津国际贸易上海有限公司。
收稿日期:
2011-01-13
基金项目:
黑龙江省科技攻关重大项目(GA07B401-6);科技创新人才研究专项资金优秀学科带头人资助项目(RC2010XK002028);黑龙江省教育厅重点项目(11551z011)
作者简介:
董海莉(1984-),女,硕士研究生,主要研究方向:
微生物分子生物学
E-mail:
gejingping512@yahoo.com.cn通讯作者:
葛菁萍(1972-),女,教授,博士,
第3期1.31.3.1
方法
董海莉等:
双水相法萃取分离α-淀粉酶体系的初步研究·379·
α-淀粉酶粗酶液的制备
将在28ħ察氏培养基培养96h的菌体用生理盐水洗脱两次,合并洗脱液。
将含有洗脱液的三角瓶
8-1
300r·min-1的摇床中进行孢子打散30min,在28ħ、制成单孢子悬液,调整菌液浓度至10个·mL,
28ħ、180r将制备好的单孢子悬液以2.5%(体积比)的接种量接于含有50mL发酵培养基的三角瓶中,
·min-1摇床培养96h。
将摇床培养完毕后的菌液置于离心机中10000r·min-1离心20min,弃去菌体,上清液即为粗酶液。
1.3.2
α-淀粉酶酶活力的测定
[9]
pH为6.0的NaH2PO4-柠檬酸缓冲液,1mL0.5%的可溶性淀粉溶在10mL的试管中加入2.5mL、
-1
60ħ水浴预热10min后,60ħ水浴保温5min后,液,加入n倍稀释的粗酶液5mL,加入1mL0.1mol·L
的H2SO4终止反应。
反应终止后,吸取2mL反应液与0.5mL0.5%稀碘液显色,测定OD620nm值。
与淀粉梯度标准曲线对照得反应液淀粉浓度后计算酶活力。
-1
5min水解可溶性淀粉1mg所需的酶量为1个酶酶活力单位定义(U·mL):
在pH=6.0、温度60ħ,
活力单位。
酶活力的计算公式:
(0.1%-C反)·n·1000,其中0.1%为底物浓度;C反为反应液淀粉浓度;n代表稀释倍数;1000为置换系数。
1.3.3
PEG/(NH4)2SO4双水相体系的制备
实验在室温下进行操作,体系总重10.0g,其中粗酶液占体系的50%(重量比),将50%PEG和(NH4)2SO4原溶液按照计算量加入体系中,加入适量的NaCl溶液,最后加入去离子水使体系达到10.0g。
将制备好的溶液装入10mL带刻度的离心管中,首先在震荡器上充分震荡混匀,然后在离心机中4500r·min-1离心4min。
取出后室温静置2min,mL),分相后根据刻度读出上下相的体积(Vt和Vb,用吸管吸取上U·根据α-淀粉酶酶活力的测定方法进行酶活的测定(Ut和Ub,相和下相液体各2mL于10mL试管中,
-1
mL-1)。
相比R=Vt·Vb-1,分配系数Ka=Ut·Ub,回收率Yt=R·Ka·(1+R)
-1
·100%。
1.3.4
PEG/(NH4)2SO4双水相系统双节线图
将不同分子量的PEG和(NH4)2SO4制成50%(重量比)的原溶液,准确称量一定量的PEG原溶液,加入10mL试管中,然后加入(NH4)2SO4原溶液,混合,继续加入(NH4)2SO4原溶液,直至试管出现混浊为止。
称量加入(NH4)2SO4原溶液的量,分别计算PEG和(NH4)2SO4原溶液在体系中的重量百分含量,再加入适量的去离子水,使体系变澄清,计算加入去离子水的重量,继续加入(NH4)2SO4原溶液,使体系再次变混浊,如此反复操作多次,分别计算体系达到混浊时PEG和(NH4)2SO4原溶液在体系中的重量百分含量,得出PEG/(NH4)2SO4双节线图。
1.3.5
PEG分子量及浓度对α-淀粉酶分配行为的影响
将不同分子量的PEG和(NH4)2SO4制成50%(重量比)的原溶液,体系总重10.0g,其中粗酶液占体系17%、20%、22%、25%、30%、32%、的50%。
固定(NH4)2SO4的浓度,将PEG的浓度分别设定为15%、
-1-135%。
按照计算量,将PEG和(NH4)2SO4原溶液,加入10mL试管中,用1mol·LHCl和1mol·L
NaOH溶液调节系统的pH值至7.0,体系总重不足10.0g时用去离子水补全。
制备好双水相系统后,进行α-淀粉酶的萃取分离。
1.3.6
(NH4)2SO4浓度对α-淀粉酶分配行为的影响
12%、14%、16%、18%、20%、22%,分别设定(NH4)2SO4的浓度为10%、其它实验固定PEG浓度不变,
条件均不改变,制备好双水相系统后,进行α-淀粉酶的萃取分离。
1.3.7
pH值对α-淀粉酶分配行为的影响
5.5、6.5、7.5、8.5,固定PEG和(NH4)2SO4浓度(重量比)均不变,分别设定pH值为4.5、其它实验条件均不改变,制备好双水相系统后,进行α-淀粉酶的萃取分离。
1.3.8
NaCl浓度对α-淀粉酶分配行为的影响
(NH4)2SO4浓度(重量比)均不变,pH=7.0,5%、10%、15%、固定PEG、分别设定NaCl浓度为0%、20%(重量比),其它实验条件均不变,制备好双水相系统后,进行α-淀粉酶的萃取分离。
·380·黑龙江大学自然科学学报第28卷
2
2.1
结果与讨论
PEG/(NH4)2SO4双水相系统双节线图由图1PEG/(NH4)2SO4系统的双节线趋势
9070503010
40.859
40.879
42.552
42.592
42.693
呈现双节线的对称性优于PEG400/(NH4)2SO4和PEG4000/(NH4)2SO4构成的系统。
另外,随着PEG分子量的增大,临界点C逐渐变小,即分相的浓度逐渐变小。
其原因是随着PEG分子量的增大,其疏水性不断增加,与(NH4)2SO4的憎水性间的差距加大,从而导致系统分相动力不断增强2.2
[2]
PEG(g)
PEG1500/(NH4)2SO4构成的系统所可以得出,
PEG4000
PEG1500PEG400
(NH4)2SO()4%
图1
Fig.1
PEG/(NH4)2SO4系统的双节线图
DoublenodellineofPEG/(NH4)2SO4’ssystem
。
PEG分子量对α-淀粉酶分配行为的影响PEG400对蛋白质的选择性较由图2可以得出,
[10]
Vaidya等差,也认为小分子量的PEG不适合分离
Ka
4.53.52.51.50.5
15
17
20
22
25
PEG浓度(%)
PEG400
PEG1500PEG400030
32
35
蛋白质。
使用PEG1500萃取时,α-淀粉酶有较高的分配系数Ka,高于使用PEG400萃取时的Ka,并且Ka>1.0,说明α-淀粉酶主要分配在上相,便于对α-淀粉酶做进一步的提纯工作。
同样可以得出,随着PEG分子量及浓度的不断增加,其疏水性不断变大,而α-淀粉酶是疏水性蛋白,致使α-淀粉酶开始向下相分配
[2]
图2Fig.2
不同浓度、分子量PEG对分配系数Ka的影响EffectsonpartitioncoefficientKaofdifferentconcentrationandmolecularweightofPEG
,分配系数Ka不再上升。
结合对系统双节
最终选用PEG1500作为双水相系统的线图的分析,组成成分。
2.3
不同浓度PEG1500对α-淀粉酶分配行为的影响pH为7.0条由表1可以得出,固定(NH4)2SO4浓度,随着PEG1500浓度的不断增加,酶回收率和分配系件下,
数逐渐升高。
当PEG1500浓度达到35%时,分配系数Ka有最大值4.219,酶回收率Yt为83.371%。
PEG浓度从15%30%,Ka变分配系数Ka上升幅度不大,达到30%,化趋于平缓。
鉴于PEG浓度过高,其疏水性增加,α-淀粉酶有向下相分配的趋势,对进一步的纯化造成不便。
最终选用浓度为20%PEG1500进行后续实验。
2.4
(NH4)2SO4浓度对α-淀粉酶分配行为的影响pH为由图4可以得出,当固定PEG1500浓度为20%,7.0条件下,当(NH4)2SO4浓度为12%时,分配系数Ka有最大值3.191,酶回收率Yt为75.81%。
随着(NH4)2SO4浓度的不断增加,分配系数Ka不断下降。
最终选用浓度12%(NH4)2SO4进行后续实验。
2.5
pH值对α-淀粉酶分配行为的影响
5710121517202225303235
表1Table1
不同浓度PEG1500对α-淀粉酶分配行为的影响
EffectsofdifferentconcentrationofPEG1500onpartitioningofα-amylase
分配系数Ka
1.8471.9971.9992.012.5522.9943.2963.3984.0084.1144.2154.219
酶回收率Y()t%
48.73159.99260.25365.97469.05570.09476.75577.16781.22182.44582.71283.371
PEG1500浓度(%)
选定系统组成为PEG1500浓度20%(重量比)/(NH4)2SO4浓度12%(重量比),研究pH值对α-淀粉酶分配行为的影响,结果如图5所示。
从图中可以看出,随着pH值的增大,分配系数Ka逐渐增大,当pH值为6.5时,分配系数Ka有最大值3.417,酶回收率Yt为77.45%。
此后分配系数Ka随pH值的增大而减小,最终选用pH=6.5进行后续实验。
第3期董海莉等:
双水相法萃取分离α-淀粉酶体系的初步研究·381·
3.5
543210
2.5
Ka
1
2
3
4
5
6
7
8
Ka
1.50.5
10
12
14
16
18
20
22
PEG浓度(%)(NH4)2SO4浓度(%)
图3不同浓度PEG1500对分配系数Ka的影响
EffectsofdifferentconcentrationofPEG1500onpartitioncoefficientK
a
Fig.4
图4(NH4)2SO4浓度对分配系数Ka的影响Effectsofdifferentconcentrationof(NH4)2SO4onpartitioncoefficientKa
Fig.3
43
Ka
3.53.33.12.9
4.5
5.5
6.5pH
7.5
8.5
2.7
5
10NaCl浓度(%)
15
20
210
Ka
图5pH值对α-淀粉酶分配系数Ka的影响Fig.5EffectsofpHonpartitioncoefficientKa
ofα-amylase
图6NaCl浓度对分配系数Ka的影响Fig.6Effectsofdifferentconcentrationof
NaClonpartitioncoefficientKa
2.6NaCl浓度对α-淀粉酶分配行为的影响
选定系统组成PEG150020%/(NH4)2SO412%,
表2因素-水平表Table2Factors-levers
水平PEG1500浓度(%)(NH4)2SO4浓度(%)pHNaCl浓度(%)
A
123
101720
B121620
C4.56.58.5
D0510
pH为6.5,研究NaCl浓度对α-淀粉酶分配行为的影响,结果如图6所示。
随着NaCl浓度的增加,分配系数Ka出现先升后降的趋势。
在此过程中,当NaCl的分配系数Ka最大,为3.433,酶回收率浓度为10%时,
Yt为82.729%。
由于加入NaCl后系统分相速度明显因此综合以上实验结果,最终选用浓度为10%的加快,
NaCl溶液加入双水相体系中。
2.7
正交试验
PEG1500浓度、(NH4)2SO4浓度、pH值、NaCl浓度均可对分配系数Ka产从以上实验结果中可以得出,
4
生影响。
结合以上实验得出的单因素最优条件,按照4因素3水平进行L9(3)正交实验,实验设计如表2所
示,结果如表3所示。
RA>RC>RB>RD,从表3中可以得出,因素对实验影响的主次顺序为ACBD,即PEG1500浓度影响最PEG浓度的改变可以大,其次是pH值,再次是(NH4)2SO4浓度,而NaCl浓度的影响最小。
前面已经提过,使得疏水性蛋白α-淀粉酶在体系中的分配系数Ka产生较大变化,成为影响分配系数Ka的影响其疏水性,
pH值能够影响蛋白质最主要原因。
由于粗酶液中所含蛋白质种类较多,且各种蛋白质的等电点均不相同,从而影响蛋白质与系统氢键和电荷效应所带电荷的种类和大小,
分配行为,使得pH值同样成为影响分配系数Ka的主要原因。
以A因素(PEG1500浓度)为例,其中KA2>KA1>KA3,可断定A2水平为A因素的最优水平,即PEG1500B1[(NH4)2SO4浓度为12%]的浓度为17%时分配系数Ka最大。
同理可判断出,水平为B因素的最优水NaCl浓度为10%]平;C2(pH=6.5)水平为C因素的最优水平;D3[水平为C因素的最优水平。
四个因素的(NH4)2SO4最优组合A2B1C2D3为本实验的最优组合,即双水相体系的最终构成为PEG1500的浓度为17%,浓度为12%,体系pH值为6.5,所加NaCl溶液浓度为10%。
利用此优化后的双水相系统提取α-淀粉酶,其
[11]
,最终影响α-淀粉酶在双水相体系中的
·382·黑龙江大学自然科学学报第28卷
分配系数Ka为3.738,酶回收率Yt为85.315%。
通利用(NH4)2SO4对α-淀粉酶进行盐析过比较发现,
酶回收率较低,仅为46%后酶活损失较严重,
76%[12-17]。
而利用吸附树脂提取α-淀粉酶的酶回收率也仅为61.1%69.5%
[18]
4
表3L(93)正交实验结果
4
Table3ResultsoforthogonaltestonL(93)
实验方案及实验结果
实验号
A
123456789K1K2K3k1k2k3极差R主次顺序优水平优组合
A21112223339.6429.9989.8163.2143.3333.2720.119
%%%%因素B12312312310.32610.10710.0083.4423.3693.3360.073A>C>B>D
B1A2B1C2D3
C2
D3
C1232313129.97510.1429.8633.3253.3813.2880.093
D1233122319.869.8110.0063.2873.273.3350.065
3.0553.4883.0993.7383.1893.0713.2513.4493.116分配系数(Ka)
。
3结论
本文通过对PEG分子量、PEG浓度、
(NH4)2SO4浓度、pH值、NaCl浓度等影响因素的研确立了源自AspergillusoryzaeHDF-C10的α-淀究,
粉酶在PEG1500/(NH4)2SO4双水相体系的分配行
当PEG分子量为为。
研究结果通过正交实验得出,
1500,双水相体系组成为PEG150017%,
pH为6.5,(NH4)2SO412%,加入10%NaCl溶液,
对α-淀粉酶的提取效果最好,分配系数Ka和回收率Yt分别为3.738%和85.315%。
同其他分离提取方法相比,α-淀粉酶酶活损失较少。
综上所述,PEG1500/(NH4)2SO4双水相体系分离提取α-淀粉酶是一套简便、高效、快捷的分离系统,对于α-淀粉酶的大规模工业提纯提供了有力的理论依据。
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