高考生物一轮复习讲义第40讲微生物的培养与应用.docx
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高考生物一轮复习讲义第40讲微生物的培养与应用
第40讲 微生物的培养与应用
1.微生物的分离和培养 2.某种微生物数量的测定 3.培养基对微生物的选择作用
4.利用微生物发酵来生产特定的产物以及微生物在其他方面的应用
培养基及微生物的纯化培养技术
1.培养基
(1)概念:
人们按照微生物对营养物质的不同需求,配制出供其生长繁殖的营养基质。
(2)营养组成:
一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。
此外,还需要满足微生物生长对pH、氧气以及特殊营养物质的要求。
(3)分类
2.无菌技术的主要方法及适用对象[连一连]
3.制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
(1)计算
↓
(2)称量
↓
(3)溶化
↓
(4)灭菌
↓
(5)倒平板
4.纯化大肠杆菌
(1)原理:
在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞,使其长成单个的菌落,这个菌落就是纯化的细菌菌落。
(2)主要方法及纯化原理
主要方法
平板划线法
稀释涂布平板法
平板示
意图
纯化原理
通过连续划线操作实现的
将菌液进行一系列的梯度稀释和涂布平板操作实现的
5.菌种的保藏方法
(1)临时保藏法:
对于频繁使用的菌种,先接种到试管的固体斜面培养基上培养,然后放入4℃的冰箱中保藏。
(2)甘油管藏法:
对于需要长期保存的菌种,先将菌液转入灭菌后的甘油中,混匀后放在-20℃冷冻箱中保存。
(选修1P18“旁栏小资料”改编)微生物的接种方法只有平板划线法和稀释涂布平板法吗?
微生物接种的核心是什么?
答案:
不是。
微生物的接种方法还包括斜面接种、穿刺接种等。
微生物接种的核心是防止杂菌污染,保证培养物的纯度。
如图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图,请分析下列问题:
(1)获得图A效果和图B效果的接种方法分别是______________、________________。
(2)某同学在纯化土壤中的细菌时,发现培养基上的菌落连成了一片,最可能的原因是______________________________________,为避免此种现象应当采取的措施是________________________________________。
(3)接种操作一定要在火焰附近进行是因为________________________。
答案:
(1)稀释涂布平板法 平板划线法
(2)菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灼烧灭菌 增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灼烧灭菌
(3)火焰附近存在着无菌区域
考向1 培养基及其制备方法和无菌技术的操作
1.牛奶中富含蛋白质,长期饮用有助于增强体质,但牛奶同时也是多种疾病的传播载体。
国家标准是每毫升牛奶中细菌数少于30000个。
以下是牛奶消毒及细菌检测实验。
分析回答下列问题:
(1)图中步骤①称为________消毒法。
步骤②是________。
(2)培养基中的蛋白胨可以为微生物提供__________。
进行步骤③操作时,应选用下列中的哪种工具?
______。
为了避免杂菌污染,此步骤应在________附近进行。
(3)将接种后的培养基和作为对照的________________同时放入37℃恒温培养箱中,培养36小时。
取出后统计各平板的菌落数,结果如下表所示。
应该选择其中稀释倍数为____________的平板进行计数,经过消毒后的牛奶中,细菌数大约是每毫升____________个。
牛奶稀释倍数
102
103
104
平板1菌落数
87
10
1
平板2菌落数
83
12
1
平板3菌落数
85
10
0
解析:
(1)80℃恒温水浴15min是巴氏消毒法,步骤②是进行系列稀释(或梯度稀释)。
(2)培养基中的蛋白胨可以为微生物提供碳源、氮源(和维生素),步骤③是接种,因为需要计数,则需用稀释涂布平板法,接种工具是涂布器;为了避免杂菌污染,此步骤应在酒精灯火焰附近进行。
(3)统计各平板的菌落数时,应选择菌落数在30~300的平板进行计数,经过消毒后的牛奶中,细菌数大约是每毫升(87+83+85)÷3×102=8500个。
答案:
(1)巴氏 系列稀释(或梯度稀释)
(2)碳源、氮源(和维生素) B 酒精灯火焰 (3)一个未接种的培养基 102 8500个
(1)培养基的配制原则
①目的要明确:
配制时应根据微生物的种类、培养目的等确定配制的培养基种类。
②营养要协调:
注意各种营养物质的浓度和比例。
③pH要适宜:
细菌培养基所需pH为6.5~7.5,放线菌培养基所需pH为7.5~8.5,真菌培养基所需pH为5.0~6.0,培养不同微生物所需的pH不同。
(2)微生物对主要营养物质的需求特点
①自养型微生物所需的主要营养物质是无机盐,碳源可来自大气中的CO2,氮源可由含氮无机盐提供。
②异养型微生物所需的营养物质主要是有机物,即碳源必须由含碳有机物提供,氮源也主要是由有机物提供,部分异养型微生物也可以利用无机氮源。
考向2 微生物的纯化技术
2.(2019·河北衡水中学调研)表格是某公司研发的一种培养大肠杆菌的培养基配方,请结合所学知识,回答下列相关问题:
成分
含量
蛋白胨
10.0g
乳糖
5.0g
蔗糖
5.0g
K2HPO4
2.0g
显色剂(伊红美蓝)
0.2g
琼脂
12.0g
将上述物质溶解后,用蒸馏水定容到1000mL
(1)根据用途划分,该培养基属于________培养基,若要分离能分解尿素的细菌,需对培养基作出的最关键的调整是______________,若还需鉴定分解尿素的细菌,需作出的调整是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)从培养基的成分上看,大肠杆菌的同化类型为__________。
该培养基能否分离筛选出大肠杆菌?
为什么?
________________________________________________________________________。
(3)在实验室培养微生物时,获得纯净培养物的关键是______________,紫外线可对空气进行灭菌的原因是__________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)某同学尝试纯化大肠杆菌,其中一个平板的菌落分布如右图所示,推测该同学接种时可能的操作失误是____________________。
解析:
(1)伊红美蓝是鉴定大肠杆菌的试剂,因此该培养基从用途上属于鉴别培养基;若要分离能分解尿素的细菌,则需要保证培养基中以尿素为唯一氮源,即将蛋白胨换成尿素;鉴定分解尿素的细菌,需要使用酚红指示剂。
(2)大肠杆菌需要从培养基中获得碳源,因此其同化作用类型是异养型;由于表格中的培养基中的碳源种类很多,可供多种微生物生存,因此该培养基不能分离筛选出大肠杆菌。
(3)微生物培养时,关键是防止外来杂菌的感染;空气中的细菌可用紫外线杀灭,其原因是紫外线能让蛋白质变性,同时还能破坏DNA的结构。
(4)由图可知,该同学采用的是稀释涂布平板法,但菌落比较集中,没有很好地分散开,可能是涂布不均匀导致的。
答案:
(1)鉴别 将蛋白胨换成尿素 将伊红美蓝换成酚红
(2)异养型 不能,原因是培养基中的碳源种类很多,可供多种微生物生存 (3)防止外来杂菌的入侵 紫外线能使蛋白质变性,还能破坏DNA的结构 (4)涂布不均匀
两种纯化细菌方法的比较
项目
优点
缺点
适用范围
平板划线法
可以观察菌落特征,对混合菌进行分离
不能计数
适用于好氧菌
稀释涂布平板法
可以计数,可以观察菌落特征
吸收量较少,较麻烦,平板不干燥效果不好,容易蔓延
适用于厌氧菌和兼性厌氧菌
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
(1)分离原理:
土壤中的细菌之所以能分解尿素,是因为它们能合成脲酶,这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到催化作用。
(2)统计菌落数目:
统计样品中的活菌一般用稀释涂布平板法。
2.实验流程
(1)土壤取样→富含有机质的土壤表层土
↓
(2)样品的稀释→通常选用一定稀释范围的样品液进行培养,以保证获得菌落数在30~300之间,适于计数的平板
↓
(3)接种→用稀释涂布平板法接种
↓
(4)培养
↓
(5)观察→根据菌落的特征区分微生物
↓
(6)计数→统计菌落的数目
↓
(7)计算→根据公式“每克样品中的菌落数=(C÷V)×M[C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数,V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL),M代表稀释倍数]”进行计算
3.分解尿素的细菌的鉴别
(1)方法:
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养分解尿素的细菌。
(2)原理
分解尿素的细菌
↓
CO(NH2)2+H2O
CO2+
变红色
(3)实验现象及结论
①培养基变红:
该种细菌能分解尿素。
②培养基不变红:
该种细菌不能分解尿素。
4.设置对照和重复
项目
对照
重复
目的
排除非测试因素对实验结果的影响
排除偶然因素对实验结果的影响
实例
空白对照:
确定培养基制作是否合格
同一稀释度涂布至少3个平板
(选修1P26“旁栏小资料”改编)细菌数目的测定还有哪些方法?
举例说明。
答案:
滤膜法。
测定饮用水中大肠杆菌的数目可以采用滤膜法。
考向1 考查微生物的选择培养
1.(2019·广东七校联合体高三联考)下面是筛选抗链霉素大肠杆菌的实验步骤及相关图解。
实验步骤:
①把大量对链霉素敏感的大肠杆菌接种在不含链霉素的培养基1的表面,进行培养。
②待其长出密集的小菌落后,用影印法接种到不含链霉素的培养基2上,随即再影印到含有链霉素的培养基3上,进行培养。
③在培养基3上出现了个别抗链霉素的菌落,将其挑选出。
请回答下列问题:
(1)配制培养基时除了满足基本的营养条件外,还需满足微生物生长对特殊营养物质、________、________的要求。
(2)从功能上看,含有链霉素的培养基属于________培养基。
若在培养基中加入伊红美蓝,则培养皿中长出的菌落颜色为________。
由图可知,1号培养基接种的方法为____________。
(3)对培养基2和3进行比较,在培养基2上找到与3上相应的菌落,挑取其中一个菌落接种到________(填“含链霉素”或“不含链霉素”)的培养基上,如果有较多的菌落出现,则说明该抗性基因突变发生在该菌接触链霉素之________(填“前”或“后”)。
(4)培养基3中的菌落比1、2中的菌落少很多,这说明基因突变具有________的特点。
解析:
(1)配制培养基时,在提供几种基本营养条件的基础上,还需满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
(2)链霉素是抗生素,对大肠杆菌具有选择作用。
在伊红美蓝培养基上,大肠杆菌菌落颜色为黑色。
由题图可知,1号培养基接种的方法为稀释涂布平板法。
(3)培养基2和培养基3上相同的菌落,是具有相同性状的大肠杆菌形成的,将培养基2中一个相应菌落接种到含链霉素的培养基上,若出现较多的菌落,则说明该抗性基因突变发生在该菌接触链霉素之前。
(4)抗链霉素性状是大肠杆菌基因突变后获得的性状,3号培养皿中的菌落比1号、2号中的菌落少很多,这说明基因突变具有低频性的特点。
答案:
(1)pH 氧气
(2)选择 黑色 稀释涂布平板法
(3)含链霉素 前 (4)低频性
选择培养基的制作方法
(1)在培养基全部营养成分具备的前提下,加入物质:
依据某些微生物对某些物质的抗性,在培养基中加入该物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物生长,如培养基中加入高浓度食盐时可抑制多种细菌的生长,但不影响金黄色葡萄球菌的生长,从而可将该菌分离出来;而在培养基中加入青霉素时可抑制细菌、放线菌的生长,从而分离得到酵母菌和霉菌。
(2)通过改变培养基的营养成分达到分离微生物的目的:
培养基中缺乏氮源时,可分离自生固氮微生物,非自生固氮微生物因缺乏氮源而无法生存;培养基中若缺乏有机碳源则异养微生物无法生存,而自养微生物可利用空气中的CO2制造有机物生存。
(3)利用培养基的特定化学成分分离特定微生物:
如当石油是唯一碳源时,可抑制不能利用石油的微生物生长,使能够利用石油的微生物生长,从而分离出能消除石油污染的微生物。
(4)通过某些特殊环境分离微生物:
如在高盐环境中可分离耐盐菌,其他菌在盐浓度高时易失水而不能生存;在高温环境中可分离得到耐高温的微生物,其他微生物在高温环境中因酶失活而无法生存。
考向2 微生物的分离与计数
2.(2019·四川眉山一中高三月考)水污染是全球性的环境问题,微生物降解是水污染治理的有效手段之一。
聚乙烯醇(PVA)是存在于化工污水中的一种难以降解的大分子有机物,PVA分解菌能产生PVA酶分解PVA,PVA与碘作用时能产生蓝绿色复合物,当PVA被分解时蓝绿色复合物消失,形成白色透明斑,请回答下列问题:
(1)要从土壤中筛选出能高效分解PVA的细菌,应采用以____________作为唯一碳源的选择培养基,实验中还应设置对照组。
将菌液稀释相同的倍数,对照组培养基上生长的菌落数目应明显____________(填“多于”或“少于”)选择培养基上的数目,从而说明选择培养基具有筛选作用。
(2)要测定土壤稀释液中微生物的数目,可在显微镜下用________计数板直接计数。
若将100mL含有PVA分解菌的土壤样品溶液稀释104倍后,取0.1mL稀释液均匀涂布在选择培养基表面,测得菌落数的平均值为160个,空白对照组平板上未出现菌落,则100mL原菌液中有PVA分解菌________个,该方法的测量值与实际值相比一般会________(填“偏大”“偏小”或“相等”)。
(3)要鉴定分离出的细菌是否为PVA分解菌,培养PVA分解菌的培养基中除了加入必需的营养物质外还需要加入________用于鉴别PVA分解菌。
要比较不同菌株降解PVA能力的大小,用含相同PVA浓度的上述培养基来培养不同菌株,一定时间后,通过测定______________来确定不同菌株降解PVA能力的大小。
解析:
(1)要从土壤中筛选出能高效分解PVA的细菌,应采用以聚乙烯醇(PVA)作为唯一碳源的选择培养基,目的是淘汰不能分解聚乙烯醇(PVA)的细菌。
实验中设置的对照组培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目,因为对照组没有淘汰不能分解聚乙烯醇(PVA)的细菌。
(2)在显微镜下计数微生物细胞的数量可直接用血细胞计数板计数。
根据题意,100mL原菌液中有PVA分解菌的数目为160÷0.1×104×100=1.6×109。
由于该方法得到的菌落可能是两个或者多个细菌共同产生的一个菌落,导致统计的菌落数较实际菌落数偏少,所以该方法的测量值与实际值相比一般会偏小。
(3)根据题干中鉴定PVA分解菌的原理“PVA与碘作用时能产生蓝绿色复合物,当PVA被分解时蓝绿色复合物消失,形成白色透明斑”可知,要鉴定分离出的细菌是否为PVA分解菌,培养PVA分解菌的培养基中除了加入必需的营养物质外还需要加入碘液用于鉴别PVA分解菌。
要比较不同菌株降解PVA能力的大小,用含相同PVA浓度的上述培养基来培养不同菌株,一定时间后,通过测定白色透明斑的大小(或直径)来确定不同菌株降解PVA能力的大小。
答案:
(1)聚乙烯醇(或PVA) 多于
(2)血细胞(血球)
1.6×109 偏小 (3)碘液 白色透明斑的大小(或直径)
两种计数方法的比较
项目
间接计数法
(稀释涂布平板法)
直接计数法
(显微计数法)
原理
当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌,通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌
利用特定细菌计数板或血细胞计数板,在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量
公式
每克样品中的菌落数=(C÷V)×M
C:
某稀释度下平板上生长的平均菌落数;V:
涂布平板时所用的稀释液的体积(mL);M:
稀释倍数
每毫升原液所含细菌数:
每小格平均细菌数×400×104×稀释倍数
缺点
当两个或多个菌体连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落
不能区分细胞死活
结果
比实际值偏小
比实际值偏大
分解纤维素的微生物的分离
1.纤维素与纤维素酶
(1)纤维素:
一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物,是地球上含量最丰富的多糖类物质。
(2)纤维素酶
①组成:
纤维素酶是一种复合酶,包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶三种组分。
②作用
纤维素
纤维二糖
葡萄糖
2.纤维素分解菌的筛选
(1)方法:
刚果红染色法。
(2)培养基:
富含纤维素的选择培养基。
(3)筛选原理:
纤维素分解菌
↓
→红色复合物
(4)菌落的挑选:
挑选产生透明圈的菌落。
3.实验流程及注意事项
(1)土壤取样:
富含纤维素的环境
↓
(2)选择培养:
用富含纤维素的选择培养基培养,以增加
↓纤维素分解菌的浓度
(3)梯度稀释:
制备系列稀释液,目的是使纤维素分解菌
↓ 的细胞分散开,以获得单个的菌落
(4)涂布平板:
将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上
↓
(5)挑选产生透明圈的菌落
研究人员在刚果红培养基平板上,筛选到了几株有透明降解圈的菌落,如图1所示。
将筛选到的纤维素酶高产菌株J1和J4在不同的温度和pH条件下进行发酵,测得发酵液中酶活性的结果如图2,请分析下列问题:
(1)图1透明圈形成的原理是_____________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)图中透明圈大小与____________________有关,降解纤维素能力最强的菌落是菌落____________。
(3)分析图2可知,______菌株在较高温度和酸性环境下酶的活性更高,更适合用于人工瘤胃发酵。
答案:
(1)刚果红可以与纤维素形成红色复合物,但并不与纤维素降解产物纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。
细菌分泌的纤维素酶能将培养基中的纤维素降解,形成透明圈
(2)纤维素酶的量和活性 ①
(3)J4
1.(2019·湖南长沙六校高三联考)木聚糖酶系可以将半纤维素(一种多糖)转化为单细胞蛋白及其他有用物质。
有些嗜热菌能产生耐热木聚糖酶,在食品工业上具有较高的潜在应用价值。
现欲从温泉中分离能分解半纤维素的嗜热菌,并从中筛选木聚糖酶高产菌株,获得耐热木聚糖酶。
回答下列问题:
(1)取适量体积的样品涂布在富含________的固体培养基上,置于65℃(原因是此温度是__________________)的培养箱中培养,菌落长出后,挑取单个菌落在培养基上用________________法接种培养,进行菌株的____________。
将得到的菌株接种到______(填“固体”或“液体”)培养基中富集。
(2)将富集后的菌株接种于固体培养基上,待菌落长出后用0.1%的__________染色1h,再用1mol/LNaCl脱色。
菌落周围会出现______,筛选__________的菌落即为木聚糖酶高产菌株。
解析:
(1)要从温泉中分离能分解半纤维素的嗜热菌,应该选用以半纤维素为唯一碳源的培养基;嗜热菌生活的适宜温度是65℃,因此应该置于65℃的培养箱中培养;进行菌株的分离纯化时,常用的接种方法为平板划线法或稀释涂布平板法;将得到的菌株接种到液体培养基中富集。
(2)在培养基中加入刚果红,可与培养基中的纤维素形成红色复合物,当纤维素被分解后,红色复合物不能形成,培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。
透明圈越大,说明分解能力越强,因此筛选透明圈(直径)大的菌落即为木聚糖酶高产菌株。
答案:
(1)半纤维素 嗜热菌生活的适宜温度 平板划线法或稀释涂布平板 分离纯化 液体
(2)刚果红 透明圈 透明圈(直径)大
2.(2019·湖北武汉江夏实验中学期中)为获得果胶酶高产菌株,科研人员进行了下列分离、筛选、鉴定工作。
回答下列问题:
(1)为分离果胶酶高产菌株,科研人员配制了下表所示成分的培养基,该表空白处的两种成分是______________。
制备的培养基常用________________法进行灭菌。
K2HPO4
MgSO4
NaNO3
FeSO4
琼脂
0.1g
0.5g
3g
0.01g
2g
15g
加至1L
(2)科研人员将采集的果园土壤放入无菌水中,振荡混匀,制成悬液。
为获得较均匀分布的单菌落,还需要将悬液进行________,用________法接种于固体培养基上。
接种后的培养基呈________状态放入培养箱。
(3)选择单菌落数目适宜的培养基,加入一定浓度的刚果红溶液(果胶与刚果红结合后显红色),一段时间后洗去培养基表面的刚果红溶液,观察并比较菌落的________直径的比值,筛选果胶酶高产菌株。
(4)将获得的菌株进行液体培养后,从培养液的________(填“上清液”或“沉淀物”)中获得粗提的果胶酶。
将一定量的粗提果胶酶与适量果胶溶液混合,一定时间后测定吸光值来测定酶活性。
进行吸光值测定时,需将____________________与等量果胶溶液混合,作为实验的对照。
解析:
(1)由题意可知:
该实验的目的是分离果胶酶高产菌株,因此培养基中需要加入果胶,在配制过程中需用蒸馏水定容,所以该表空白处的两种成分是果胶和蒸馏水。
制备的培养基常用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。
(2)为获得较均匀分布的单菌落,还需要将悬液进行梯度稀释,并用稀释涂布平板法接种于固体培养基上。
接种后的培养基呈倒置状态放入培养箱,以防止培养皿盖上凝结的水珠落入培养基造成污染。
(3)已知果胶与刚果红结合后显红色。
果胶酶产生菌分泌的果胶酶能够将培养基中的果胶水解,选择单菌落数目适宜的培养基加入一定浓度的刚果红溶液,一段时间后洗去培养基表面的刚果红溶液,因菌落周围的果胶被分解,无法形成红色的复合物而出现水解(或透明)圈,所以观察并比较菌落和水解(或透明)圈直径的比值,可筛选出果胶酶高产菌株。
(4)将获得的菌株进行液体培养后,从培养液的上清液获得粗提的果胶酶。
将一定量的粗提果胶酶与适量果胶溶液混合,一定时间后测定吸光值来测定酶活性。
进行吸光值测定时,需将等量失活的粗提果胶酶与等量果胶溶液混合,作为实验的对照。
答案:
(1)果胶和蒸馏水 高压蒸汽灭菌
(2)梯度稀释(或系列稀释) 稀释涂布平板 倒置 (3)水解(或
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