浙江查灭残存钉螺技术方案浙江血吸虫病防治中心.docx
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浙江查灭残存钉螺技术方案浙江血吸虫病防治中心
浙江省查治血吸虫病技术方案
(修订稿)
浙江省1995年达到血吸虫病传播阻断标准,但目前部分地区尚有残存钉螺,输入性传染源时有发现,存在着血吸虫病重新流行的威胁。
为巩固血防成果,根据《浙江省血吸虫病监测巩固方案(2007年修订版)》,结合我省血吸虫病防治现状,特修订本方案。
1查病对象
1.1内源性传染源当年查到钉螺自然村,对6岁以上人群和全部放养的牛、羊、猪等家畜普查1次;连年查到钉螺的村,每3年普查1次;查到感染性钉螺的村每年普查1次,连续3年;其他地区应结合门诊和各种体检开展传染源监测。
1.2外源性传染源
1.2.1范围有残存钉螺分布的乡(镇、街道);历史血吸虫病流行乡(镇、街道);其他有条件的地区。
1.2.2对象来自或往返于湖南、湖北、江西、安徽、江苏、四川、云南等省份尚未达到血吸虫病传播阻断县和疫情回升县人群及家畜,重点是渔民、船民、水产养殖、学生等人员,从疫区抗洪抢险归来人员等。
2血清学检查
2.1人群血清学检查采用间接红细胞凝集试验(IHA)、斑点金免疫渗滤试验(DIGFA)、乳胶微球免疫层析试验(DLIA)和酶联免疫吸附试验(ELISA),可根据情况任选1种。
2.1.1间接红细胞凝集试验(IHA)
基本原理:
可溶性血吸虫虫卵抗原吸附于红细胞表面,使红细胞致敏。
致敏红细胞表面吸附的抗原与待检血清中特异性抗体相结合,使红细胞被动地凝集起来,肉眼可见。
操作方法:
①在“V”型微量血凝反应板的第1孔中加生理盐水100μl,第2、3孔中各加25μl;②第1孔中加待检血清25μl,混匀后吸出25μl加入第2孔中,在第2孔中混匀后吸出25μl加入第3孔中,混匀后弃去25μl,此时第1、2、3孔中的血清稀释度依次为1:
5、1:
10、1:
20;③第2、第3孔各加致敏红细胞悬液25μl,将反应板放在振荡器上振荡1min,室温下静置45min,观察反应结果。
结果判断:
①阴性反应:
红细胞全部下沉在凹底部,形成紧密的圆点,周围整齐清晰;②阳性反应:
待检者血清以1:
10稀释度出现凝集反应为阳性起点。
反应强度:
“+”多数红细胞下沉在底部形成圆点,周围可见少量凝集红细胞;“++”凹底部可见明显的红点,凝集红细胞在底部形成小薄层;“+++”凹底部可见很弱的红点,红细胞呈疏松的颗粒凝集;“++++”红细胞呈明显的颗粒凝集,均匀散布于凹底部周围形成薄层,有时呈皱褶状。
注意事项:
①诊断试剂应保存在4℃,有效期12个月;②每次试验应作阳性血清、阴性血清及生理盐水对照,阳性血清效价达到1:
1280以上,试剂方可使用;③所用毛细吸管应校正至每滴等于25μl(即1ml为40滴);④反应板选择“V”型,底角应为90°;⑤反应板使用后,用自来水反复冲洗干净,再用蒸馏水冲洗2次,晾干即可,切勿用化学洗涤剂清洗。
2.1.2斑点金免疫渗滤试验(DIGFA)
基本原理:
受检血清中的特异性抗体与硝酸纤维素膜上的血吸虫抗原通过渗滤逐步反应,形成抗原-抗体复合物。
滴入金标记抗人IgG结合物,使与抗原-抗体复合物结合,出现红色斑点。
操作方法:
①在小盒中央孔膜上加A液(pH7.4PBS-Tween20)2滴(100μl),待渗入;②加受检血清25μl,待渗入;③加A液2滴,待渗入;④加B液(金标记抗人IgG)1滴(50μl),待渗入;⑤加入A液2滴,待渗入,观察结果。
结果判断:
膜上显现红色斑点为阳性,否则为阴性。
注意事项:
①每批试剂盒内,均设质控小盒,操作方法同上,但不加血清;②试剂应置4℃保存,有效期6个月。
2.1.3乳胶微球免疫层析试验(DLIA)
基本原理:
血清中抗血吸虫抗体在毛细作用下经聚酯膜与乳胶标记的抗人IgG单抗探针结合,继续向前,在硝酸纤维素膜的检测线(T线)被虫卵抗原捕获,出现红色条带。
多余的单抗探针向前则在质控线(C线)与羊抗鼠IgG结合,出现红色对照线。
操作方法:
吸取血清2滴(50l),垂直滴加于乳胶层析血吸虫抗体快速检测卡加样处,15min后观察结果。
结果判断:
T线和C线均显示红色为阳性;仅C线显示红色为阴性。
注意事项:
①检测卡4℃~30℃干燥保存,恢复至室温后1h内使用完毕;②C线未显示表明检测卡失效。
2.1.4酶联免疫吸附试验(ELISA)
基本原理:
受检血清中的特异性抗体在适宜条件下与载体的血吸虫抗原相结合,形成抗原-抗体复合物。
洗涤后加酶标记物,使与抗原-抗体复合物结合,然后加底物,由于酶的催化作用,使无色的底物显色。
操作方法:
①加待检血清:
血清用缓冲液(pH7.4PBS-Tween20)稀释成1:
200,分别吸100μl加入吸附有抗原的反应板凹孔内,置湿盒内37℃温育1h;②洗涤:
甩干反应板孔内的液体,用缓冲液注满各孔,3min~5min后再甩干孔内液体,如此反复洗涤3次;③加酶结合物:
每孔加适宜稀释的酶结合物100μl,置湿盒,同上法温育和洗涤;④加底物:
每孔加四甲基联苯胺(TMB)或邻苯二胺(OPD)底物溶液100μl,置湿盒,温育30min;⑤终止反应:
每孔加入2mol/L硫酸(H2SO4)50μl终止反应;⑥测定结果:
用ELISA检测仪测定,读取450nm(TMB)/492nm(OPD)波长的消光值。
结果判断:
P/N值≥2.1倍判为阳性。
注意事项:
①每块反应板均应设阳性及阴性标准血清作对照;②反应板中的洗涤液甩干后需立即加底物;③反应板保存在4℃,标准血清、酶结合物冷冻保存,酶结合物不宜反复冻融。
2.2家畜血清学检查可采用斑点金免疫渗滤试验(L-DIGFA)或斑点酶标三联试验(DETA)中的任1种方法。
2.2.1斑点金免疫渗滤试验(L-DIGFA)
基本原理:
将胶体金标记在血吸虫抗原上,形成抗原胶体金结合物,再与硝酸纤维素膜(NC)上吸附的抗血吸虫抗体特异结合,在反应处发生金颗粒聚集,形成肉眼可见的红色斑点。
操作方法:
①待检血清稀释:
吸取待检血清0.01ml,加生理盐水0.79ml,摇匀成80倍稀释的待检血清;或血纸浸泡稀释:
用直径0.55cm打孔器裁取待检血纸1片(0.24cm2),加生理盐水0.5ml浸泡30min,摇匀即成待检血纸浸出液;②用玻璃毛细管吸取稀释的血清或血纸浸出液,点样于反应板孔的NC上,每孔点2个样品,点样3min~4min后滴甲液(pH6.470.01MPBS-BSA-Tween20)封闭,每孔加1滴;③待甲液渗入NC后,滴乙液(金标记血吸虫抗原)反应显色,每孔加1滴;④待乙液渗入NC后,用丙液(蒸馏水)洗涤,每孔加1滴,观察结果。
结果判定:
红色斑点判为阳性;浅粉红色或黄色斑点判为阴性。
注意事项:
①试剂4℃保存,室温平衡1h后使用;②血清稀释液或血纸浸出液摇匀后取样;③反应宜在20℃~28℃进行。
2.2.2斑点酶标三联试验(DETA)
基本原理:
将日本血吸虫、伊氏锥虫、肝片吸虫抗原点在硝酸纤维素膜上,制成三联膜(下简称膜)。
膜上抗原与被检血样中相应抗寄生虫抗体结合,形成抗原-抗体复合物。
加兔抗牛IgG,再加酶联SPA,形成抗原-抗体-酶联SPA复合物。
加入底物,在酶的催化作用下,产生棕黄色斑点。
操作方法:
①加血样:
将0.24cm2待检血纸及膜放入装有1.5mlpH7.2PBS-Tween20的试管中,置37℃反应50min;②洗涤:
取出试管中的膜,放入洗涤器皿中,加洗涤液(pH7.2PBS-Tween20),洗涤3次,每次更换洗涤液,洗涤2min,最后去净洗涤液;③加兔抗牛IgG抗体(检测猪血样时省略):
用滤纸吸干膜表面水分,将膜放入装有兔抗牛IgG的器皿中,置37℃反应50min,同上法洗涤;④加酶联SPA:
用滤纸吸干膜表面水分,将膜放入装有酶联SPA的器皿中,置37℃孵育30min,同上法洗涤;⑤加底物:
用滤纸吸干膜表面水分,将膜放入装有底物溶液(0.5mg/ml的3,3-二氨基联苯胺液,加0.01%H2O2)的器皿中,室温反应1min~20min,待膜上出现任一清晰斑点后,用自来水反复漂洗至水清,即可目测判断结果。
结果判断:
无色为“-”,浅黄色为“+”,黄色为“++”,浅棕色为“+++”,深棕色为“++++”。
“++”以上判为阳性。
注意事项:
①三联膜、兔抗牛IgG抗体、酶联SPA试剂,置-20℃可保存10个月;②血纸应及时检测,否则须密封、干燥和低温保存。
3病原学方法
采用粪便尼龙绢袋集卵孵化结合沉渣镜检法,一送三检。
基本原理:
用尼龙绢袋收集成熟虫卵,在适宜的条件下卵内毛蚴活动增剧,不停地转动,最终破壳而出,在上层水中游动,可在三角烧瓶颈部观察到毛蚴。
操作方法:
①验收登记:
验看粪便的质量、数量及标签。
核对送检名单无误后,统一编号,然后在粪检名册上登记,并填写3张标签插入包粪纸中。
②淋水冲洗:
取3只三角烧瓶,在其颈部各套上1根橡皮筋,取粪包中的3张标签,各折成宽约1cm的长条,夹在三角烧瓶颈部的橡皮筋中。
取漏斗、压舌板、铜丝筛各1个,取尼龙绢袋1只,下口用夹子夹住。
将重约90g的大便分为3等份,先取1份大便置于40目/25.4mm~60目/25.4mm铜筛中淋水调浆,通过漏斗使粪液滤入260目/25.4mm的尼龙绢袋中,然后移去铜筛及漏斗,将漏斗用水洗后套在三角烧瓶上。
继续淋水冲洗袋内粪渣,用压舌板或竹筷轻轻振荡尼龙绢袋,使加速过滤,直至滤出液变清为止。
弃去尼龙绢袋下部夹子,将袋内的滤渣通过漏斗淋洗入三角烧瓶,加水满至瓶颈,放入25℃~30℃孵化箱(室)孵化。
另2份大便再按上法分别淋水冲洗。
观察毛蚴:
一般需观察3次,观察时间随温度高低而不同。
室温在30℃以上时,第一次观察可在孵化后1h,第二次在4h,第三次在8h。
室温在26℃~30℃时,可在孵化后4h、8h和12h各观察1次。
室温在20℃~25℃时,可在孵化后8h、12h和24h各观察1次。
如发现毛蚴,应用毛细吸管吸出,在显微镜下鉴定。
④沉渣镜检:
在孵化前或后吸取粪便沉渣涂片镜检,每份样本涂3片,检查血吸虫虫卵及其它寄生虫虫卵。
结果判断:
发现血吸虫毛蚴或虫卵即判为阳性。
注意事项:
①粪便必须新鲜、粪量每包90g,足量;②送检粪便冬季不能超过24h,夏季不宜超过12h;③包粪纸张要洁净,切勿用包过农药、化肥或其它化学药品的纸张;④孵化水要除去余氯和水虫;⑤防止交叉感染,一切用具每次使用后都要刷洗3次以上,清洗后用60℃~80℃的热水浸泡灭卵;⑥观察毛蚴时,应将烧瓶向光源,并衬以黑底板;⑦要注意毛蚴与水中原生动物的区别。
4诊断标准
4.1急性血吸虫病
4.1.1疑似病例应同时符合下列2条:
①发病前2周至3个月有疫水接触史;②发热、肝脏肿大及周围血液嗜酸性粒细胞增多为主要特征,伴有肝区压痛、脾肿大、咳嗽、腹胀及腹泻等。
4.1.2临床诊断病例应同时符合疑似病例和下列任1条:
①血清学试验阳性;②吡喹酮试验性治疗有效。
4.1.3确诊病例应同时符合疑似病例和粪检查获血吸虫虫卵或毛蚴。
4.2慢性血吸虫病
4.2.1临床诊断病例应同时符合下列3条:
①居住在流行区或曾到过流行区有疫水接触史;②无症状,或间有腹痛、腹泻或脓血便;多数伴有以左叶为主的肝脏肿大,少数伴脾脏肿大;③血清学检查阳性。
4.2.2确诊病例应同时符合下列3条:
①居住在流行区或曾到过流行区有疫水接触史;②无症状,或间有腹痛、腹泻或脓血便;多数伴有以左叶为主的肝脏肿大,少数伴脾脏肿大;③粪检查获血吸虫虫卵或毛蚴,或直肠活检发现血吸虫虫卵。
4.3晚期血吸虫病
4.3.1临床诊断病例应同时符合下列3条:
①居住在流行区或曾到过流行区有疫水接触史;②临床有门脉高压症状、体征,或有侏儒或结肠肉芽肿表现;③血清学试验阳性(既往确诊血吸虫病者可血清学诊断阴性)。
4.3.2确诊病例应同时符合下列3条:
①居住在流行区或曾到过流行区有疫水接触史;②临床有门脉高压症状、体征,或有侏儒或结肠肉芽肿表现;③粪检查获血吸虫虫卵或毛蚴,或直肠活检发现血吸虫虫卵。
5报病
5.1各地卫生行政部门要制定切实可行的管理制度,确定血吸虫病诊断单位,落实各项报病措施。
5.2各级医疗卫生和疾病预防控制机构发现疑似血吸虫病例时,实行首诊医生负责制,将疑似病人血清和粪便分别送疾病预防控制机构和省级粪检实验室确诊,病原学检查阳性结果需经浙江省血吸虫病防治中心确认,确诊病例通过“疾病监测信息报告管理系统”进行网络直报。
5.3各地医疗卫生单位负责对疑似血吸虫病人转诊。
对在门诊、住院及健康体检中发现的疑似血吸虫病人,应转传染病(血吸虫病)诊断单位进行确诊。
诊断单位应在1周内作出明确诊断。
若本级无法最后确诊,应送上一级诊断单位确诊。
5.4浙江省血吸虫病防治中心要做好报病工作的业务指导、业务培训和疑难病例的确诊,掌握全省报病工作的业务信息,以保证对发现的传染源进行及时有效的控制,防止疫情暴发和蔓延。
5.5各地要建立血吸虫病报病有奖,失报有责的制度。
医疗卫生单位和医务人员对发现的血吸虫病人和疑似病人不报告、不转诊或报告、转诊不及时而造成疫情扩散的,卫生行政部门要追查责任并通报批评。
对报病工作开展好的单位和个人,应给予表扬和奖励。
6治疗
6.1治疗对象①病原阳性的人、畜;②无血治史的血清学阳性者,有血治史者在末次治疗3年以上血清学仍阳性者,血清学阳性的畜,可进行扩大化疗。
6.2治疗药物及剂量
6.2.1血清学阳性者成人采用吡喹酮总剂量40mg/kg顿服或1天2次口服。
6.2.2急性血吸虫病人成人采用吡喹酮120mg/kg体重总量的6天疗法,每天剂量分3次口服。
其中二分之一剂量在第1~2天分服完,其余二分之一剂量在第3~6天内服完。
儿童(体重小于30kg)总剂量140mg/kg6天疗法。
6.2.3慢性血吸虫病人成人采用吡喹酮总剂量60mg/kg2天疗法,每天2次口服。
体重超过60kg者按60kg计。
儿童(体重小于30kg)总剂量70mg/kg2天疗法。
6.2.4晚期血吸虫病人肝脏代偿功能良好者,采用吡喹酮总剂量60mg/kg2天疗法;对年老、体弱、肝功能较差或有明显夹杂症者可用总剂量60mg/kg3天疗法。
6.2.5病原或血清学阳性畜采用兽用吡喹酮一次灌服。
水牛25mg/kg,体重超过400kg按400kg计;黄牛30mg/kg,体重超过300kg按300kg计;羊80mg/kg;猪60mg/kg。
7流行病学调查和处理
开展病人现住地及所到地人畜查病、查螺和粪便处理情况调查,治疗查出的病人(畜),消灭查出的钉螺,对粪便进行无害化处理,开展健康教育,将调查和处理结果及时上报。
如发现本地急性血吸虫病人、新感染病人(畜)或感染性钉螺,需及时启动《浙江省血吸虫病突发疫情应急处理预案(2006年修订版)》。
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