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无血清体外培养树突状细胞的研究
无血清体外培养树突状细胞的研究
【摘要】本研究的目的是建立对外周血来源的树突状细胞(dendriticcell,DC)的无血清培养方案。
以含胎牛血清(FCS)、人AB血清的培养液作为对照。
分离健康志愿者外周血单个核细胞,在不同培养液中分别加入GM-CSF、IL-4培养6天,再分别加入钙离子载体A23187继续培养24小时,于倒置显微镜下观察细胞形态,流式细胞术分析细胞表型,MTT比色法检测各组DC刺激同种异体外周血T细胞增殖的能力和DC刺激的T细胞对K562细胞的杀伤作用。
结果表明:
无血清培养组培养出典型形态的DC,其表面CD14分子的表达明显减少,CD83、HLA-DR、CDw123分子的表达明显增高,具有明显的刺激同种异体T细胞增殖的能力和DC刺激的T细胞对K562细胞的杀伤作用。
无血清组与两个含血清的对照组比较,组间无显着性差异。
结论:
无血清培养液培养的DC与含血清的培养液培养的DC相比,无显着性差异。
DC无血清培养具有临床应用前景。
【关键词】树突状细胞;无血清培养液;钙离子载体;外周血
InVitroCultivationofDendriticCellswithSerum-freeMedium
AbstractThisstudywasaimedtoinvestigatetheprotocolinvitrotoincubatethedendriticcell(DC)derivedfromperipheralbloodmonocytesusingserum-freemediumX-VIVO20.Peripheralbloodmonocytesfromhealthydonorsweretreatedwith100ng/mlGM-CSFand500U/mlIL-4,respectively.Aftercultivationfor6days,theyweretreatedwith100ng/mlcalciumionophoreA23187.Aftercultivationfor24hoursthecellularmorphologywasobservedunderinvertmicroscope,thesurfacemarkerswereanalyzedbyflowcytometry,theproliferationofallogeneticTcellswasdetectedbyMTTcolorimetry,thespecificcytotoxicityofTcellsprimedwithDCwasexaminedbyMTTassay.Theresultsshowedthatinallthreegroupswithserum-free,fetalcalfserum(FCS)andhumanABserummediums,cellsdisplayedcharacteristicmorphologicalfeaturesofDC.SimultaneouslyCD14expressionwasdecreased,andCD83,HLA-DRandCDw123expressionwereincreasedonthesecells.Inaddition,DCsculturedwiththesemethodscouldevidentlystimulatetheproliferationofallogeneticTcell.Ascomparedwiththetwocontrolsofserumcontaininggroups,theculturedcellsintheserum-freegroupsshowedalmostthesameallo-stimulatorycapabilityandcellularmorphologyandsurfacemarkers,andTlymphocytesprimedwiththeculture-derivedDCexhibitedthesimilarkillingactivitytoK562().ItisconcludedthatthereisnosignificanceinDCnumbers,morphology,epitopeandabilitytostimulatetheproliferationofallogeneticTcellsbetweenDCinducedbyserum-freeX-VIVO20mediumandDCinducedbyserum-containedmedium.DCculturedandinducedbyserum-freemediumisworthusinginpracticewidely.
Keywordsdendriticcell;serum-freemedium;calciumionophore;peripheralblood
树突状细胞是Steinman和Cohn于1973年首先报道的,因其成熟时有树突样或伪足样突起而得名[1]。
它源于造血干细胞,广泛分布于淋巴组织和非淋巴组织中,是机体内功能最强的抗原呈递细胞(antigen-presentingcells,APC)[2],其最大的特点是能够显着刺激初始型T细胞增殖,是机体免疫反应的始动者。
目前,多数体外培养液包含胎牛血清、混合人(AB型)血清或自体血清,由于血清中包含个体差异性的生长因子,异体血清又有外来抗原及危险感染侵入的弊端,人自体血清中又含有某些抑制DC生长的因子,这将使DC的临床应用受到限制。
本实验采用无血清培养液X-VIVO20则避免了上述缺点。
本实验通过比较X-VIVO20与含FCS、人AB血清的培养基对体外诱导扩增DC的影响,为进
一步优化无血清培养液条件,使DC疗法应用于临床提供实验依据。
材料和方法
材料
淋巴细胞分离液购于上海华精生物高科技有限公司,rhGM-CSF购于华北制药集团金坦生物技术开发有限公司,rhIL-4、人血白蛋白、四甲基偶氮唑盐、钙离子载体A23187均为Sigma公司产品,人AB血清,胎牛血清,无血清培养液(Cambrex公司X-VIVO20培养液),FITC标记的鼠抗人CD83、HLA-DR单克隆抗体和PE标记的鼠抗人CDw123、CD14单克隆抗体(BectonDickinson公司产品)。
分组
根据培养液的不同分为以下4组。
A组:
含10%人AB血清的RPMI1640;B组:
含10%胎牛血清的RPMI1640;C组:
无血清培养液X-VIVO20;D组:
含20g/L人血白蛋白的X-VIVO20。
DC的诱导
静脉采集正常人外周血,用淋巴细胞分离液分离获得外周血单个核细胞,分别用含10%人AB血清的RPMI1640、含10%FCS的RPMI1640、无血清培养基X-VIVO20,将细胞稀释至3×106/ml,加入24孔培养板中,于37℃、5%CO2孵箱中培养2小时,轻轻洗出悬浮细胞,在培养板中分别加入含GM-CSF、IL-4的4组不同培养液,37℃、5%CO2孵箱中培养,3天半量换液1次。
在培养的第6天,每组分别加入钙离子载体A23187继续培养24小时,收集细胞。
DC的形态学观察
用倒置显微镜每日观察细胞生长及形态变化情况,第3、7天作细胞计数,第7天作瑞氏—姬姆萨染色,观察摄片。
DC的表型分析
收集培养7天后的细胞,通过流式细胞术分析细胞表型——CD14、CDw123、CD83、HLA-DR。
混合淋巴细胞反应
将正常人外周血单个核细胞接种于含10%人AB血清的RPMI1640培液基中,在37℃、5%CO2孵箱中培养2小时,取悬浮细胞为同种异体T淋巴细胞,调整细胞浓度为1×106/ml。
将收集的DC悬液,加入丝裂霉素C25μg/ml,37℃孵育30分钟,RPMI1640培养液洗涤3次,用含10%人AB血清的RPMI1640培养液悬浮,作为刺激细胞,分别以1×104/well、5×103/well、×103/well、×103/well加入96孔平底培养板,每组设2个复孔,再加入1×105/well同种异体T淋巴细胞,终体积为200μl/well,另取3孔只加T淋巴细胞而不加DC,作为背景对照。
37℃、5%CO2孵箱中培养3天后,每孔加入MTT,再继续孵育4小时,终止培养,40×g离心5分钟,弃上清,每孔加入二甲基亚砜150μl,振荡10分钟,用酶标仪检测波长570nm时的吸光度值,结果取平均值。
计算刺激指数,SI=A实验组/A对照组。
K562细胞冻融抗原的制备
取K562细胞悬液20ml,以生理盐水洗涤细胞2次后计数,用无菌生理盐水配制细胞浓度为5×107/ml的细胞悬液共2ml,放入液氮中,10分钟后迅速放入37℃水浴中,待其完全融化后,再次放入液氮中,反复冻融3次后,以360×g离心10分钟,取上清,用微孔滤膜过滤,即为K562细胞冻融抗原,4℃保存备用。
DC刺激的T细胞对K562细胞的杀伤作用
按上述方法培养DC。
用RPMI1640培养液调整DC、同种异体T淋巴细胞浓度分别为1×105/ml、1×106/ml。
各取DC和T淋巴细胞100μl,加入96孔培养板共培养,对照组以100μlRPMI1640培养液代替DC,37℃、5%CO2培养72小时后,加入K562细胞作为靶细胞,效∶靶=10∶1,设3个复孔。
37℃、5%CO2孵育48小时后弃悬液,每孔加入20μlMTT溶液(5mg/ml),37℃、5%CO2孵育4小时,终止培养,40×g离心5分钟,弃上清,每孔加入二甲亚砜溶液150μl,振荡10分钟,在酶标仪上测定各组在570nm处A值(结果用3孔均值表示),并计算其杀伤率(%)。
公式为:
细胞杀伤率(%)=[(效应细胞孔的A值+单纯靶细胞孔的A值-细胞毒实验孔的A值)/单纯靶细胞孔的A值]×100%
统计学处理
实验重复3次,所有数据以X±SD表示,采用样本均数的t检验,为无统计学差异。
所有统计学处理均用统计软件SPSS forWindows完成。
结果
活细胞的形态变化
倒置显微镜下显示,最初接种的细胞为大小均等的小圆细胞,细胞表面光滑,无或仅有少数细胞集聚成簇的现象。
第3天,可见细胞形态明显改变,体积略增大,胞体出现树突状小突起,到第7天,各组均可见形态变为大圆形或不规则形等、具有典型的树枝状突起结构的细胞,有细胞集聚成簇的现象,部分细胞脱壁悬浮。
体外培养第7天,瑞氏-姬姆萨染色,各组均可见细胞体积增大,表面粗糙,核呈圆形、肾形、马蹄形、椭圆形等,偏位,嗜碱性染色,胞质丰富,胞膜向外伸展,形成大量形状、粗细不等的毛刺状突起,细胞突起和胞浆呈嗜酸性染色,表现为典型的DC形态。
细胞计数
细胞计数结果见表1,由表1可见随着培养时间的延长,各组DC细胞数量均增加,不同组间DC细胞数量无显着性差异。
Table1.AmountofDCinducedfromperipheralhumanbloodindifferentculturemedium
DC的表型分析
未处理的PBMNC表面单核细胞的标志CD14分子呈高表达状态,而CDw123、HLA-DR及CD83分子的表达很弱或缺乏。
培养后各组均出现成熟DC的特征性表面标志CD83分子表达增高,HLA-DR、CDw123分子的表达也明显增高,而CD14分子的表达明显减少。
无血清培养基组与含血清培养基组表达相差不大,加入20g/L人血白蛋白无明显提高。
不同组间差异无显着性。
Table2.PhenotypeanalysisoftheDCinducedfromperipheralhumanbloodindifferentculturemediumanalyzedbyflowcytometry
各组DC刺激同种异体混合淋巴细胞反应的能力
采用不同培养液的各组DC在体外均能有效地激发同种异体外周血T细胞的增殖。
D组的刺激指数比其他组略高,但不同组间差异无显着性。
Table3.StimulationindexofeachgroupsmeasuredbyMTTmethod
DC刺激的T细胞对K562细胞的杀伤作用
T细胞经DC刺激后对K562细胞的杀伤率,各组均较以100μlRPMI1640代替DC的对照组显着增高,有显着差异,说明经体外诱导的DC负载肿瘤抗原后,各组均可诱导肿瘤特异性T细胞的产生,并杀伤K562肿瘤细胞。
DC激活后的T细胞与K562细胞作用,各组之间差距不大,无显着性差异。
Table4.KillingratioofTcellsstimulatedbyDCofeachgroupstoK563cellsanalyzedbyMTTmethod(略)
讨论
目前无论化疗或造血干细胞移植治疗白血病,都存在残留白血病细胞即微小残留病(MRD)的问题,使相当一部分患者因复发或难治而死亡。
因此,如何有效清除体内MRD,有着极为重要的意义。
树突状细胞可以使CTL最大限度地发挥特异性抗肿瘤效应,它能把肿瘤抗原有效地呈递给T细胞,使T细胞致敏,在肿瘤免疫治疗中起关键作用,这是一个理想的体内外消除MRD的方法。
体外培养DC有3个来源:
骨髓、外周血和新生儿脐血。
DC可由人骨髓、脐血和成年人外周血中的CD34+细胞和人外周血中的CD14+单核细胞产生。
在临床应用方面,与脐血、骨髓来源相比,外周血CD14+单核细胞来源DC的培养方法具有取材容易、培养方便、供者适用性好、成熟阶段易于调控的优点,特别是对于肿瘤免疫的研究,外周血来源DC是目前公认获得成熟DC的较佳途径。
DC的培养分为启动培养和分化培养两个阶段:
GM-CSF、IL-4应用7天诱导出非成熟DC;应用成熟诱导因子促使DC成熟。
目前证明的促成熟因子有:
①细菌菌体或其产物,如LPS;②某些病毒或其核酸;③某些有炎症介质作用的细胞因子,如TNF-α;④氧自由基供体过氧化氢;⑤单核细胞条件培养液;⑥某些刺激信号,如A23187作为一种钙离子载体(calciumionophore,CI),能与钙离子形成稳定的复合物,充当流动的Ca2+载体,使胞外Ca2+透过细胞膜,生理性或人为地提高胞浆游离Ca2+水平,导致Ca2+结合其调节蛋白-钙调蛋白,模拟某些细胞内信号转导事件,导致多基因活化[3,4]。
不成熟DC和单核细胞经CI处理均成为高度活化、成熟的DC,可以迅速表达成熟DC的标志CD83,而且两者的T细胞致敏效应相当[5]。
Czerniecki等[5,6]证实,CD83分子的表达多出现于CI处理后4小时,于20小时达高峰,48小时开始下降,96小时已检测不到,CI处理后不再表达CD14。
体外培养DC的培养基可以用加有胎牛血清、混合人(AB型)血清或自身血清的完全培养液(CM)[7],也可以使用无血清培养液(SFM)培养[8-12]。
血清可以提供细胞生长所需的基本营养物质,提供贴壁和扩展因子、激素、各种生长因子、结合蛋白,对培养中的细胞提供某些保护作用。
但是,使用血清也有一些明显的缺点:
血清中含有一些物质对细胞会产生毒性作用,如多胺氧化酶,它能与来自高度繁殖细菌的多胺起反应形成有细胞毒作用的聚精胺;此外,补体、抗体、细菌毒素等都会影响细胞的生长,甚至造成细胞死亡;胎牛血清及人异体血清有外来抗原和危险感染侵入的弊端,易引起过敏反应,而且有MHC限制等;自体血清中含有抑制细胞生成的因子[13],另外自体血清中可能存在的血管内皮衍化生长因子(VEGF)和IL-10(白血病细胞所分泌)又是DC分化、成熟的抑制剂[14],从而导致用自体血清培养DC产率低。
血清的这些缺点均不利于DC瘤苗的临床应用。
因此,无血清培养基诱导的DC有着广阔的临床应用前景。
本实验采用的X-VIVO20TM无血清培养液具有成分明确、质量稳定、安全可靠的优点,在实验中应用无血清培养液X-VIVO20培养可以克服使用血清的缺点,具有很大的优越性。
本实验用无血清培养液X-VIVO20培养出的DC与含血清的培养液培养出的DC,在细胞形态、细胞表面标志、DC刺激同种异体外周血T细胞的增殖能力、DC刺激的T细胞对K562细胞的杀伤作用方面都没有显着性差异,故无血清培养液培养DC是完全可行的,而且能够避免许多弊端,具有广阔的临床应用前景。
本实验中,在X-VIVO20中加入20g/L人血白蛋白,结果无明显提高,今后可再添加其它细胞因子,进一步优化无血清培养液条件。
DC在净化微小残留病变、防止复发、延长患者无病生存期方面都具有良好的临床应用前景。
将无血清培养液诱导的DC尽快应用于临床、进一步优化无血清培养液的组成将是今后面临的新课题。
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