植物组织培养中的褐变现象及其防止标准措施.docx
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植物组织培养中的褐变现象及其防止标准措施
植物组织培养中褐变现象
学生姓名:
范荣艳学号:
5071093
生命科学学院生物科学专业
指导老师:
远凌威职称:
讲师
摘要:
细胞受损后,因为细胞区隔作用被破坏,毒性酚类或其氧化物醌类物质毒害细胞,造成组织褐变,植物组织培养过程中培养低效或失败。
褐变是植物组织培养中三大难题中首要问题,决定组培成功是否。
本文分析了褐变原因及影响原因,讨论了多个预防方法和处理路径。
关键词:
组织培养;褐变;影响原因;处理路径
Abstract:
Celldamage,whichdestroyedtheroleofcelldifferentiation,makesthecellspoisonedbytoxicphenolsorinfra-redspectramaterial,leadingtothebrowningoftissueandtheprocessofplanttissuecultureinefficientorfail.Browningisthepremierfactorofthethreemajorproblemsintheplanttissueculture,decidingthesuccessoftissueculture.Thispaperanalyzesthereasonsandfactorsofbrowning,anddiscussesseveralpreventivemeasuresandsolutions.
KeyWords:
Tissueculture;browning;influencingfactors;solutions
引言
近30年来,组培技术大量应用于花卉生产、农作物栽培以及特种经济植物幼苗、脱毒苗,使作物种植逐步走向集中控制化、规模化、自动化、不受自然影响工厂化生产
。
尽管组织培养方面理论研究比较成熟,但在试验和生产过程中常常会碰到外植体褐变、污染和玻璃化现象这三大难题
而褐化能否得到有效控制是植物组织培养能否成功关键所在
。
褐化现象关键发生在外植体、植物愈伤组织继代培养、悬浮细胞培养、花药培养以及原生质体分离与培养中。
褐化产物不仅使外植体、细胞、培养基褐变,而且抑制外植体正常生理生化反应,影响外植体生长与分化,甚至造成其死亡。
所以,怎样预防或降低褐变显得尤为关键。
1褐变定义
褐变是植物组织培养中一个普遍存在现象,是因为组织中多酚氧化酶被激活,使细胞酚类物质被氧化而产生棕褐色醌类物质,这种褐变现象又被称为酚污染。
多酚类物质及其氧化物醌类物质会抑制其它酶活性,从而毒害整个外植体,严重影响外植体脱分化、再分化和生长。
褐变这种现象与菌类污染和过分含水化(即玻璃化)并称植物组织培养3大难题。
现在褐变已成为植物组织培养发展一大障碍[4]。
2褐变类型
依据褐变发生原因,常把褐变分为非酶促褐变和酶促褐变。
其中酶促褐变是组织培养中关键褐变现象。
2.1非酶促褐变
非酶促褐变是因为细胞受胁迫或其她不利条件影响所造成细胞程序化死亡或自然发生细胞死亡,即坏死形成褐变现象,并不包含酚类物质产生。
很多不利条件都能够造成细胞程序化死亡,但这种褐变若采取合适方法或者愈伤组织适应了胁迫环境就不再发生。
2.2酶促褐变
多数认为,植物组织培养中褐化现象关键是由酶促褐变引发。
酶促褐变如同通常酶促反应,其发生必需含有三个条件,即酶、底物和氧。
引发褐变酶有多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶等。
从首次培养和继代培养过程中试管苗褐变程度和PPO活性来看,表明PPO活性高低是引发培养材料褐变关键。
引发褐变酶底物关键是酚类化合物,按其组成可分成3类:
苯基羧酸、苯丙烷衍生物、黄烷衍生物(表1),但并非全部酚类物质都是PPO底物。
在正常发育植物组织中,底物、氧气、PPO同时存在并不发生褐变,是因为在正常组织细胞内因为多酚类物质分布在细胞液泡内,而PPO则分布在多种质体或细胞质中,这种区域性分布致使底物与酶被质膜分隔开来。
但当外植体或培养材料处于机械损伤等逆境,或细胞受伤或衰老时,细胞膜结构或细胞中物质区域化分布破坏会造成酚氧化酶释放或合成,假如此时在适宜pH和温度等条件下,酚氧化酶、酚类(底物)和氧发生酶促氧化反应,形成有毒棕褐色醌类物质,从而使组织发生褐变。
另外,组织老化或病变也可激活酚氧化酶而引发褐变。
表1酚类化合物酚类
类名
典型化合物
苯甲羧酸
羟基苯酚、儿茶酚、没食子酸、莽草酸
苯甲烷衍生物
绿原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、单宁、木质素
黄烷衍生物
花青素、黄酮、芸香苷
3影响褐变原因
3.1基因型
不一样种植物、同种植物不一样类型或品种,在组织培养中发生褐变频率和程度都存在差异。
这是因为多种植物表示多酚类物质种类、含量以及酚氧化酶种类、活性存在差异,有些植物种类组织培养较易成功,有些则很困难。
通常木本植物酚类化合物含量比草本植物高,所以在组培过程中更轻易发生褐变。
比如在相同培养基上诱导培养,孝顺竹比小佛肚竹和风尾竹更易褐变[5]。
3.2外植体生理状态
材料本身生理状态不一样,接种后褐变程度也不一样。
通常分生部位接种后形成醌类物质少而分化部分形成醌类物质较多,褐变伴随材料组织木质化程度和年纪而增加。
植物体内酚类化合物含量受到取材时间影响。
比如,柿嫩芽茎尖多酚氧化酶活性显著高于休眠芽,以嫩枝茎尖为外植体进行培养时易褐变死亡[6]。
3.3外植体种类和大小
通常认为,木本植物较草本植物外植体在培养过程中更轻易发生褐变。
外植体小材料,因为切口所占百分比较大而较易发生褐变。
切口越大,酚类物质被氧化面积就越大,褐变程度越严重[7]。
3.4材料预处理
材料在接种前经过一定预处理可减轻外植体在培养中褐变。
预处理通常有低温或黑暗条件下预培养;外植体在水或抗氧化剂中切割或浸泡,以降低外植体与氧接触和使水溶性多酚和醌类物质充足渗出外植体。
比如竹在培养时外植体在无菌水或半胱氨酸(100mg/L)溶液中浸泡2~4h有利于控制褐变;魔芋培养过程中,在1%柠檬酸溶液中切割外植体,可有效抑制外植体褐变;黑暗预处理能减轻蝴蝶兰R4品种叶片外植体褐变程度,其中以预处理10d褐变最轻;未经暗处理褐变最重且多酚氧化酶(PPO)活性最大。
3.5培养条件
培养过程中,低温比高温有利于抑制褐变,高温会促进酚类氧化;而低温抑制酚类合成,降低多酚氧化酶活性,降低酚类氧化。
暗培养或弱光培养对抑制褐变也有一定作用。
比如小佛肚竹在暗培养和弱光(800Lx)下培养茎尖和茎段褐变率比在强光(200Lx)下培养有所下降。
3.6培养基
3.6.1培养基状态
液体培和半固体培养系统中,外植体溢出有毒次级代谢产物能够得到充足扩散,降低其浓度,所以对外植体造成危害较轻,假如再加上滤纸做成纸桥,褐变抑制程度有所提升,这可能是滤纸吸附了少许有害酚类物质。
培养基中琼脂含量降低,外植体褐变严重,培养基中水分含量相对增加,外植体褐变产生鞣质含有一定极性,愈加易于溶出,毒害细胞,加重外植体褐变。
所以,为降低褐化程度,应该在许可条件下,合适增加培养基硬度,琼脂用量大,培养基硬度大,则褐变率低;伴随琼脂用量降低,培养基浓度降低,组织褐变加重[8]。
3.6.2无机盐
在初代培养时,培养基中无机盐浓度过高会引发酚类物质外溢,加剧褐变。
降低盐浓度,尤其是降低Mn
和Cu
等可作为氧化酶类组成成份或辅因子离子浓度,能够降低酶活性、抑制酚类氧化、减轻褐变。
3.6.3植物激素
不一样植物分裂素和生长素能影响外植体发育和褐变酶活性,细胞分裂素BA或KIN含有使得PPO活性提升作用。
在柿树组培中,用改良MS培养基(ZT9.13mol/L,IAA0.57mol/L)能促进外植体生长与分化,减轻外植体褐变程度[9]。
BAP(6一苄氨基腺嘌吟)或KT(激动素)能促进酚类化合物合成,其浓度大小会影响多酚氧化酶活性,而生长素类激素,如2,4一D可延缓多酚合成,减轻褐变发生。
3.6.4pH值
培养基低pH值可降低多酚氧化酶活性和底物利用率,抑制褐变[10]。
同时pH值影响细胞膜渗透性,以及对应酶活性,从而影响褐变。
通常来说,较为酸性环境能够降低褐变。
3.6.5培养基添加物
为减轻褐化程度,可向培养基内加入部分化学添加剂。
通常有吸附剂、抗氧化剂、螫合剂和激活剂四大类。
常见吸附剂有AC(活性炭)和PVP(聚乙烯吡咯烷酮)。
活性炭是一个吸附性较强无机吸附剂,能吸附培养基中有害物质,减轻褐变。
粉末状与颗粒状AC相比,吸附性更强,通常在培养基中加人2~3g/LAC。
抗氧化剂可改变外植体周围氧化还原电势,从而抑制酚类氧化、减轻褐变,比如Vc(抗坏血酸)、柠檬酸、二硫苏糖醇等。
4预防褐变方法
4.1选择适宜外植体和培养条件
成功经验表明,选择合适外植体并建立最好培养条件是克服材料褐变最关键手段[11。
选择适宜外植体,材料年纪、取材部位、材料大小及外植体受伤害程度等均能对褐变产生影响。
取材时应注意选择褐变程度较小品种和部位作外植体。
外植体材料应有较强分生能力,在最适宜细胞脱分化与再分化条件下,使外植体处于旺盛生长状态,便可大大减轻褐变。
通常情况下,取幼龄树新萌发嫩枝条带芽茎段、嫩叶或茎尖作为外植体,也可采取幼胚来培养。
对于某个种植物进行培养前,在不影响培样目情况下,应筛选褐变低基因型个体。
另外成年植株比幼苗褐变程度厉害,夏季材料比冬季及早春和秋季材料褐变要严重。
冬季芽不易生长,宜选择早春和秋季材料作为外植体[12]。
在培养条件很多因子中,较为关键是适宜无机盐成份、适宜蔗糖浓度及激素水平[13]。
培养早期培养基中应含较低浓度元机盐,降低Fe
和Cu
浓度或不用这两种离子;在确保正常培养需求下使用低浓度细胞分裂素;愈伤组织或细胞培养物为异养型,应使培养物取得充足氧气,以利于分化和生长。
适宜温度及在黑暗条件下进行培养也可减轻材料褐变[14]。
易发生褐变外植体,可先于低温(4~20℃)预培养数小时,也可于黑暗或弱光照下预培养数以后再转入正常培养条件下培养。
外植体受伤害程度直接影响褐变,切割时应尽可能减小伤口面积,并缩短切口在空气中暴露时间。
伴随pH增高,多酚被氧化作用增强,所以培养基pH值应控制在6.0以下[15]。
4.2抑制剂作用
大家在培养基中加入抗氧化剂和其她抑制剂来抑制组织培养过程中外植体酶促褐变,现将培养基中所使用抑制剂及其作用机理归纳于表2。
表2抑制剂及其作用机理
抑制剂
作用机理
研究者
有机酸
有机酸抑制PPO活性;还原剂对PPO也有较强抑制作用;一定浓度苹果酸、柠檬酸均能增强还原剂抑制作用;有机酸对纯化酶制剂抑制与促进均强于未纯化粗酶提取液
刘曼西和于秀芝,Reynolds和Murashige,Sondahl等,Skirvin等,Chaturvedi等,王敬驹
蛋白质、蛋白质水解产物、氨基酸
①氨基酸能与邻位醌发生多种不一样反应;②蛋白质、肽、2-氨基酸可与Cu
形成稳定复合物
Mason等,王敬驹,Chaturvedi等
2-巯基苯并噻唑
巯基化合物与邻位醌形成无色物质
Vardakahn
硫脲、二氨基二硫代甲酸钠
PPO是含铜酶,硫脲是铜螯合剂,对PPO起抑制作用;二乙氨基二硫代甲酸钠是铜沉淀剂,对多种含铜酶如酪氨酸酶、漆酶和抗坏血酸氧化酶均起抑制作用
李明启和严君灵,Krishnamurthi
亚硫酸氢钠
抑制酚类物质氧化
MarinaMcetat
氰化钾
抑制PPO活性
Lchihashi和Karo
二硫苏糖醇
维持体系还原环境,预防氧化
MarinaMcetat
4.3吸附剂作用
常见吸附剂有活性炭和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
活性炭是一个吸附性较强无机吸附剂,能吸附培养基中有害物质,包含琼脂中杂质、培养物在培养过程中酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生5-羟基甲糠醛等,从而有利于培养物生长。
粉末状活性炭和颗粒状活性炭相比,吸附性更强。
通常在培养基中加入1-4g/L活性炭。
在使用过程中应注意,尽可能使用低浓度活性炭来对抗褐变产生,因为活性炭吸附作用是没有选择性,在吸附物质同时,也会吸附培养基中其她成份,对外植体诱导分化会产生一定负面影响。
而聚乙烯吡咯烷酮是酚类物质专一性吸附剂,在生化制备中常见作酚类物质和细胞器保护剂,可用于预防褐变。
4.4进行细胞筛选和数次转移
在组织培养过程中,数次进行细胞筛选,能够剔除易褐变细胞。
在外植体接种1-2天后应立刻转移到新鲜培养基中,能减轻酚类物质对培养物毒害作用,降低抑制作用,使外植体立刻分生,连续转移5-6次,可基础处理外植体褐变问题。
5展望
在植物组织培养中,从褐化产生路径角度分析,得出引发褐化是多原因共同作用结果。
从外植体选择角度上讲,外植体材料基因型、年纪、取材部位、时期、大小和受伤害状态等都会影响褐变发生;就培养基而言,有没有机盐成份、生长激素浓度、状态、硬度、pH值、化学添加剂等影响原因,还有培养条件(光照、温度)、最终培养方法都会影响褐变发生。
从发生机理角度分析,组织培养褐变关键是由酶促褐变反应造成酚类物质被氧化结果,同时也会有非酶促反应影响。
褐变存在着不一样物种问基因型差异,这些基因与外植体酚类产生量、相关酶含量、表示都相关系[17]。
若能分离影响褐化基因,进行驯化、基因操作等,提升褐化可利用产物产量,进而利用组培技术生产褐化产物(如一些醌类),结合高新技术手段减低分离提纯成本,用于试验、生产实践和日常生活,比如疫苗生产中抗体库技术即是成功例子。
褐化也是植物一个适应性反应,在研究褐化与抗病连锁细胞群体筛选、褐化与次生代谓十物提取和利用上也有其主动意义。
深入了解褐变相关机制,从理论上认识组织培养中褐化现象,找到影响褐变主导因子和克服褐变有效方法,可从实践上预防褐化发生,降低经济损失。
深入研究褐变产生机理,对研究酶促褐变与非酶促褐变内在联络、更深入地研究酶促褐变反应动力学、促进组织培养技术日臻完善提供了理论基础。
对其她形式褐变研究,如水果果汁运输保藏也含有借鉴和参考价值,为拓展褐变学科深入再研究提供可行性参考。
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