基因工程复习.docx
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基因工程复习
第1章绪论
基因工程:
是通过基因操作,将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物细胞,通过复制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白质的活性表达,使转基因生物获得新的遗传性状的操作。
基因工程的特征:
–打破物种的界限,实现跨物种的基因转移;
–通过已知功能基因的遗传转化,可进行物种的定向改良;
–可创造出自然界中原本没有的生物。
基因工程的技术流程
–分:
分离目的基因和载体DNA。
–切:
用合适的酶切割上述两者,产生匹配的末端。
–接:
连接酶连接目的基因和载体,形成重组DNA分子。
–转:
重组DNA分子转入受体菌。
–筛:
筛选具有抗药性的阳性克隆,再扩大繁殖。
第2章基因工程的酶学基础
2.1限制性内切酶
Ø定义:
限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。
二、限制性内切核酸酶的类型
Ⅰ型酶:
能识别专一的核苷酸序列,并在识别位点附近的核苷酸切割DNA双链,但切割序列是随即的,无专一性。
Ⅱ型酶:
能识别专一的核苷酸序列,并在识别序列的固定位置切割双链DNA分子,是基因工程中最常用的工具酶。
Ⅲ型酶:
有专一的识别序列,但不是对称的回文序列,在识别序列旁边的位置上切割双链。
Ⅳ型酶:
新鉴定出的一种酶,目前无应用。
三、限制性内切酶的命名P14
Ø命名原则:
属——种——株——分离序号
黏性末端:
DNA分子在限制性内切酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸形成的末端结构。
同裂酶:
是一类来源于不同的微生物、能识别相同靶序列的限制性内切核酸酶。
同尾酶:
来源不同,识别的靶序列也各不相同,但切割后能产生相同的黏性末端。
五、影响限制内切核酸酶活性的因素P18
1.酶的纯度
2.DNA样品的纯度高纯度DNA是必需的
3.DNA的甲基化程度识别序列中特定核苷酸的甲基化会影响酶的活性。
4.酶切反应的温度大多数限制性内切酶的最适反应温度为37℃。
5.DNA分子的构型切割超螺旋的DNA所需要的酶量,要比消化线性DNA的高出许多倍。
6.反应缓冲液pH范围:
7.0~7.6
7.酶的星号活性当条件改变时,许多酶的识别位点会改变,导致识别与切割序列的非特异性。
8.限制性内切酶反应的终止
2.2DNA连接酶
一、DNA连接酶的发现
DNA连接酶(DNAligase)是能催化双链DNA片段靠在一起的3’羟基末端与5’端磷酸基因末端之间形成磷酸二酯键,使两末端连接在一起。
依据反应时所需能量辅因子的不同分为两类:
依赖ATP的DNA连接酶和依赖NAD+的DNA连接酶
2.3DNA聚合酶和反转录酶
一、DNA聚合酶
DNA聚合酶:
在引物和模板的存在下,把dNTP连续加到DNA分子3-OH末端,催化核苷酸的聚合。
Ø分为两类:
依赖于DNA的DNA聚合酶和依赖于RNA的DNA聚合酶-反转录酶
大肠杆菌DNA聚合酶活性:
(1)5’-3’聚合酶活性
(2)3’-5’外切酶活性(3)5’-3’外切酶活性
二、反转录酶
Ø是一种依赖RNA的DNA聚合酶。
(1)5’-3’聚合酶活性,能以RNA或DNA模板合成DNA分子;
(2)RNA酶H活性,对RNA:
DNA杂交体中的RNA特异性地降解,免除了在反转录完成后再用NaOH降解RNA模板的步骤。
2.4DNA修饰酶
(一)末端脱氧核苷酸转移酶,简称末端转移酶
Ø主要用途:
用于克隆DNA片段:
平末端DNA片段的末端加尾连接法
用于DNA片段3’末端标记
(二)T4多核苷酸激酶
基本特性:
催化ATP的γ-磷酸基转移到在DNA或RNA的5’-OH末端,使5’末端重新磷酸化。
用于标记DNA或RNA的5’末端
(三)碱性磷酸酶
能催化核酸分子脱掉5’的磷酸基团,从而使DNA(或RNA)片段的5’-P末端转换成5’-OH末端。
主要用途有:
⑴在用32P标记DNA5’端之前,去除5’端的磷;
⑵在DNA重组技术中,去除DNA片段的5’磷酸,防止载体的自身环化,提高重组子比例。
第3章载体vector
载体(vector):
携带外源基因(或DNA片段)进入细胞复制、整合或表达的工具。
载体分为克隆载体和表达载体。
4.1克隆载体
Ⅰ.质粒载体
一、质粒的基本特性
1、质粒的DNA分子特性
具有三种不同的构型:
共价闭合环形DNA开环DNA线性DNA
2、质粒的复制类型
Ø一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的拷贝数。
Ø据拷贝数将质粒分为两种复制型:
严紧型和松弛型。
3、质粒的不相容性
Ø两种质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存的现象称为质粒的不相容性;相反则称为相容性。
Ø亲缘关系密切的不同质粒一般属于不相容性质粒
4、质粒的转移性
Ø根据能否自我转移,分为
–接合型,含有tra基因,能转移,质粒分子较大,拷贝数少,宿主广
–非接合型:
不会自动转移,分子量小,拷贝数多
三、常见的质粒载体
1.pBR322质粒载体
Ø结构:
(1)氨苄青霉素抗性基因(amp或Apr)
(2)四环素抗性基因(tet或Tcr)
(3)DNA复制起点(ori)来自pMB1
2、pUC质粒载体
Ø结构:
(1)来自于pBR322的Ori
(2)氨苄青霉素的抗性基因(ampr)。
(3)LacZ′基因:
编码β-半乳糖酶的α-肽链即氨基末端。
(4)MCS区段(多克隆位点)
蓝白斑筛选原理:
ØIPTG是安慰诱导物,能够促使细菌产生β-半乳糖苷酶
ØX-gal是一种人工化学合成的半乳糖苷,可被β-半乳糖苷酶水解产生蓝色化合物,因此可以用作β-半乳糖苷酶活性的指示剂
-互补(alpha-complementation)
将编码β-半乳糖苷酶-片段的LacZ’基因插入到载体的多克隆位点的侧翼序列中,而在一些人工构建的大肠杆菌株系中却只能编码产生该酶的片段。
当含有完整的LacZ’基因的载体导入到这类寄主细胞中时,载体编码的-片段就能和寄主编码的片段发生互补并具有了对底物X-gal的作用功能(发生显色反应),
如果插入的外源基因是在lacZ’基因内,就会影响lacZ’的表达,利用lac-E.coli为转染或感染细胞,在含X-gal的培养基上生长时会出现白色菌落;若无外源基因插入,则出现蓝色菌落。
-互补:
单独存在的-及-片段都没有半乳糖苷酶的活性,只有宿主细胞与克隆载体同时表达两个片段时,宿主细胞内才有半乳糖苷酶活性,使特异性作用物(X-gal)变为蓝色化合物。
4.2表达载体
一、原核表达载体
1.原核表达载体的表达元件
Ø表达元件主要包括启动子、转录终止子和核糖体结合位点。
1)启动子
1)必须是一个强启动子。
2)一般为诱导型的
(2)转录终止子
为了稳定载体系统,一般在多克隆位点的下游插入一段转录终止子,防止转录通读。
(3)核糖体结合位点:
SD序列
三、Ti质粒表达载体进行植物转化
ØTi质粒可分为T-DNA、Vir、Con和Ori4个功能区。
–T-DNA(transfer-DNA),能转移并整合进植物基因组中,并导致冠瘿瘤的形成。
T-DNA边界各有一个25bp长的正向重复序列,高度保守,不可缺少。
–Vir区:
表达产物可激活T-DNA向植物细胞的转移,也称为致病区。
–Con区:
含有与农杆菌接合转移有关的基因,使Ti质粒在细菌之间转移。
–Ori区:
调控Ti质粒的自我复制,为复制起始区。
Ti质粒衍生的载体系统
利用Ti质粒对植物进行转化,最简单的方法莫过于将目的DNA片段插入T-DNA区,然后通过土壤农杆菌和Ti质粒将它送入受体植物,插入植物细胞基因组内。
第5章基因工程的主要技术及其原理
5.1DNA和RNA的提取和纯化
一、DNA提取的基本原理和方法
1.DNA提取的基本原理
ØDNA是极性化合物,溶于水,不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂
ØDNA多以DNP(脱氧核糖核蛋白)形式存在
ØDNP在0.14mol/LNaCl溶液中溶解度最低,随盐浓度的增加溶解度增加。
ØRNP在0.14mol/LNaCl中溶解度较大,常用此法分离DNP和RNP
主要步骤:
Ø细胞裂解和DNA的溶解
–注意灭活细胞内的DNA酶,防止DNA被酶解
Ø除去蛋白质和RNA等杂质
–CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)可溶解细胞膜,同时使蛋白变性
–CTAB与DNA形成复合物,高盐可溶,低盐沉淀,可将DNA与蛋白质、多糖分开
–SDS(十二烷基硫酸钠)使蛋白质变性,释放出核酸
–氯仿、苯酚使蛋白变性,通过离心蛋白质被沉降到酚相与水相的界面,而DNA留在水相
–必要时加入RNA酶除去RNA杂质。
ØDNA的沉淀和纯化
–处在上清液中的DNA可用2倍体积无水乙醇沉淀
–但在多糖、蛋白含量高时,可用2/3体积的异丙醇沉淀
–70-75%的乙醇清洗各种离子
2.DNA提取的几种方法
Ø1)浓盐法:
–利用RNA和DNA的溶解度不同将二者分离。
–通常用5MNaCl、0.015M柠檬酸钠(SSC溶液)
Ø2)SDS法
–细胞破碎后,SDS使细胞膜裂解,同时使蛋白质变性,将蛋白质、多糖等杂质与DNA分开,加入乙酸钾使SDS-蛋白质复合物转变成溶解度更小的钾盐,使沉淀更加完全。
3.质粒的抽提(碱变性法)
Ø此法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。
步骤见书P67
二、RNA提取的基本原理与方法
1. 制备RNA的关键—防止内外源RNase的作用
2.总RNA提取的方法
Ø酚-异硫氰酸胍提取法(Trizol试剂)
在液氮下研磨组织或细胞,或使之裂解
加入Trizol试剂
加入氯仿抽提,分离水相和有机相
收集含有RNA的水相
异丙醇沉淀,70%乙醇洗涤样品
溶解样品
3.真核mRNA的提取
真核mRNA的提取一般有两条途径:
Ø其一是提取细胞总RNA,然后再从中分离带polyA的mRNA,利用亲和层析法进行分离。
Ø其二,先提取多聚核糖体,再将蛋白质与mRNA分开。
(核糖体免疫沉淀法)
三、DNA或RNA浓度、纯度鉴定
1、核酸的浓度和纯度鉴定
碱基、核苷、核苷酸和核酸在240-290nm有较强的光吸收,λmax=260nm
2.鉴定纯度
纯DNA,A260/A280=1.8(1.6-1.9)
若大于1.9,表示污染了RNA或DNA降解
若小于1.6,表示有蛋白、苯酚等污染
纯RNA,A260/A280=2.0(1.7-2.0)
若小于1.7,表示有杂蛋白或苯酚污染
若大于2.0,表示有异硫氰酸胍残存
5.2核酸凝胶电泳
1.核酸凝胶电泳的基本原理
1)核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团,呈负离子化状态;核酸分子在电场中会向正电极方向迁移;
2)在电泳中,电泳迁移率与电泳介质的摩擦系数成反比。
而摩擦系数是分子大小、介质粘度等的函数;
因此,可在同一凝胶中、一定电肠强度下、可在凝胶上分离出不同分子量大小或相同分子量但构型有差异的核酸分子。
一、琼脂糖凝胶
二、DNA电泳影响因素
1.DNA分子的大小DNA分子越大,受到的阻力就越大,泳动也越慢
2.DNA的构象电泳速度:
超螺旋环状>线状>松散开环状。
3.凝胶浓度同种DNA分子,凝胶浓度越高,电泳速率越慢;
4.电场强度电场强度高(5V/cm),电泳速率快,但分辨率低,电泳分离的线性范围会变窄
5.溴化乙锭EB对超螺旋分子影响较大,会改变DNA分子的构象,从而影响电泳速率
6.电泳缓冲液TAE最常用,成本低、电泳速度快、分辨率较好
5.3核酸和蛋白质分子杂交
一、探针的标记
Ø探针(probe)是指用于检测特定基因或转录产物存在或表达的DNA、RNA或寡核苷酸序列。
Ø这些序列需要标记,主要有放射性的同位素、非放射性的生物素、地高辛或辣根过氧化酶。
(一)探针的制备
Ø1、均匀标记具体见书。
(1)切口平移法
(2)随机引物法
(3)PCR扩增法
Ø2、末端标记法
(1)KlenowDNA聚合酶和T4或T7DNA聚合物在对DNA片段进行末端补平反应或末端置换反应时引入标记的核苷酸
(2)先用碱性磷酸酶(AP)去掉dsDNA5`-磷酸,再用T4多核苷酸激酶催化标记的ATP的γ-磷酸转移加到DNA片段5`-OH上。
(3)在探针3`-末端用末端转移酶掺入一个单标记的[α-32P]dNTP。
二、Southern杂交
原理:
将电泳分离的待测DNA片段结合到一定的固相支持物上,然后与标记的核酸探针进行杂交,检测DNA的方法。
DNA分子杂交的应用:
Ø可用于检出特异的DNA片段
Ø可进行DNA片段的定位和分子量的测定
Ø可用于基因的酶切图谱分析、基因突变分析
Ø可用于基因文库和cDNA文库的筛选
三、Northern杂交
指将RNA变性及电泳分离后,并转移到固相支持物上,用杂交反应来鉴定其中特定mRNA分子的含量及其大小。
和Southernblot不同在于:
A:
靶核酸是RNA;
B:
RNA电泳时,凝胶中加入变性剂,防RNA分子形成二级结构;
C:
电泳结束后直接转膜。
四、Western杂交——蛋白质免疫印迹
通过将SDS-PAGE分离后的蛋白质组分转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上,再以免疫学方法用能够特异性抗体分析靶蛋白的存在及其含量,是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。
Ø检测蛋白质表达水平
Ø探针:
抗体
5.4聚合酶链式反应技术(PCR)
一、PCR技术原理
Ø以目的基因或DNA片段为模板,在引物介导及TaqDNA聚合酶催化下,在体外用核苷酸大量合成目的基因或DNA片段。
(一)PCR技术的基本过程
ØPCR包括三个基本过程:
变性、退火和延伸。
变性(denaturation):
92~96C的高温处理使模板DNA双链的氢键断裂,解离成单链。
退火(annealing):
将温度降低到37~72C,使引物与模板的互补区结合。
退火温度取决于引物的Tm值。
延伸(extension):
在72C温度下,DNA聚合酶将dNTPs连续加到引物,延伸合成模板DNA的互补链。
延伸时间由扩增产物的大小决定。
二、PCR反应体系
Ø1、缓冲液
–Tris-HCl(pH8.3-9.0)缓冲液体系
–Mg2+:
Mg2+的浓度高低可显著影响PCR扩增产物的特异性
Ø2.模板
–单、双链DNA或cDNA都可以作为PCR的模板,若以RNA为起始材料,则须经反转录,获得第一条cDNA后才能用于PCR。
Ø3.dNTP
–dATP、dTTP、dCTP、dGTP的总称
–浓度50-200μmol/L。
Ø4.耐热DNA聚合酶
–目前使用的耐高温DNA聚合酶主要有TaqDNA聚合酶
Ø5.引物
指在PCR反应中与待扩增的靶DNA区段两翼互补的寡核苷酸,单链DNA片段
PCR过程注意事项(略)
第6章目的基因的获得
Ø目的基因的克隆策略主要分为三大类:
–利用PCR技术或是化学合成法体外直接合成目的基因
–构建基因组文库或cDNA文库
–利用基因差异表达获得目的基因
6.1基因组文库
Ø基因组文库:
将某种生物基因组DNA片段化并全部克隆后所获得的重组子群体就称为该生物的基因组文库(genomiclibrary)
构建基因组文库应满足的条件:
第一,要满足文库的完整性,即应包含基因组的完整序列信息
第二,基因组信息的可重建性,染色体相邻的克隆重组子具有重叠性,可通过建立叠连群重建完整序列信息
第三,文库的大小,即包含的独立重组子数目。
文库的大小取决于基因组的大小、从文库中分离某任意分子克隆的期望值及克隆分子片段的长度。
基因组文库的构建
①载体和受体的选择
Ø出于压缩重组克隆的数量,用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的λ-DNA或柯斯质粒;对于大型基因组需使用YAC或BAC载体
②基因组DNA的制备
Ø用于基因组文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的机械断裂。
③基因组DNA的切割
Ø用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用机械切割法和限制性内切酶部分酶切两种方法,
Ø部分酶切法一般选用4个碱基或6个碱基识别序列的限制性内切酶,限制性内切酶的选择影响所切出的产物的长度和随机程度。
Ø连接前,上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级分离。
④载体与DNA片段的连接
Ø在基因组文库的构建过程中,大量体系连接前先使用小体系连接来寻找最佳比例!
Ø方法一:
粘末端连接方法二:
人工接头法
⑤转化或侵染宿主细胞
Ø携带基因组DNA片段的质粒直接转化宿主细胞;
⑥筛选目的基因
Ø功能筛选探针杂交PCR筛选
6.2cDNA文库的构建与筛选
ØcDNA文库具有其组织和发育时期的特异性
二、构建cDNA文库应满足的条件
Ø对cDNA文库质量的评价主要有两个方面:
文库的代表性和重组cDNA序列完整性(具体见书P117)
三、cDNA文库的构建
1.提取总RNA和mRNA的分离纯化
Ø总RNA的抽提:
Trizol试剂
ØmRNA的分离:
利用mRNA都含有一段polyA尾巴,将mRNA从总RNA中分离纯化。
2.对mRNA进行富集
Ø如果目的cDNA克隆出现的频率<10-6时,需要对其mRNA进行富集:
Ø诱导基因在特定的组织器官中高效表达,使其产生更多拷贝的分子;
3.cDNA的合成
ØcDNA第一链的合成是以mRNA分子为模板,在反转录酶作用下,利用oligo(dT)引导cDNA第一条链的合成。
ØcDNA第二条链的合成有多种方法:
Ø自身引导法
Ø第一链合成过程中形成cDNA/RNA杂交分子变性,降解RNA
Ø单链cDNA分子的3’末端自身环化,形成发夹结构
Ø以此为引物,在DNA聚合酶作用下合成第二链
Ø置换合成法:
–RNAaseH酶降解RNA
–RNA链上出现切口
–产生一系列带3’-OH的RNA引物
–大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ合成cDNA的第二链
4.cDNA与载体的连接
Ø
(1).同聚物加尾法
利用末端转移酶在双链cDNA和质粒载体的3’端都加上一个互补的同聚片段,通过退火使两个片段连接成重组质粒,再将重组质粒转化受体细胞
Ø
(2).接头-衔接头法
常在oligo(dT)引物一端接上含有特定限制性内切酶黏性末端的接头。
5.转化或体外包装后感染宿主细胞
同基因组文库操作一样!
第7章DNA重组的操作
7.1DNA的体外重组
一、黏性末端的连接
Ø1.同一种酶产生的黏性末端的连接
缺点:
会导致目的基因正、反向插入;多个目的基因片段之间重组;载体自身环化。
Ø2.不同种酶产生的黏性末端的连接
优点:
避免载体自连和外源片段自身连接;外源DNA片段能定向插入到载体上。
Ø同尾酶产生的黏性末端
大多数同尾酶产生的黏性末端连接后形成的重组DNA分子中原有限制性内切酶的识别位点被破坏,得到的杂合位点不能被切割。
二、平末端的连接
Ø同聚物加尾
在末端转移酶的作用下,将dNTP添加到3’-OH末端
Ø衔接物连接法
衔接物是人工合成的一段10-12nt组成、具有一个或数个限制性内切酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。
Ø接头分子连接法
一类由人工合成的一头具有某种限制性内切酶粘末端,另一头为平末端的特殊双链寡核苷酸片段。
三、PCR产物的连接具体见书P135
Ø
(一)引入酶切位点连接法
Ø
(二)T-A克隆
7.2重组体导入受体细胞的原理和技术
一、重组DNA导入大肠杆菌的方法
(一)转化
Ø转化:
是指以质粒为载体、将外源DNA导入感受态(competence)的大肠杆菌等原核宿主细胞,并使其获得新的表型的过程。
Ø感受态细胞:
处于能吸收外源DNA分子的生理状态的细胞。
Ø1、CaCl2诱导转化法
Ø冰冷条件下,CaCl2能使细菌细胞膨胀成球状,细胞壁通透性增强;
ØCa2+与DNA结合形成抗DNase的羟基-磷酸钙复合物,粘附于细胞表面,在42℃下进行短暂热击处理,能使细胞膜的结构出现许多间隙,外源DNA便会被细胞所吸收。
步骤:
3.PEG介导的原生质体转化法
原理:
PEG为细胞融合剂,可使细胞膜间或DNA与膜之间形成分子桥,从而有利于DNA分子的进入。
第8章外源基因的表达及其优化策略
8.1影响外源基因表达的因素
一、阅读框架对转化基因表达的影响
Ø外源基因的编码区只有与表达载体DNA的起始密码子相吻合时,才能正确地转译出蛋白质产物。
Ø构建一组表达载体,使每个载体与起始密码子的翻译位相不同,分别与外源目的基因连接,其中必有一种处于正确的阅读框架中。
Ø用人工接头调节阅读框架。
同一酶切位点的人工接头一般有三种长度,各相差一个核苷酸,选择合适的人工接头。
二、顺式作用元件对基因表达的影响
Ø1.启动子:
RNA聚合酶识别和结合的位点
Ø2.增强子:
远距离调节启动子并提高转录效率的一段DNA序列
Ø3.终止子:
为转录提供终止信号
外源基因的表达效率与表达载体上外源基因与终止子之间的距离有关,两者之间要保持合适的距离。
Ø4.核基质结合区(MAR):
是存在于真核细胞染色质中的一段与核基质特异结合的DNA序列。
P159
三、翻译过程对表达的影响
1.翻译起始对基因表达的影响
对于原核生物来说,SD序列与AUG起始密码子的距离保持在9+3个核苷酸、翻译起始区无明显二级结构对于结构基因的有效翻译是十分重要的。
对于真核生物来说,mRNA5’端的帽子结构、起始密码子周边共有序列、有效的ORF是有效翻译所必需的。
2.密码子偏爱性对基因表达的影响
Ø为了提高外源基因的表达效率,在不改变其编码多肽链一级结构的前提下,可对外源基因的密码子进行相应的改造,使其含有受体细胞的主密码子。
3.翻译终止对基因表达的影响
ØUAA的终止效率最高,一般被选作翻译的终止密码子。
Ø有时为保证翻译的有效终止,通常将几个终止密码子串联在一起。
Ø据报道以UAAU作为终止密码子能有效终止多肽链的合成。
4.表达系统对表达产物的影响
Ø表达载体和受体细胞共同组成了外源基因的表达系统。
四、优化外源基因在原核细胞中表达的策略
Ø1.转录水平优化:
–选用强启动子或可调控的诱导型启动子
–选用强转录终止子或将两个转录终止子串联,以增强终止效果
–提高外源mRNA分子稳定性
Ø2.翻译水平的优化
–优化翻译起始区
Ø起始密码选用受体细胞使用率最高起始密码子ATG
Ø翻译增强子
–翻译的终止
Ø设计表达载体时,通常加入三个终止密码子以防止核糖体的跳跃。
ØUAAU是大肠杆菌中最有效的翻译终止序列。
–密码子的选择
Ø在受体菌中共表达稀有密码子tRNA基因,以提高稀有密码子tRNA的丰度
Ø将外源基因的稀有密码改为受体菌中的偏爱密码子
Ø3.提高目的产物的稳定性
Ø4.质粒的拷贝数:
采用高拷贝质粒提高外源基因表达量
Ø5.宿主菌的选择:
表达载体必需与宿主相互匹配,因为表达载体上的复制子和启动子只能由宿主细胞中特定的酶和转录因子所识别。
Ø6.培养条件的优化
培养基成分环境因素(如温度、pH、溶氧等)诱导时间和诱导剂量等
第9章外源基因表达产物的分离纯化
离子交换层析
离子交换层析是以离子交换剂为固定相,以特定的含离子溶液为流动相,利用离子交换剂
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