生物技术引论与实践论文.docx
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生物技术引论与实践论文
生物技术引论与实践论文
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生物技术引论与实践实验
摘要:
本实验以现代生物技术的核心“基因工程技术”为主要内容;以试验设计的整体性,连贯性为主要出发点;各试验之间即独立又相互联系,前一个实验的结果又是后一个实验的材料,使学生在掌握基础理论和技术的同时,树立全面、整体的试验观念。
其中实验一到实验十二是核心实验内容,包括了以大肠杆菌为代表的微生物实验技术、基因克隆技术、基因表达技术和蛋白质研究技术,且各实验相互连续,构成一个整体。
经过一周的实验我所做实验中大部分都得到相应的结果,并有相应的图片证明
前言:
生物技术是以生命科学理论为基础,研究它意义在于利用生物的特性或功能,设计构建具有预期性状的新物种或新品系,以及与工程原理相结合进行生物产品生产或为社会服务的综合性技术领域,广泛应用与医药卫生、轻工、化工、农业、生物能源工业、生物材料工业和环境保护与治理等方面。
生物技术已成为21实际经济发展的支柱产业,是目前公认的最有发展前景的技术之一。
我国在“十·五、十一·五发展规划”中已将生物技术列为重点发展的高新技术之一,生物技术及其产业化水平已成为衡量一个国家高新技术发展水平的一个重要指标。
因此,加强生物技术专业教育,培养既具有扎实的理论知识,又具备高水品的实践能力和创新能力的高级专门人才,对促进和发展我国生物高新技术及其产业,为地方经济和社会发展服务具有重要的意义。
经过多年的研究发展成果:
郑景生、吕蓓对PCR技术及实用方法研究
解庭波对大肠杆菌表达系统的研究进展
1、材料与方法
1.1材料
双蒸馏水、胰蛋白胨、NaCl、酵母提取物、琼脂粉、氨苄青霉素钠盐75%消毒酒精。
试剂盒,TAE电泳缓冲液,琼脂糖,经活化的大肠杆菌(E.coil)DH5单菌落、已灭菌的LB液体培养基5mL/支试管(无抗生素)和LB液体培养基100mL(无抗生素)T-VectorKIT试剂盒(TAKARA公司)
大肠杆菌(E.coil)DH5对数期菌液、外源基因,氨苄青霉素溶液、0.1mol/LCaCl2溶液、甘油、LB液体培养基5mL/支试管(加氨苄青霉素)
转化重组质粒的宿主菌:
E.coliDH5α,或JM系列等具有α-互补能力的菌株。
X-gal储液(20mg/ml):
用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的储液,包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏,储存于-20℃。
IPTG储液(200mg/ml):
在800μl蒸馏水中溶解200mgIPTG后,用蒸馏水定容至1ml,用0.22μm滤膜过滤除菌,分装于eppendorf管并储于-20℃。
含X-gal和IPTG的筛选培养基:
在事先制备好的含50μg/mlAmp的LB平板表面加40mlX-gal储液和4μlIPTG储液,用无菌玻棒将溶液涂匀,置于37℃下放置3-4小时,使培养基表面的液体完全被吸收。
10×PCR缓冲液配制(部分随Taq酶提供):
250~500mmol/LKCl;100~500mmol/LTris-Cl(pH8.4);15~20mmol/LMgCl2;0.5%Tween-20;1mg/LBSA
dNTP混合液、Taq聚合酶、琼脂糖凝胶
STE:
溶液I(50mmol/L葡萄糖,10mmol/LEDTApH8.0,25mmol/LTris-HClpH8.0),
溶液II(0.2mol/LNaOH,1%SDS(m/v)),
溶液III(每100ml的溶液III中含60ml5mol/L乙酸钾,11.5ml冰乙酸,28.5mlH2O),
TE,氯仿/酚,无水乙醇。
EcoRI酶及其酶切缓冲液;HindⅢ酶及其酶切缓冲液;TAE电泳缓冲液IPTG储液(100mM):
在800μl蒸馏水中溶解200mgIPTG后,用蒸馏水定容至1ml,用0.22μm滤膜过滤除菌,分装于eppendorf管并储于-20℃。
工程菌BL21(DE3)pET-32a,工程菌BL21(DE3)p32a-eGFP(购于Novagen)
1.5mol/LTris-ClPH8.8(4℃存放)
0.5mol/LTris-ClPH6.8(4℃存放)
10%SDS(室温存放)
30%Acr/Bis29.2gAcr+0.8gBis,用双蒸水定容至100mL,过滤备用,4℃存放
10%Aps(-20℃存放)
2×上样缓冲液(室温存放)(总体积10mL)
0.5mol/LTris.HClpH6.82mL
甘油2mL
20%(W/V)SDS2mL
0.1%溴酚蓝0.5mL
2-β-巯基乙醇1.0mL
双蒸水2.5mL
电泳缓冲液(室温存放)
Tris7.5g、Gly36g、SDS2.5g双蒸水溶解,定容至500mL,使用时稀释5倍使用。
染色液:
0.2g考马斯亮蓝R250+84mL95%乙醇+20mL冰醋酸,定容至200mL,过滤
脱色液:
工业酒精:
冰醋酸:
水=4:
1:
5(V:
V:
V)ml
电子天平、电磁炉、高压蒸汽灭菌锅三角瓶、量筒、天平、记号笔、封口膜、橡皮筋。
无菌培养皿、超净工作台、、冰箱、接种环、打火机、酒精灯、恒温培养箱PCR扩增仪,台式高速离心机,经高压灭菌后的Eppendorf管,电泳仪,恒温摇床、分光光度计、、移液器及吸头低温离心机、恒温水浴锅、移液器及吸头(50uL、200uL、1000uL)PCR薄壁管微波炉,凝胶成像分析系统高速冷冻离心机,平板电泳槽及配套的玻璃板,胶条,梳子
1.2方法
1.2.1:
大肠杆菌液体培养基和固体筛选培养基制备
1.2.2:
大肠杆菌工程菌平板培养
1.2.3:
PCR扩增目的基因片段
1.2.4:
回收目的基因片段与载体连接
1.2.5:
大肠杆菌液体培养
1.2.6:
大肠杆菌感受态细胞制备及转化
1.2.7:
筛选重组转化菌落
1.2.8:
菌液PCR分析
1.2.9:
提取大肠杆菌重组质粒DNA和酶切分析(1.2.9.1大肠杆菌质粒DNA的提取1.2.9.2酶切分析)
1.2.10:
培养工程菌诱导外源基因表达
1.2.11:
SDS-PAGE检测外源基因的表达
2、与分析
2.1:
大肠杆菌菌液液体培养基
本次实验配制LB液体培养基、LB固体培养基、氨苄青霉素溶液,全过程没有重大失误成功的完成了实验。
2.2:
大肠杆菌工程菌平板培养结果与分析
本次实验成功的培育出较好大肠杆菌菌落,成功是在于实验中灭菌以及接种较好。
2.3:
PCR扩增目的基因片段结果与分析
取出经PCR的反应的样品,电泳跑板得到相应条纹带如图所示
2.4:
回收目的基因片段与载体连接结果与分析
(失败)
2.5:
大肠杆菌液体培养结果与分析
经过过夜培养后得到大量菌体如图所示
2.6:
大肠杆菌感受态细胞制备及转化结果与分析
本实验中成功的制备感受态细胞和转化这个结论是通过后期的实验得到验证的。
2.7筛选重组转化菌落结果与分析
2.8菌液PCR分析结果与分析
本实验取出经PCR的反应的样品,电泳跑板得到相应条纹带如图所示
2.9提取大肠杆菌重组质粒DNA和酶切分析(1.2.9.1大肠杆菌质粒DNA的提取1.2.9.2酶切分析)
使用分别得到如图所示
2.10培养工程菌诱导外源基因表达
2.11SDS-PAGE检测外源基因的表达
3、讨论
(1)制备培养基应该注意哪些问题?
²准确称量
²高温蒸汽灭菌
²实验中要尽量避免其他杂质的混入
(2)仪器操作时应该注意哪些问题?
量液操作注意问题:
²未装吸嘴的微量移液器绝对不可用来吸取任何液体。
²一定要在允许量程范围内设定容量,千万不要将读
²数的调节超出其适用的刻度范围,否则会造成损坏。
²不要横放或倒拿带有残余液体吸嘴的移液器。
²不要用大量程的移液器移取小体积样品。
²移液器使用完后,将刻度调到最大刻度,收藏。
离心机注意事项:
²离心机在运转时,不得移动离心机,不要打开门盖。
²安放离心机的台面应坚实平整,四只橡胶机脚都应与台面接触和均匀受力,以免产生振动。
²离心管加液要平衡,若加液差异过大运转时会产生大的振动,此时应停机检查,使加液符合要求,离心试管必须对称放入。
²若运转时有离心试管破裂,会引起较大振动应立即停机处理。
²离心机彻底停止后,才可开盖,取样。
生物电泳图像分析系统注意事项:
²不要戴“脏”手套触摸电脑鼠标、键盘及其它位置;
²不要戴“脏”手套触摸仓门和灯箱电源开关;
²不要戴“脏”手套触摸外接电源开关;
²在图像获取过程中,若通过软件打开紫外/可见光,则必须再通过软件关闭,若通过紫外与可见分析装置上打开紫外/可见光,则从分析装置上关闭,严禁互用,导致紫外灯长亮。
电泳仪使用注意事项:
²电泳仪工作时,禁止人体接触电极、电泳物及其它可能带电部分,也不能到电泳槽内取放东西,以免触电,同时要求仪器有良好接地端,以防漏电。
²仪器通电后,不要临时增加或拨除输出导线插头,以防短路。
²由于不同介质支持物的电阻值不同,电泳所通过的电流量也不同,其泳动速度及泳至终点所需时间也不同,故不同介质支持物的电泳不要同时在同一电泳仪上进行。
²使用过程中发现异常现象,如较大噪音、放电或异常气味,须立即切断电源,进行检修,以免发生意外。
超净工作台使用注意事项:
²工作台面上,不要存
²放不必要的物品,以保持工作区内的洁净气流不受干扰。
²操作时一定注意关掉紫外,防止对实验人员造成伤害
高温灭菌锅的使用注意事项:
²如是手动的灭菌锅,灭菌过程中,应注意排净锅内冷空气,否则会影响灭菌效果。
²灭菌结束后,要等温度降为“0”,才可打开灭菌锅锅盖;
²高压蒸汽灭菌时,须保持高温高压,因此必须严格按照操作规程操作,否则易发生意外事故。
(3)实验操作过程中,自己所遇到的问题,以及应急措施?
实验室应急物资储备
²急救箱:
包括常用的伤口处理药品和特殊的解毒剂等
²应急电话:
安装在缓冲区
²工具:
锤子、(斧子)、扳手、螺丝刀、(绳梯)等
²适合实验室使用的灭火器、(灭火毯)
²房间消毒设备,如喷雾器和甲醛熏蒸器
²划分危险区域界限的器材和警告标示
²全套防护服(*连体防护服、手套和头套—用于涉及第一
²类和第二类病原微生物的事故)
²有效防护化学物质和颗粒的全面罩式防毒面具
²担架
微生物实验室常见意外事故
²手套损坏、污染及衣物污染
²感染性物质溅洒污染皮肤及粘膜
²刺伤、切割伤或擦伤
²潜在危害性气溶胶的释放(两种情况)
²容器破碎及感染性物质溢出在台面、地面和其他表面
²未装可封闭离心桶的离心机内盛有潜在感染性物质的离
²心管发生破裂
²在可封闭的离心桶(安全杯)内离心管发生破裂
²操作人员突然晕倒
本次实验中尚无重大事故产生,只有在一次超净工作台中不小心把手上的酒精点燃了由于反应快及时用抹布盖住,才把手上的火灭了。
4、参考文献
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中国轻工业出版社,200l:
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上海:
上海科学技术出版社,1986,12
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卢圣栋.现代分子生物学实验技术.北京:
高等教育出版社,1993.287~289
刘进元等.分子生物学实验指导.北京:
清华大学出版社,2002.22~25
魏群.分子生物学实验指导.北京:
高等教育出版社,1999.53~55
朱玉贤,李毅.现代分子生物学(第二版).北京:
高等教育出版社,2002.153
朱玉贤,李毅.现代分子生物学(第二版).北京:
高等教育出版社,2002.153
《生物化学与分子生物学》,科学出版社,第二版;
《生物化学与分子生物学实验教程》第四军医大学出版社(2010)
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