乙型肝炎病毒基因检测方法研究.docx
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乙型肝炎病毒基因检测方法研究
乙型肝炎病毒基因检测方法研究
中华临床新医学ckneseChmc~NewM~cine2005年第5卷第9期819
?
临床研究?
乙型肝炎病毒基因检测方法研究
杨建林薛宝莲
【中圈分类号】12.62【文献标识码】B【文章编号】168o一9866(2O05)一o9—0819—02
摘要目的建立简便,准确,实用的检测乙型肝炎病毒(HBv)基因变异的方法.方法根据HBV基因序列,用巢式聚合
酶链反应(nest~PCR)分别扩增HBVP基因B区和前c区片段,产物用Apau,SSP1,~U361酶切,30%Acr胶电泳,分析酶切产物片段
长度,建立检测P基因与前c基因变异的方法,对5O例慢性乙型肝炎(慢乙肝)患者检测YMDD和前c区基因序列变异.结果所
建的nestedPCR方法操作简便,快速,结果准确,经济成本低,灵敏度高,可检测到103拷贝/mI的HBV—DNA.50例慢乙肝患者中,
单纯YMDD变异的32例,合并前c变异的4例.20例健康体检者,血清作为阴性对照.结论本方法简便准确,适合较大样本检
测,可用于临床常见拉米夫定耐药性HBvP基因变异与前C区基因变异的筛检.
关键词乙型肝炎病毒;变异基因;变异基因检测
为建立简便,准确,实用的检测乙型肝炎病毒基因变异的方
法,笔者根据其基因序列,用巢式聚合酶链反应的方法,分别扩
增其B区和前c区片断.分析其酶切产物片断长度,并用此方
法对5o例慢性乙肝患者进行检测.结果证实,本方法简便,准
确,灵敏度高,适合较大样本检测.报告如下.
1对象和方法
1.1血清标本来源所有标本均来自我院就诊的患者,男32
例,女18例,年龄16—46岁,用拉米夫定6个月一3a,变异基因
的血清标本均一加℃保存.变异基因的阳性血清标本来自北京
佑安医院肝病研究所.
1.2试剂来源及方法乙肝五项:
试剂来源于上海荣盛生物技
术有限公司,用酶联免疫法检测.
珊V—DNA:
试剂来源于深圳市匹基生物工程股份有限公
司,用荧光定量分析法检测.
变异基因:
患者在未用拉米夫定时检测一次乙肝五项和
哪V—DNA,如,抗一HBe,HBV—DNA阳性,HBeAg阴性的
标本和HBV—DNA阳阳,符合用拉米夫定的开始用拉米夫定治
疗,不定期检测HBV—DNA,如HBV—DNA由治疗前的阳性,治疗
后由阴性转变为阳性,选择后一次的阳性标本,如治疗后}玎Bv—
DNA一直仍阳性,选择治疗前与治疗后最后一次阳性标本.
1.2.1试剂来源所有试剂均由北京佑安医院肝病研究所提供.
1.2.2PCR所用引物序列见表1.
衰1PCR所用引物序列
引物
Sl
S2
s4
引物序列
5一ⅡC,C~C顷CCC一3
5一CATC兀’G兀,口rAC】1AC】1G一3
5一Grr(:
AAATcTATACCCAAAGC一3
5一GqV,GCA~CTCAGTCCGTrI℃TC一3
1.2.3变异基因检测万法1O血清加5O裂解液,95℃汽浴
15rnin,120or/rnin离心2rnin,弃去上清液,沉淀物用于PCR.扩
增模板.
1.2.3.1MDD基因扩增与前c区基因P(扩增先用引
物1(S1),引物2()作PCR扩增.
Sl,各1.5,10*Bur3,DNTP2.,Taq—E0.8,反
应总体积为31.循环参数:
94℃300s预变性,94℃30s,55℃
45s72℃30s,共循环35圈.72℃延伸420s.
1.2.3.2前C区基因PCR.扩增引物3(S3),引物49(sd)各
1.5,其余成分不变,循环参数:
94℃60os预变性,94℃3os,55%
30s,72℃6os,共循环35圈.72℃延伸420s.
1.2.3.3前c区扩增产物的酶切BS~614U,BsA0.2,1O*
作者单位:
017000内蒙古鄂尔多斯市第二人民医院
Bur2,}{2014,混匀后每份分装16,取PCR2扩增产物4.
37℃水浴1h.
YMDD扩增产物的酶切,Apa1l3.5U/份,1O*Bur2U1,BSA
0.2,014.或sSp14u,10*Bur2,014.混匀后每
份分装16,取PCR.扩增产物4,37℃水浴1h.
酶切产物经30%Act(由亚甲基双丙烯酰胺和丙烯酰胺配
制)电泳1h,溴化乙淀染色5—1Ornin,紫外线分析仪上观察电泳
条带.
2结果
2.1变异株的鉴定ⅥDD出现171b~NA条带为野毒株,l49
bpDNA条带为变异株.YVDD出现315bpDNA条带为野毒株,
283bpDNA条带为变异株.前C区基因出现110bpDNA条带为野
毒株,~bpDNA条带为变异株.
2.2敏感性对不同HBV—DNA含量的血清标本进行巢式
PCR扩增,可检测到含量为103拷贝/mI的样本,表明巢式PCR
具有较高的敏感性.
2.3方法的重复性以上标本20例进行2次检测,结果均能
重复.
2.450倒检测样本结果单纯YVDD变异的23例(46%),ⅥDD
变异的22例(44%),前c区基因变异的1O例(加%),YVDD与
ⅥDD同时变异的18例(36%),YVDD合并前c区变异的5例
(10%),Y1DD合并前c区变异的5例(10%),三者同时变异的4
例(8%).加例阴性对照者检测的三项变异指标均为阴性.
3讨论
近年来发现HBV可出现多种变异,可使HBV感染后,HBV
感染标志物不典型,变异后可加重病情,或出现耐药或免疫逃疫
现象,给诊断和治疗及预防造成困难,因而HBV变异的研究对
了解发病机理,病理判断,诊断,治疗及预后均有关系.
3.1前c区变异由于AA28的变异,使HBe艟不能产生或合
成障碍,而c蛋白仍能产生,患者表现为血清HBsAg,抗一HBe
及HBV—DNA阳性,HBeAg阴性,常表现为进展性肝病及肝功能
衰竭.
3.2P区基因变异P区编码DNA聚合酶,对HBV复制起重
要作用,此区发生突变,则可能导致HBV复制改变或阻断.近
年来,抗HBV药物核苷类似物拉米夫定等的应用,亦发现HBV
变异,拉米夫定是一种非常强的抗病毒药物,其主要作用靶
HBV聚合酶,为其作用的主区,分为A,B,c,D,E5个活性区,其
中A,B,c为三磷酸核苷结合的催化位点,B,E区可能参与RNA
模板和启动子定位.C区包括YMW基因域,为酶催化的活性部
位,其中在逆转录病毒最多的变异是YM叻中的M变异如
YVDD或Ⅵ叻.文献报道,MDO变异最早可发生在治疗后2周
820中华临床新医学ChineseClinicalNewMedicine2005年第5卷第9期
内,一般发生在治疗后9个月(4%),1a(16%一32%),2a
(38%),3a(57%),4a(67%).体外实验也证实,一旦出现YM.
DD基因序列变异,HBV对拉米夫定敏感性明显降低.因此,临
床在长期用药过程中,开展HBVP基因耐药性变异检测,以指
导临床及时调整治疗方案,准确,合理用药,提高疗效.
目前检测HBV耐药性基因变异的方法很多,但是不是操作
复杂,就是成本或仪器,设备昂贵,具有局限性.本方法操作简
便,整个检测过程仅需10h,灵敏度高,能检测到1拷贝/
mlHBV—DNA,结果准确,成本低.无需特殊仪器,凡能进行
牛e牛搴牛e牛牛亭牛e牛牛e牛e,卜e牛e
PCR检测的实验室均能开展,是一种很好的检测方法,值得推广
应用.
参考文献
1.陆志檬,等.病毒性疾病诊疗新技术人民军医出版社,2002年月
lO月
2.丁静娟,张伟三,等.乙型肝炎病毒耐拉米夫定多聚酶基因变异检
测方法研究.中华实验和临床病毒学杂志,2004年3月
(收稿日期2OO5—06—19)(编辑寒梅)
牛e牛e牛e牛e牛e牛e牛e牛e牛亭牛e牛牛e
?
药物与临床?
口服降糖药的临床应用
苏德禹
【中图分类号】R969.4【文献标识码】B【文章编号】1680—98~(mos)一09—0820—01
糖尿病(DM)是严重危害人类健康的常见病,对人类的健康感性.由于只降低高血糖,因而不会引起低血糖反应.此类药
构成了严重威胁.寻求更有效的药物控制糖尿病的发展,减少物主要有苯乙双胍,二甲双胍,吡咯苯胍.苯乙双胍易引起乳酸
糖尿病的危害,是目前治疗糖尿病的主要方向.口服抗糖尿病性酸血症渐趋淘汰.吡咯苯胍能刺激胰岛素8细胞分泌,抗血
药物具有方便,快捷,无痛苦,可持续长期使用等优点,在临床被小板黏附,抑制脂肪分解,增加葡萄糖的利用,作用比苯乙双胍
广泛应用.强,不引起乳酸性酸血症.二甲双胍能明显改善糖尿病患者的
1磺酰腺类(SU)糖耐量和高胰岛素血症,对餐后餐前均有明显降低作用.
该类药物可特异性阻滞胰岛J3细胞上ATP敏感性钾通道,5嚏唑烷二酮类
导致膜去极化,促使电压依赖Ca2通道开放,引起胞浆内Ca2噻唑烷二酮类药物是近年来新开发的一种很有前途的胰岛
浓度升高,从而增加胰岛素分泌和释放.磺酰脲类适用于食素增敏剂,目前已经开发的同类药物有曲格列酮,噻格列酮等多
疗,运动,减重仍不能控制的非肥胖的2型糖尿病患者,第一代种.以曲格列酮研究最有深入,也最早在临床应用.噻唑烷二
有甲基磺丁脲D860,第二代格列本脲,格列喹酮,格列齐特,梅酮类机理尚未阐明,有人认为与其能抑制脂肪源性肿瘤坏死因
列波脲.格列喹酮其作用强,剂量小,不良反应相对较小已广泛子一a(TNF—a)产生有关,因为脂肪源TNF—a可降低骨骼肌细
应用于临床,主要从胆汁排泄,可改善肾脏血流,较少引起肾功胞的胰岛素受体的酪氨酸激酶活性,抑制胰岛素受体底物一I
能障碍,适用于肾功能轻中度不良的2型糖尿患者,第三代的的磷酸化并抑制葡萄糖转运因子一4的表达,从而引起胰岛素
格列美脲除具有第一代的作用机制外,还能增加组织对胰岛素的抵抗,而噻唑烷二酮可明显抑制脂肪组织产生TNF—a,并可
的敏感性而发挥降血糖作用.促进GLU一4在骨骼肌的表达,从而提高机体的胰岛素的敏感
2快速促胰岛素分泌型性0’.
此类药物为苯甲酸和苯丙氨酸衍生物,主要药物有美格列
定及其衍生物,瑞格列萘,美格列萘,瑞格列定,那格列定,吗啉
胍化合物等.瑞格列萘是苯甲酸衍生物,是促胰岛素分泌剂,其
作用机制是通过与胰岛8细胞膜上的特异性受体结合来促进胰
岛细胞上ATP的敏感性K通道关闭,抑制K从8细胞外流,使
细胞膜去极化,从而开放电压依赖的Cd通道,使细胞外Ca2
进入胞内,促进储存的胰岛素分泌,瑞格列萘对功能受损的胰
岛细胞起到保护作用,它最大的优点是可以模仿胰岛素的生理
性分泌,该药主要适用于2型糖尿病患者.
3伍一葡萄糖药醴抑制剂
这类药物能抑制小肠上皮刷状缘的a葡萄糖苷酶,使肠内
葡萄糖的产生吸收减慢,降低餐后血糖,适用餐后高血糖,并能
改善外周靶组织对胰岛素的敏感性,减少糖尿病患者的胰岛素
的用量.目前常用阿卡波糖,优格列波糖,两者降糖作用相当,
作用位点稍有差异,优格列波糖肠胀气等反应较小.
4双胍类
主要用于肥胖的2型糖尿病,常与磺脲类或胰岛素合用,主
要通过增强外周组织糖的无氧酵解,增加组织细胞对糖的利用,
抑制肝糖原异生及肝糖生成,抑制或延迟肠壁细胞对葡萄糖的
摄取而降低餐后高血糖.本类药物还能改善组织对胰岛素的敏
作者单位:
365000福建省三明市第一医院药剂科
随着糖尿病基础理论研究的深入及临床药理学的迅速发
展,口服降糖药物的研究与开发取得了很大的发展,为糖尿病的
防治拓展了更加广阔的空间,各类降糖药特点各异,应采取个体
化给药,以更好地控制血糖,减少并发症的发生.
参考文献
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(1):
29~30
(收稿日期2005—07—12)(编辑尹卫群)
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