高效液相色谱总结2.docx
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高效液相色谱总结2.docx
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高效液相色谱总结2
第二部分实际应用
一:
高效液相色谱法(HPLC)复核细则
一、对起草单位的要求:
1.HPLC法用于药品的有关物质检查或含量测定时,需提供建立HPLC法的依据及参考文献。
2.应对建立的方法进行论证,按照中国药典2000年版二部凡例与附录收载的药品质量标准分析方法验证项下所列的要求进行试验。
3.建立方法时,应考虑下列事项:
①首选填料为十八烷基键合硅胶,并至少对两根不同品牌的色谱柱进行比较试验,其中一根为国产柱。
②流动相首选甲醇-水系统,应尽可能少用含有缓冲液的流动相,如为碱性药物,流动相的pH值应为7~8;如为酸性药物,流动相的pH值应为3~4。
③尽可能选用流动相作为溶剂,如未能选用,应说明原因。
④内标物应首选易得到的纯度较高的化学试剂或对照品,应与待测物质化学结构相似,理化性质接近,峰的响应值相当,以及分离度应大于1.5,另应考虑对照品的来源问题。
⑤检测器首选UV检测器。
4.采用HPLC法进行有关物质检查时,如杂质峰的响应值与主成分峰的响应值相差太大,应首选自身对照法,而不宜选用面积归一化法。
5.HPLC法用于原料药的含量测定。
如以内标法测定含量,应考虑内标物是否含有干扰供试品的杂质;如以外标法测定含量,对照品与供试品应各取样2份,对照晶溶液各进样3次,供试品溶液各进样2次,计算相对标准差(RSD应不得大于l.5%)。
二、对复核单位的要求:
1.按照起草单位提供的色谱条件与方法进行复核。
2.当HPLC法用于有关物质的检查时,应进行最低捡出量试验。
3.应考虑对同一样品分析结果的重现程度、方法的可行性,并作出评价。
Agilent1100高压液相色谱仪基本操作步骤Agilent1100液相基本操作步骤
(一)、开机:
1、打开计算机,进入WindowsNT(或Windows2000)画面,并运行BootpServer程序。
2、打开1100LC各模块电源。
3、待各模块自检完成后,双击Instrument1Online图标,化学工作站自动与1100LC通讯,进入的工作站画面。
4、从“View”菜单中选择“MethodandRuncontrol”画面,单击”View”菜单中的“ShowTopToolbar”,“Showstatustoolbar”,“Systemdiagram”,”Samplingdiagram”,使其命令前有“√”标志,来调用所需的界面。
5、把流动相放入溶剂瓶中。
6、打开Purge阀。
7、单击Pump图标,出现参数设定菜单,单击Setuppump选项,进入泵编辑画面。
8、设Flow:
5ml/min,单击OK。
9、单击Pump图标,出现参数设定菜单,单击Pumpcontrol选项,选中On,单击OK,则系统开始Purge,直到管线内(由溶剂瓶到泵入口)无气泡为止,切换通道继续Purge,直到所有要用通道无气泡为止。
10、单击Pump图标,出现参数设定菜单,单击PumpControl选项,选中Off,单击Ok关泵,关闭Purge valve。
11、单击Pump图标,出现参数设定菜单,单击Setuppump选项,进入Pump编辑画面,设Flow:
1.0ml/min。
12、单击泵下面的瓶图标,输入溶剂的实际体积和瓶体积。
也可输入停泵的体积。
单击Ok。
(二)数据采集方法编辑:
1、开始编辑完整方法:
●从“Method”菜单中选择“Editentiremethod”项,如上图所示选中除“Data analysis”外的三项,单击Ok,进入下一画面。
2、方法信息:
●在“MethodComments”中加入方法的信息(如:
方法的用途等)。
●单击Ok进入下一画面。
3、泵参数设定:
(以二元泵为例)
●在“Flow”处输入流量,如1ml/min,在“SolventB”处输入70.0,(A=100-B),也可Insert一行”Timetable”,编辑梯度。
在“PressureLimitsMax”处输入柱子的最大耐高压,以保护柱子。
● 单击Ok进入下一画面。
4、自动进样器参数设定:
●选择合适的进样方式,进样体积1.0ul,洗瓶位置为6号。
“StandardInjection”----只能输入进样体积,此方式无洗针功能。
“InjectionwithNeedleWash”----可以输入进样体积和洗瓶位置,此方式针从样品瓶抽完样品后,会在洗瓶中洗针。
“Useinjectorprogram”---可以点击Edit键进行进样程序编辑。
●点击Ok进入下一画面。
5、柱温箱参数设定:
●在”Temperature”下面的方框内输入所需温度,并选中它,点击”more>>”键,如图所示,选中”Sameasleft”---使柱温箱的温度左右一致。
●点击ok进入下一画面。
6、VWD检测器参数设定:
●在”Wavelength”下方的空白处输入所需的检测波长,如254nm, 在”Peakwidth(Responsetime)”下方点击下拉式三角框,选择合适的响应时间,如>0.1min (2s)。
●在Timetable中可以“Insert”一行,输入随时间切换的波长,如1min ,波长=300nm。
点击ok进入下一画面。
7、DAD检测器参数设定:
●检测波长:
254nm,BW=30nm, 参比波长=350nm,BW=100nm;
●检测波长:
一般选择最大吸收处的波长。
样品带宽BW:
一般选择最大吸收值一半处的整个宽度。
参比波长:
一般选择在靠近样品信号的无吸收或低吸收区域。
参比带宽BW:
至少要与样品信号的带宽相等,许多情况下用100nm作为缺省值。
Peakwidth(Responsetime):
其值尽可能接近要测的窄峰峰宽。
Slit—狭缝窄,光谱分辨率高;宽时,噪音低。
同时可以输入采集光谱方式,步长,范围,阈值。
选中所用的灯。
●点击Ok进入下一画面。
8、RID检测器参数设定:
●色谱条件:
进样体积:
20ul。
光学单元温度:
Off。
极性:
正。
峰宽(响应时间):
4s 。
●“OpticalUnitTemperature”---若环境温度控制在±2℃,设定为Off, 若环境温度不稳定,则设定光学单元温度为高于环境温度5度,以防样品在池中沉淀。
“Peakwidth”---大多数分析设为4S,只有在高速分析下设为更短。
“Automaticrecyclingafteranalysis”---在不进行分析时可以让流动相循环,节省流动相,检测器连续运行,可随时投入使用。
●点击RID图标,选择RID Control:
Heater设为On,若要循环流动相,必须将“RecyclingValve”设为ON。
手动purge参比池,将其设为On,并输入Purge时间。
9、FLD检测器参数设定:
色谱条件:
● 样品:
P/N01018-68704 用甲醇稀释为1:
10。
● 进样体积:
5ul。
● 柱温箱:
30℃。
EX=246nm,EM=317nm,PMT=10。
● 响应时间=4s. 停止时间:
出峰完毕。
● ExcitationA:
激发波长:
200-700nm,步长为1nm,或ZeroOrder。
● Emission:
发射波长:
280-900nm,步长为1nm,或ZeroOrder。
● PMT:
大多数应用适当的设定值为10,若高浓度样品峰被切平头,则减少PMT值。
● “Peakwidth”:
大多数应用设为4s,只有快速分析采用小的设定值。
● MultiEx:
多波长及光谱(激发)。
● MultiEm:
多波长及光谱(发射)。
● 同时可以输入范围Range、步长step、采集光谱。
10、在“Runtimechecklist”中选中“Dataacquisition”,单击Ok。
11、单击“Method”菜单,选中“Savemethodas”,输入一方法名,如“test”,单击Ok。
12、从菜单“View”中选中”Onlinesignal”,选中Windows1,然后单击Change钮,将所要绘图的信号移到右边的框中,点击Ok.(如同时检测二个信号,则重复12,选中Windows2)。
13、从“Run control”菜单中选择“Sampleinfo”选项,如上图所示,输入操作者名称,在“Datafile”中选择“Manual”或“Prefix”。
区别:
Manual--每次做样之前必须给出新名字,否则仪器会将上次的数据覆盖。
Prefix—在Prefix框中输入前缀,在Counter框中输入计数器的起始位,仪器会自动命名,如vwd0001,vwd0002……。
14、从Instrument菜单选择Systemon。
15、等仪器Ready,基线平稳,从Method菜单中选择“Runmethod”,进样。
(三)、数据分析方法编辑:
1、从“View”菜单中,单击“Dataanalysis”进入数据分析画面。
2、从“File”菜单选择“Loadsignal”,选中您的数据文件名,如下图所示。
单击Ok。
3、做谱图优化,从“Graphics”菜单中选择“Signaloptions”选项,。
从Ranges中选择Autoscale及合适的显示时间,单击ok,或选择”UseRanges”调整。
反复进行,直到图的比例合适为止。
4、积分:
(1)、从“Integration”中选择“Autointegrate”,如积分结果不理想,再从菜单中选择“Integration Events”选项,选择合适的Slopesensitivity,Peakwidth,Areareject,Heightreject。
(2)、从“Integration”菜单中选择“Integrate”选项,则数据被积分。
(3)、如积分结果不理想,则修改相应的积分参数,直到满意为止。
(4)、单击左边“√”图标,将积分参数存入方法。
5、打印报告:
(1)、从“Report”菜单中选择“Specifyreport”选项,进入如上画面。
(2)、单击“Quantitative Results”框中Calculate右侧的黑三角,选中Percent(面积百分比),其它选项不变。
(3)、单击Ok.
(4)、从“Report”菜单中选择“Printreport”,则报告结果将打印到屏幕上,如想输出到打印机上,则单击Report底部的“Print”钮。
(四)、关机:
● 关机前,用100%的水冲洗系统20分钟,然后用有机溶剂冲洗系统10分钟(如ACN),然后关泵,(适于反相色谱柱)。
[正相色谱柱用适当的溶剂冲洗]
● 退出化学工作站,及其它窗口,关闭计算机(用shutdown关)。
关掉Agilent1100电源开关。
Agilent1100高压液相色谱仪维护保养知识保养事项:
1、色谱柱长时间不用,存放时,柱内应充满溶剂,两端封死(如ACN适于反相色谱柱,正相色谱柱用相应的有机相)
2、对于手动进样器,当使用缓冲溶液时,要用水冲洗进样口,同时搬动进样阀数次,每次数毫升。
3、流动相使用前必须过滤,不要使用多日存放的蒸馏水(易长菌)。
4、带seal-wash的1100,要配制90%水+10%异丙醇,以每分2—3滴的速度虹吸排出,溶剂不能干涸。
5、其它主意事项见说明书,或由现场工程师介绍。
Waters600E-2487HPLC系统SOPWaters高效液相色谱系统操作规程
1.目的
规范Waters高效液相色谱系统的使用和维护。
2.范围
本规程适用于Waters高效液相色谱系统的使用和维护。
3.职责
质检室仪器分析员负责Waters高效液相色谱系统的日常使用和维护。
4.系统组成
本系统由Waters600E多溶剂输送系统(有梯度控制器的高压输液泵)、Waters在线脱气机、Rheodyne7725i手动进样阀、Waters2487双通道紫外检测器、Millennium32色谱工作站/电脑等组成,另外还包括打印机、UPS和通风柜等辅助设备。
5.程序
5.1.准备
5.1.1.使用前应根据待检样品的检验方法准备所需的流动相(应足够;流动相必须用0.45μm滤膜过滤)、样品和标准溶液(也可在平衡系统时配制),更换合适的色谱柱(柱进出口位置应与流动相流向一致)和定量环。
5.1.2.通电前应检查仪器设备之间的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。
5.2.开机和泵操作
5.2.1.开机
5.2.1.1.接通UPS的电源,依次打开断电保护器、脱气机、600E泵、2487检测器,待检测器自检结束显示测量状态时,打开打印机、电脑显示器、主机。
5.2.1.2.打开Millennium32软件,按「Login...」,输入用户名和密码,按「OK」注册进入系统主界面。
在Project档内选择所需的项目,右击『RunSamples』图标,选择色谱系统“600_2487”后打开QuickSet窗口。
5.2.2.更换溶剂
5.2.2.1.打开600E泵后,转动进口集合管阀手柄(以下简称手柄)至RUN位置;
5.2.2.2.将一塑料烧杯放在参照阀出口管下以收集分流的溶剂,向右打开参照阀(断开柱和进样器);
5.2.2.3.按[Direct]键使其显示直接控制屏幕,设流速为1ml/min(梯度配比阀在0ml/min时不工作);
5.2.2.4.选择欲使用的某一溶剂通道,设其比例为100%,其它为0%;
5.2.2.5.将输液管从原有溶剂瓶中取出,放入一干净的空瓶中;
5.2.2.6.逆时钟转动手柄至DRAW位置,用启动注射器从进口集合管阀的接口抽出约2ml溶剂;
5.2.2.7.再将输液管放入新溶剂瓶内,继续抽吸直到新溶剂出来并无气泡为止;
5.2.2.8.转动手柄至RUN位置,将启动注射器取下并排掉筒内的溶剂。
5.2.2.9.重复5.2.2.4.~5.2.2.8.直至所有即将使用的溶剂更换完毕。
5.2.3.排气泡
5.2.3.1.打开参照阀,换流动相为100%超纯水,设流速为10ml/min(注意:
确认参照阀是打开的,否则可能损坏安装好的柱);
5.2.3.2.转动进口集合管阀手柄至DRAW位置,用启动注射器抽出约10ml水;
5.2.3.3.顺时钟转动手柄至INJ位置,缓慢用力使水通过泵头从参照阀出口管排出(注意不要将气泡注入泵中);
5.2.3.4.按[Stopflow]屏幕键停泵,关上参照阀。
5.2.3.5.如按以上方法不能排尽气泡,从柱入口处拆下泵出口管,用塑料管连接至塑料烧杯中,设流速为10ml/min,冲洗2~5min(或更长时间)后停泵,重新接上柱。
5.3.平衡系统(分两种情况进行)
5.3.1.等度模式
5.3.1.1.每次以0.1ml/min的增量加大流速至1ml/min,以超纯水冲洗系统10min。
5.3.1.2.检查管路连接、柱接口及泵头处是否漏液,如漏液应予以排除。
5.3.1.3.观察泵控制屏幕上的压力值,压力波动应在平均值的5~10%以内。
如超出此范围,可初步判断为柱前管路仍有气泡,重复5.2.3.下的步骤。
5.3.1.4.压力波动平稳后,换检验方法规定的流动相比例冲洗系统。
在检查基线稳定性前,让最少5~6倍柱体积的流动相通过系统。
5.3.1.5.在QuickSet窗口下的InstrumentMethod档内选择所需的仪器方法,按「Monitor」(此后泵由软件控制),观察基线和压力变化。
如果冲洗至基线漂移<10-3Au/min,噪声为10-4Au数量级,且压力平稳时,可认为系统已达到平衡状态,可以进样。
5.3.1.6.按「Abort」图标(左上第五个),停止监视基线。
5.3.2.梯度模式
5.3.2.1.按检验方法规定的条件冲洗平衡系统,并注意压力波动变化和排气泡。
5.3.2.2.在进样前运行1~2次空白梯度。
5.4.进样
5.4.1.在QuickSet窗口内左下部选〈Single〉标签,在SampleName档内填写试样名称;在Function档内选择试样类型(标准选“InjectStandards”;样品选“InjectSamples”);在MethodSet档内选择所需的方法组;在InjectionVolume档内输入进样体积;在RunTime档内输入记录时间。
5.4.2.用针头滤器过滤试样溶液(注射液可不必过滤),用试样溶液清洗注射器,并排除气泡后抽取适量。
5.4.2.1.如按部分装液法,用微量注射器定容进样时,进样量应不大于定量环体积的50%,并要求每次进样体积准确、相同;
5.4.2.2.如按完全装液法,用定量环定容进样时,进样量应不小于定量环体积的3倍(5~10倍准确性更佳)。
5.4.3.按〈Single〉标签内右边的进样(Inject)按钮,等待窗口底部状态档内显示“Waiting”后,方可进样。
5.4.4.将进样阀手柄转动至Load位置,将注射器针完全插入进样阀入口中,平稳地注入试样溶液,除另有规定外,让注射器留在进样阀上,将进样阀手柄快速转动至Inject位置,系统将自动运行,采集数据并记录图谱。
5.4.5.让进样阀手柄保持在Inject位置,到下次进样前1~2min切换回Load位置,将注射器从进样阀中拔出。
5.4.6.先用水再用试样溶液清洗注射器后,按以上程序继续进样,直至完成。
5.5.数据处理(外标法)和打印
5.5.1.右击系统主界面下的『BrowseProject』图标,选择相应的项目,按「OK」进入Project窗口,选〈Channels〉标签。
5.5.2.建立处理方法 选择一个待积分的标准,右击后选“Review”进入Review窗口。
按「ProcessingMethodWizard」图标(左边第一个)进入NewProcessingMethod向导窗口,按「OK」。
5.5.2.1.划入一个感兴趣的最窄的峰,按「Next>」;
5.5.2.2.划入一段包含噪声的基线,按「Next>」;
5.5.2.3.划入一段要积分的区间,按「Next>」;
5.5.2.4.根据情况选择最小峰面积和最小峰高,按「Next>」、「Next>」;
5.5.2.5.在Name档内输入各组分峰的名称,按「Next>」、「Next>」;
5.5.2.6.在MethodName档内填写方法名称,按「Finish」。
退出Review窗口。
5.5.3.修改标准 选中所有标准,右击后选“AlterSample”进入AlterSample窗口。
5.5.3.1.在SampleType档内将Unknown改成Standard;
5.5.3.2.按「Amount」图标(左上第六个)进入ComponentEditor窗口;
5.5.3.3.按「CopyfromProcessMethod」图标(左上第五个),选择刚建立的处理方法,按「Open」,在Value和Units档内分别输入标准所含各组分的数值和单位,完成后按「OK」回到AlterSample窗口;
5.5.3.4.按「Save」图标存盘,退出AlterSample窗口。
5.5.4.积分 先选中所有标准,再选中所有未知样品,右击后选“Process”进入BackgroundProcessing&Reporting窗口,选Usespecifiedprocessingmethods,在右边档内选择刚建立的处理方法,按「OK」。
5.5.5.打印 在Project窗口下选〈Results〉标签。
5.5.5.1.选中要打印的标准/样品,右击后选“Preview”进入OpenReportMethod窗口,选合适的打印方法,按「OK」进入ReportPublisher(Preview)窗口,预览打印的结果。
按打印(Print)图标(左上第二个)即可打印结果。
5.5.5.2.按「Close」可进入ReportPublisher窗口对报告方法进行修改,完成后按「Print」图标(右数第二个)即可打印结果。
5.5.6.数据处理完成后,关闭所有窗口,在主界面下按「Logout」退出系统,关闭Millennium32软件,再依次关闭电脑主机、显示器、打印机。
5.6.清洗系统和关机
5.6.1.数据采集完毕后,关闭检测器,继续以工作流动相冲洗10min后,换水冲洗。
5.6.2.清洗进样阀
5.6.2.1.用启动注射器吸10ml超纯水;
5.6.2.2.将注射针导入口冲洗头(Rheodyne部件号7125-054)连接到注射器出口上(不要针),并将它们一起接到进样口上;
5.6.2.3.使进样阀保持在Inject位置,慢慢将水推入,水将通过注射针导入口、引导管、注射针导入管和注射针密封圈,由样品溢出管排出。
5.6.3.清洗柱
5.6.3.1.C18柱先用超纯水以1ml/min冲洗40min以上,再用甲醇或乙腈冲洗20min。
5.6.3.2.ProteinPAK60柱先用超纯水冲洗90min以上,再用甲醇或乙腈冲洗40min。
5.6.4.用水冲洗柱后,分别用20ml超纯水冲洗柱塞杆外部和法兰盘上小孔。
5.6.5.清洗完成后,先将流速降到0,再依次关闭泵、脱气机、UPS,断开电源。
5.6.6.填写使用记录。
岛津HPLC操作规程
第一节岛津LC-10AT型HPLC操作规程
目的:
规范岛津LC-10AT型高效液相色谱仪的使用。
范围:
适用于岛津LC-10AT型高效液相色谱仪的使用。
职责:
质检员对本规程的实施负责。
一、系统组成
本系统由2个LC-10ATvp溶剂输送泵(分主/A泵和副/B泵)、Rheodyne7725i手动进样阀、SPD-10Avp紫外-可见检测器、N2000色谱数据工作站和电脑等组成,另外还包括打印机、不间断电源等辅助设备。
二、准备
1、准备所需的流动相,用
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- 高效 色谱 总结
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