测序结果处理方法及聚类分析DOC.docx
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测序结果处理方法及聚类分析DOC
一、测得序列的拼接及处理
1、送样类型
a非克隆法(如PCR产物、PCR产物纯化回收等)
由于此类型样品,两端的引物序列一般在测序的过程中会有缺失,很难找全引物序列,仅能找到部分引物序列,因此对于此类型样品的测序结果可以不做引物序列的查找,后续需要可再做引物序列的查找。
b克隆法(片段通过TA克隆或其他载体构建等)
此类型样品,目的片段两端的引物可以很完整的保存在载体中,引物序列亦是测序片段,所以引物序列比较完整,可以找到引物的完整序列,因此可以通过查找引物序列而找到目的片段的起始位置。
2、测序方法
观察峰值图可用软件“bioedit”
a单向测通
对于此种测序结果基本上单条序列不需要拼接,通过观察序列峰值图来初步判断序列结果的准确性,一般来说峰越尖越好,套峰越少越好。
b双向测通
对于此种测序结果,除了要观察峰值图的好坏外,要得到完整的序列,还需要对双向序列进行拼接,利用DNASTAR中seqMan进行拼接,点击“NEW”、“addsequence”(一般为abi格式,选择双向测序结果)、“assemble”,“contig”,一般保存完整的片段长度即选择“All”,亦可保存其中的片段长度,保存格式一般选择“fas”格式以便在不同的编辑软件中使用。
具体步骤如下图。
3、对测得的序列进行比对及聚类分析
一般来讲,可以将所有需要进行比对的序列粘贴在一个记事本中,保存的格式最好为“fas”格式,
,利用软件“MEGA”中“Align”打开所需序列,依据序列的特性进行选择如DNA或protein,然后添加所有需要进行比对的序列。
添加完成后,点击“alignment”选择进行比对的方法,一般可选用clustalw方法,也可根据序列的具体情况进行选择比对的方法,本教程选择“ClustalW”法。
比对完成后进行比对结果的保存,根据需要选择保存的类型,如用mega做聚类分析,可保存为该软件格式,或其他格式。
进行序列数据模型的分析,如图
结果
选择建树
聚类完成。
4、进化树构建
如若要构建进化树,则需要将目的片段序列,至“NCBI”或其他网站上进行“blast”,得到近源种或属,即指比对分值比较高的序列,同时需要选择亲缘关系较远的种或属序列,作为参考序列,进行比对和聚类分析,即得到进化树
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- 结果 处理 方法 聚类分析 DOC