干细胞因子联合粒细胞集落刺激因子动员骨髓干细胞促进单侧输尿管精.docx
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干细胞因子联合粒细胞集落刺激因子动员骨髓干细胞促进单侧输尿管精
干细胞因子联合粒细胞集落刺激因子动员骨髓干细胞促进单侧输尿管梗阻大鼠肾脏损伤修复作用的研究1
张建江,易著文,何小解,何庆南,党西强,吴小川,莫双红
中南大学湘雅二医院小儿肾脏病研究室,湖南省小儿肾脏病临床中心,长沙(410011
E-mail:
zhangjianjiang10@
摘要:
目的观察干细胞因子(SCF联合粒细胞集落刺激因子(G-CSF对单侧输尿管梗阻(UUO大鼠骨髓干细胞动员对肾间质中微血管、纤维化程度和肾功能的影响,并探讨其对微血管影响的可能机制。
方法128只大鼠随机分为假手术组(Sham组、SCF联合G-CSF动员组(SCF-G组、单侧输尿管梗阻组(UUO组、SCF联合G-CSF动员加梗阻组(UUO+SCF-G组。
于实验第5、14、21、28天每组各随机抽取8只处死,检测血清肌酐水平、肾间质CD34+表达细胞数目和Ⅷ因子阳性表达细胞数目、肾间质纤维化和间质的病理损害积分、肾皮质血管内皮生长因子(VEGFmRNA和血小板反应蛋白-1(TSP-1
①模型2周时即可见到肾间质纤维化伴肾小管周微血管的丢失;mRNA的表达。
结果UUO
②-G组肾间质干细胞归巢数目明显高于UUO组和Sham组;UUO+SCF
③-G组UUO+SCF
肾小管周微血管指数减少出现的时间晚于UUO组;④第14、21、28天UUO+SCF-G组间
⑤-G组术后VEGFmRNA表达质化纤维程度和肾小管损伤程度均轻于UUO组;UUO+SCF
⑥-G组术后TSP-1下降出现的时间晚于UUO组,且表达均高于同期UUO组;UUO+SCF
mRNA表达增高出现的时间晚于UUO组,且表达均低于同期UUO组;⑦在UUO组和UUO+SCF-G组中,肾小管周微血管指数与血清肌酐水平及间质纤维化积分、肾小管间质的病理积分均呈负相关;肾皮质VEGFmRNA表达与肾小管周微血管指数均呈正相关,肾皮
①大鼠中存在肾小管质TSP-1mRNA表达与肾小管周微血管指数均呈负相关。
结论UUO
周微血管的丢失,并与肾间质纤维化及间质病理损伤密切相关;
②联合应用SCF和G-CSF动员的骨髓干细胞可以归巢至受损的肾脏,有助于减少肾小管周微血管丢失,并进而减轻肾间质纤维化和间质损害,保护肾功能;③联合应用SCF和G-CSF,可以上调肾皮质VEGFmRNA水平和下调TSP-1mRNA水平,这可能是其促进内皮细胞修复及保护肾间质微血管损伤的机制之一。
关键词:
单侧输尿管梗阻,骨髓干细胞,干细胞因子,粒细胞细胞集落刺激因子,间质纤维化,肾小管周微血管,血管内皮生长因子,血小板反应蛋白-1
中图分类号:
R620
间质纤维化是慢性肾脏疾病进展的共同病理特征,最终进展为终末期肾衰[1],目前对此
尚缺乏有效的治疗措施。
Bohle等的研究[2]发现,多种进展性肾病存在肾间质微血管丢失,
并认为肾间质微血管的丢失是造成肾小管间质缺氧性损伤及间质纤维化的重要病因。
近年国
内外在心肌梗死领域应用骨髓干细胞进行治疗的报道较多,认为骨髓干细胞最终不能分化为
新的心肌细胞,但可促进受损组织的新生血管形成,心肌梗死患者可能受益于此[3,4]。
本研
究拟观察干细胞因子(SCF联合粒细胞集落刺激因子(G-CSF对单侧输尿管梗阻(UUO
大鼠骨髓干细胞动员后在肾间质的归巢及对肾间质中微血管、纤维化程度和肾功能的影响,
并探讨其对微血管影响的可能机制,以期为干细胞移植在肾脏疾病中的应用提供新的途径及
理论依据。
1本课题得到国家自然科学基金(项目号:
30672251及教育部博士点基金资助(项目号:
20040533043的资助。
1材料与方法
1.1实验动物
128只雄性Wistar大鼠(体重180-200g,由中南大学湘雅二医院实验动物中心提供。
随机分为4组,每组32只。
1.2主要材料
基因重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF,商品名:
瑞白购于山东齐鲁制药厂,干细胞因子(rhSCF购于成都地奥九泓制药厂,兔抗CD34多克隆抗体购于SantaCruz公司,兔抗Ⅷ因子相关抗原多克隆抗体及SP免疫组化染色试剂盒均购于北京中杉金桥生物技术有限公司,引物由上海生工合成。
1.3实验分组及方法
①假手术对照组(shamoperationgroup,Sham组。
手术分离右输尿管但不结扎输尿管。
术后当天即经皮下注射生理盐水2ml/(kg·d,连续5天。
②SCF联合G-CSF对照组(SCFandG-CSFcontrolgroup,SCF-G组。
皮下注射SCF200µg/(kg·d,G-CSF200µg/(kg·d,连续5天。
③单侧输尿管梗阻组(unilateralureteralobstructiongroup,UUO组。
行右侧输尿管结扎术。
术后当天即经皮下注射生理盐水2ml/(kg·d,连续5天。
④单侧输尿管梗阻加SCF联合G-CSF动员组(unilateralureteralobstructiontreatedwithSCFandG-CSFgroup,UUO+SCF-G组。
行右侧输尿管结扎术,术后当天即皮下注射SCF200µg/(kg·d,G-CSF200µg/(kg·d,连续5天。
于实验第5、14、21、28天每组各随机抽取8只大鼠处死,采集血液及右侧肾脏标本。
其中右肾除去肾包膜用生理盐水灌洗后分成二份,一份用10%的福尔马林固定以用于光镜检测和免疫组化检测,其余部分分离肾皮质,经液氮速冻保存后转入-70℃冰箱备用。
1.4指标检测
1.4.1检测四组大鼠血清肌酐水平:
日立7150型全自动生化分析仪测定。
1.4.2免疫组化染色检测肾间质CD34阳性表达细胞
染色后每张切片取肾皮质20个显微镜高倍视野(×400,分别计数每个视野肾小管间质中CD34+细胞数目,取其平均值。
1.4.3免疫组化染色检测肾间质Ⅷ因子阳性表达细胞
微血管免疫组化染色阳性细胞的量化参照文献[5]任何1个棕黄色的内皮细胞或内皮细胞簇作为1条微血管,只要结构不相连,其分支结构也作为1条血管计数(除外大的血管。
对每个标本观察肾皮质20个显微镜高倍视野(×400肾小管周围肾间质中微血管数,并取平均值,得出肾小管周微血管指数(peritubularcapillarindex,PCI。
1.4.4肾脏病理评分
HE、PAS及Masson染色后在光镜下观察肾组织形态改变,并进行间质纤维化及间质的病理损害积分,评分标准参照李志辉等的方法[6]。
1.4.5RT-PCR方法检测肾皮质血管内皮生长因子(VEGFmRNA和血小板反应蛋白-1(TSP-1mRNA的表达
VEGF引物序列为:
上游5/-TTCGTCCAACTTCTGGGCTGT-3/,下游5/-AGCAAGGCAAGGCTCCAATG-3/;TSP-1引物序列为:
上游5/-CATCAACACCGAAAGGGACG-3/,下游5/-AGCCCATAGTTCCAGAAGGTG-3/。
扩增片段长度VEGF为420bp,TSP-1为538bp。
GAPDH为内参。
PCR反应产物琼脂糖凝胶电泳后,用PhoretixID凝胶图像分析软件测定电泳条带的光密度,用内参校准后进行统计分析。
1.5统计学分析
采用SPSS13.0统计软件进行统计分析。
肾小球和小管间质的病理积分系将多项分类资料的结果数量化,其结果同其它定量资料一样,以均数±标准差(x±s表示,两组间均数采用t检验,多组间均数进行单因素方差分析。
对有相关趋势的变量,采用Pearson相关分析。
肾间质纤维化积分系单项分类资料的结果,按等级资料处理,两组之间比较采用秩和检验。
肾间质纤维化积分与其它资料的相关分析采用Spearman相关分析。
均以P<0.05视为有统计学意义。
2结果
2.1四组大鼠不同时间点血清肌酐水平的变化
UUO组与UUO+SCF-G组大鼠在术后第显著性(P<0.05。
余不14、21、28天,血清肌酐水平与Sham组相比均明显增高,差异有同时间点四组大鼠之间血清肌酐水平均无显著性差异(P>0.05(见表1。
表1.四组大鼠不同时间点血清肌酐的变化(µmol/L(x±s
第5天第14天第21天第28天
Sham24.11±7.8824.41±5.5321.95±5.3625.05±7.69
SCF-G22.19±7.0423.55±5.3622.44±4.8323.77±7.07
UUO25.54±7.8589.71±12.92a81.50±18.05a81.05±26.75a
UUO+SCF-G26.05±6.6785.33±14.72a84.08±20.38a77.99±22.20a
F0.44097.45249.41824.638
P0.7260.0000.0000.000
aP<0.05vs.Shamgroup.
2.2四组大鼠不同时间点肾小管间质中CD34阳性细胞数目的变化
CD34表达于细胞膜,既是干细胞的表面标志,也是血管内皮细胞的表面标志。
CD34阳性表达为苏木素核衬染下,细胞膜环状棕黄色染色。
在Sham组及SCF-G组,CD34+阳性表达见于肾小球内、肾间质内微血管及大的血管的内皮细胞,其他部位各时间点均未发现CD34+表达细胞。
而在UUO组和UUO+SCF-G组中,除了上述部位外,在部分损伤的小管部位亦见CD34+表达细胞,且UUO组肾间质CD34+表达细胞数目在术后第5天较Sham组及SCF-G组略有增多,UUO+SCF-G组则在第5、14、21肾间质CD34+表达细胞数目与其余三组相比均明显增多,差异有显著性(P<0.05。
SCF-G组与Sham组相比,肾间质CD34+表达细胞数目无显著性差异(P>0.05(见表2。
x±s表2.四组大鼠不同时间点肾小管间质中CD34+细胞数目变化(个/HP,10ⅹ40(
第5天第14天第21天第28天
Sham21.6±6.720.6±8.922.3±6.920.3±6.9
SCF-G23.4±7.123.4±5.922.6±10.022.3±7.8
UUO29.6±7.9a25.9±8.621.1±6.816.8±4.9
UUO+SCF-G44.1±10.6ab49.2±11.0ab38.0±11.0ab27.5±7.7b
F12.38717.9466.5213.362
P0.0000.0000.0020.033
aP<0.05vs.Shamgroup,
bP<0.05vs.UUOgroup.
2.3四组大鼠不同时间点肾小管周微血管指数的变化
以肾小管周Ⅷ因子免疫组化染色为棕黄色的内皮细胞作为微血管指数的依据,结果发现:
Sham组及SCF-G组各时间点肾小管周微血管指数均无显著性差异(P>0.05。
UUO组在术后14天肾小管周微血管指数较Sham组下降,随时间延长,微血管指数下降更为明显。
UUO+SCF-G组在术后21天肾小管周微血管指数始有下降趋势,28天时明显低于Sham组,但仍高于同期UUO组微血管指数(P<0.05(见表3。
x±s表3.四组大鼠不同时间点肾小管周微血管指数的变化(个/HP,10ⅹ40(
第5天第14天第21天第28天
Sham20.0±6.520.0±6.123.0±6.321.1±7.3
SCF-G22.8±8.223.5±7.422.3±8.220.9±7.7
UUO18.6±4.613.5±3.6a12.1±3.6a9.6±2.5a
UUO+SCF-G20.3±6.520.9±5.4b18.6±4.1b14.6±2.9ab
F0.5524.3335.8007.629
P0.6510.0130.0030.001
aP<0.05vs.Shamgroup,
bP<0.05vs.UUOgroup.
2.4四组大鼠不同时间点肾组织形态学变化及病理积分
2.4.1四组大鼠不同时间点肾组织形态学变化
Sham组在4周内肾组织形态学未发现明显变化。
SCF-G组各时间点肾组织形态学与Sham组相比无明显差异。
UUO组结扎侧肾脏随梗阻时间的延长而逐渐增大,肾盂内积液扩张,肾实质逐渐变薄。
术后第5天可见肾小管上皮细胞空泡变性,间质内有较多炎症细胞浸润。
第14天肾小管上皮细胞萎缩,管腔明显扩张,弥漫的炎症细胞浸润,纤维化形成,皮质变薄。
第21天肾小管数目更加减少,小管空泡变性明显,大量炎症细胞浸润及细胞增殖,间质纤维化程度进一步加重。
术后第28天,炎症细胞浸润仍明显,皮质极薄,扩张小管数量减少,纤维化更加明显,而肾小球仍无明显病变,仅见极少量肾小球有系膜增殖。
UUO+SCF-G组与UUO组相比,术后第5天两组之间无明显差异,第14、21、28天UUO+SCF-G组间质纤维程度和肾小管损伤程度均轻于UUO组。
未结扎的对侧肾脏组织未见明显的组织学变化。
2.4.2UUO组与UUO+SCF-G组大鼠不同时间点肾小管间质的病理积分变化
随时间延长,两组大鼠肾小管间质损害的程度均渐加重。
术后第5天,两组肾小管间质
的病理积分之间无显著性差异(P>0.05,余时间点UUO+SCF-G组大鼠肾小管间质的病理
积分均低于UUO组(P<0.05(见表4。
表4.UUO组与UUO+SCF-G组大鼠不同时间点肾小管间质病理积分变化(
x±s第5天第14天第21天第28天UUO5.0±1.28.1±1.211.5±1.613.8±1.7
UUO+SCF-G4.8±1.26.3±1.47.6±1.69.0±1.5
t0.4242.8424.8415.966
P0.6780.0130.0000.000
2.4.3UUO组与UUO+SCF-G组大鼠不同时间点肾间质纤维化的病理积分变化
随时间延长,两组大鼠肾间质纤维化的程度均渐加重。
术后第5天,两组肾间质纤维化
的病理积分之间无显著性差异(P>0.05,余时间点UUO+SCF-G组大鼠肾间质纤维化积分
均低于UUO组(P<0.05(见表5。
表5.UUO组与UUO+SCF-G组大鼠不同时间点肾间质纤维化的病理积分变化纤维化积分M(Q组别
例数5d14d21d28dUUO
80.5(1.01.0(1.02.0(1.03.0(2.0UUO+SCF-G80.0(1.00.5(1.01.0(1.01.5(2.0
T**64.0
51.044.049.5P0.6260.0290.0040.039*积分的中位数和全距;**采用两独立样本的秩和检验(WilcoxonW。
2.5不同时间点三组大鼠肾皮质VEGFmRNA表达的变化
假手术对照组肾皮质有一定量的VEGFmRNA表达。
在UUO组和UUO+SCF-G组术后
均有一过性的VEGFmRNA表达增高,随时间的延长,VEGFmRNA表达开始持续下降。
UUO+SCF-G组术后VEGFmRNA表达下降出现的时间晚于UUO组,且在术后第14、21、
28天VEGFmRNA表达水平均高于同期UUO组,差异有显著性(P<0.05(见表6。
表6.三组大鼠不同时间点肾皮质VEGFmRNA表达(x±s
第5天第14天第21天第28天
Sham0.23±0.050.22±0.050.23±0.030.22±0.04
UUO0.29±0.06a0.19±0.050.14±0.03a0.09±0.02a
UUO+SCF-G0.33±0.06a0.26±0.06b0.19±0.02ab0.13±0.03ab
F5.7464.05815.94932.088
P0.0100.0320.0000.000
aP<0.05vs.Shamgroup,
bP<0.05vs.UUOgroup.
2.6不同时间点三组大鼠肾皮质TSP-1mRNA表达的变化
假手术对照组肾皮质TSP-1mRNA表达量很低,UUO组在术后第5天即开始较假手术
对照组明显增高,差异有显著性(P<0.05,且随时间延长表达进一步增高,在术后第28
天TSP-1mRNA表达水平已达假手术对照组的2倍以上。
UUO+SCF-G组在术后第14天始
较假手术对照组明显增高,但仍低于同期UUO组水平,差异有显著性(P<0.05(见表7。
x±s
表7.三组大鼠不同时间点肾皮质TSP-1mRNA表达(
第5天第14天第21天第28天
Sham0.041±0.0150.043±0.0150.040±0.0160.043±0.016
UUO0.064±0.018a0.073±0.013a0.079±0.016a0.096±0.021a
UUO+SCF-G0.046±0.013b0.058±0.013ab0.061±0.015ab0.074±0.019ab
F4.6329.81812.22516.712
P0.0220.0010.0000.000
aP<0.05vs.Shamgroup,
bP<0.05vs.UUOgroup.
2.7UUO组和UUO+SCF-G组肾间质纤维化积分与肾小管间质的病理积分的相关分析
术后5-28天的肾间质纤维化积分与肾小管间质的病理积分之间作相关分析,在UUO组Spearman相关系数为r=0.655,P=0.000;在UUO+SCF-G组Spearman相关系数为r=0.553,P=0.001。
说明肾间质纤维化积分与肾小管间质的病理积分在两组内均呈正相关。
2.8UUO组和UUO+SCF-G组肾小管周微血管指数与血清尿素氮、肌酐水平及肾小管间质纤维化积分、间质病理积分的相关分析
在UUO组和UUO+SCF-G组术后5-28天的肾小管周微血管指数与血清肌酐水平及肾小管间质纤维化积分、间质病理积分均呈负相关(P<0.05。
(见表8。
表8肾小管周微血管指数与血清尿素氮、肌酐水平及肾小管间质的病理积分、间质纤维化的病理
积分的相关分析(r值
UUO组UUO+SCF-G组
肌酐纤维化积分间质积分肌酐纤维化积分间质积分
肾小管周
微血管指数-0.384*-0.835*▲-0.537*-0.351*-0.631*▲-0.359*
注:
经相关分析,*P<0.05。
▲Spearman相关系数,未标注的为Pearson相关系数。
2.9UUO组和UUO+SCF-G组大鼠肾皮质VEGFmRNA表达与TSP-1mRNA表达及肾小管周微血管指数的相关分析
在UUO组和UUO+SCF-G组大鼠中,肾皮质VEGFmRNA表达与肾小管周微血管指数均呈正相关(P<0.05;在UUO组和UUO+SCF-G组大鼠中,肾皮质TSP-1mRNA表达与肾小管周微血管指数均呈负相关(P<0.05(见表9。
表9.UUO组和UUO+SCF-G组大鼠肾皮质VEGFmRNA表达、TSP-1mRNA表达与肾小管周微血管
指数的相关分析(r值
UUO组UUO+SCF-G组
VEGFmRNATSP-1mRNAVEGFmRNATSP-1mRNA
肾小管周微血管指数0.677*-0.545*0.439*-0.400*注:
经相关分析,*P<0.05。
3讨论
肾脏微血管不仅是炎症、代谢等损害因素的承受者,也是肾脏损伤的直接参与者,维持肾脏微血管功能与数目是预防肾脏病变持续进展的关键[7,8]。
导致肾间质微血管损伤和丢失的因素包括促血管生成因子如血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF的减少、抑制血管生成因子如血小板反应蛋白-1(thrombospondin-1,TSP-1的增加等,尤其是血管内皮细胞的损伤甚至凋亡在其中起了重要作用。
因此,探讨如何促进内皮细胞修复或再生,减少微血管进行性丢失以达到延缓肾间质纤维化及慢性肾病进展的目的,显然有着积极的意义。
Ⅷ因子相关抗原是血管内皮细胞一个可靠的标记物[9]。
因为Ⅷ因子只在血管内皮细胞中有表达,阳性细胞存在的地方表示有微血管或有微血管形成,且能够清楚的将微血管和其它组织成分分开。
因此,我们也以肾小管周Ⅷ因子免疫组化染色为棕黄色的内皮细胞作为PTC指数的依据[10]。
本结果表明,UUO组及UUO+SCF-G组在术后随时间延长,PTC指数均逐渐下降。
但UUO组术后14天即可见PTC指数较Sham组下降,UUO+SCF-G组在术后21天PTC指数始有下降趋势,28天时UUO+SCF-G组PTC指数低于Sham组,但仍高于同期UUO组PTC指数。
提示SCF联合G-CSF动员骨髓干细胞对UUO模型大鼠的PTC的丢失可能有保护作用,国内外尚未见有类似报道。
进一步观察发现,UUO组与UUO+SCF-G组相比,术后第5天两组肾间质纤维化和间质的病理积分之间均无显著性差异(P>0.05,余时间点UUO+SCF-G组大鼠间质纤维化和间质的病理积分均低于UUO组(P<0.05。
说明SCF联合G-CSF动员骨髓干细胞,可以减轻UUO模型大鼠肾间质纤维化程度和肾间质损伤程度。
相关分析表明,在UUO组和UUO+SCF-G组中,术后5-28天的肾间质纤维化积分与肾小管间质的病理积分均呈正相关,提示间质纤维化积极参与了肾间质的损伤。
同时我们还发现,在UUO组和UUO+SCF-G组中肾小管周微血管指数与肾间质纤维化的病理积分、小管间质的病理积分均呈负相关,进一步证实了肾小管周围毛细血管的损伤可能是影响肾小管间质进行性损伤的重要决定因素[11,12]。
通过改善肾小管间质PTC的形成,可能成为治疗肾小管间质损害的一个新的途径。
UUO组与UUO+SCF-G组大鼠在术后第14天,血清肌酐水平水平与Sham组相比均增高,随后在术后的第21、28天肌酐仍持续高于Sham组。
在本研究中,虽未发现UUO组与UUO+SCF-G组大鼠在不同时间点血清肌酐水平有显著差异,可能与对侧肾脏代偿有关,但两组中肾小管周微血管指数与血清肌酐水平均呈负相关,同时UUO+SCF-G组大鼠间质纤维化和间质损害的程度均低于UUO组,因此我们有理由相信SCF联合G-CSF动员骨髓干细胞有助于减少PTC丢失,并进而减轻肾间质纤维化和间质损害,保护肾功能。
SCF是一种可由骨髓微环境中的基质细胞产生的酸性糖蛋白,其直接对造血干细胞及早期祖细胞的生存、增殖、分化和粘附及骨髓微环境起着关键作用,可协同多种造血生长因子
促进早期祖细胞生成定向祖细胞,使其集落数增加。
而G-CSF是作用于晚期祖细胞的生长因子,能促进静息期干细胞进入细胞周期,致其大量增殖,并通过降低细胞表面黏附分子数量促进骨髓干细胞脱离骨髓进入血液循环[13]。
两者是骨髓干细胞的强力动员剂,联合应用可使外周血中骨髓干细胞的数量显著增加。
已有多项研究证明,骨髓干细胞有向缺血损伤组织归巢的特征[14,15],炎症损伤可能是干细胞归巢的始动因素[16,17]。
目前大多数研究将CD34+细胞视为骨髓干细胞,并以CD34+细胞作为骨髓干细胞动员生物学活性与临床应用的源细胞标志。
由于UUO模型病变特点以肾间质损害为主,为此本实验以免疫组化CD34+细胞在肾脏间质的定位,检测骨髓干细胞归巢至肾间质部位的能力。
结果显示,在术后第5天,与Sham组相比,UUO组肾间质CD34
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