CTL诱导及杀伤实验.docx
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CTL诱导及杀伤实验.docx
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CTL诱导及杀伤实验
一、抗原肽诱导CTL制备
1.PBMCswereseparatedfromthewholebloodofHLA-A2+healthycontrols.PBMCs(2x106/ml)wereculturedwitheachoftheHLAA*0201refoldingpeptidesataconcentrationof10uMinRPMI1640mediumcontaining10%FCSand20U/mlrecombinanthumanIL-2(rhIL-2)in24-wellcultureplate.Halfofthemediumwaschangedatday4withsupplementationofrhIL-2at20U/ml.Atday7,cellswereharvestedandtestedforthepresenceofpeptide-specificCD8+TcellsbyanIFN-γreleaseELISPOTassay.
---------------ZhouM,XuD,LiX,LiH,ShanM,TangJ,WangM,WangFS,ZhuX,
TaoHetal:
Screeningandidentificationofsevereacuterespiratory
syndrome-associatedcoronavirus-specificCTLepitopes.JImmunol2006,
177(4):
2138-2145.
2.PBMCswereseparatedfromheparinizedvenousbloodbyFicoll-HypaquedensitygradientcentrifugationfromHLAA*0201normaldonorsandHCCpatients.DCsweregeneratedfromperipheralbloodmonocytesasdescribedbyRomani.Briefly,PBMCswereseededintosix-wellcultureplatescontaining3mlRPMI-1640and10%FCSat5–10x106/well.Plateswereincubatedina37oCincubatorfor2h,thenthenon-adherentcellswereremovedandtheadherentcellswereculturedat37oCinRPMI-1640supplementedwith10%FCS,1000U/mlhumanrecombinantGM-CSFand500U/mlhumanrecombinantIL-4.AllTcellstimulationwaswithday7DCs.Asdescribedbelow,DCswerematuredwithlipopolysaccharide(LPS)onday6andHCA587antigenwasaddedforeffectiveprocessingatthistime.
Day6DCswereresuspendedinRPMI-1640with1000U/mlGM-CSF,500U/mlIL-4and10ng/mlLPSandincubatedat37oC.After24hcultivationtheDCswerecollected,washedandpulsedwith10mg/mlHCA587peptidefor3hat37oC.TheDCswerewashedtwiceforthefollowingstimulation.
CD8+TcellswereisolatedbypositiveselectionwithCD8-Dynalimmunomagneticbeadsaccordingtothemanufacturer’sinstructions.Afterwashing,CD8+Tcellswereco-culturedwithHCA587peptide-loadedDCsin2mlRPMI-1640mediumsupplementedwith10%ABserum,recombinanthumanIL-2(10ng/ml)andIL-6(500U/ml).Sevendayslater,theculturedTcellswererestimulatedwithfreshlypreparedpeptide-pulsedDCsandculturedforanother7days.Afterfourconsecutiveroundsofstimulation,culturesweretestedforthepresenceofHCA587-specificCTLs.
-----------LiB,WangY,ChenJ,WuH,ChenW:
IdentificationofanewHLA-A*0201-restrictedCD8+Tcellepitopefromhepatocellularcarcinoma-associatedantigenHCA587.ClinExpImmunol2005,140
(2):
310-319.
3.GenerationofCTLsinPBMCsfromhealthydonors:
Dendriticcells(DCs)havetheuniquecapacityofactivatingnaiveTcellsandinitiatingprimaryT-cellresponse.Antigen-specificT-cellresponsesfromperipheralbloodmononuclearcells(PBMCs)canbeelicitedwithantigenicpeptide-pulsedautologousDCs.WeobtainedPBMCsfromthebuffycoatofheparinizedwholebloodsamplesofhealthydonorsbydensitygradientcentrifugationontheHistopaque1077.Thesecellswereresuspendedinserum-freeRPMI1640andallowedtoadheretosixwellplatesatafinalconcentrationof1x107cells/3ml/well.After2hofincubationat37°C,non-adherentcellsweregentlyremovedwithwarmmediumbygentlypipetting.Thenon-adherentcells(effectorlymphocytes)werecryopreservedinFCSsupplementedby10%DMSO.TheresultantadherentcellscontainingDCswereculturedinmediumsupplementedwith800U/mlGMCSFand1,000U/mlIL-4in37°C/5%CO2.Every2days,one-halfofthemediumwasreplacedbyfreshmediumcontainingadoubleconcentrationofGM-CSFandIL-4asindicatedabove.Onday5,10ng/mlofrecombinanthumantumornecrosisfactora(TNF-a)wasaddedtothemediumtoinducephenotypicandfunctionalmaturationofDCs.After48h,DCswerepulsedwith20ug/mlpeptideinthepresenceof3ug/mlb2-microglobulinat37°Cfor3handirradiatedat30Gybeforeuse.Thethawed2x106ofnon-adherenteffectorlymphocyteswerecoculturedwith2x105peptidepulsedirradiatedautologousDCsina24-wellplateinthepresenceof10ng/mlrecombinanthumaninterleukin-7(IL-7).After7days,lymphocyteswererestimulatedwithpeptide-pulsedautologousPBMCsinmediumcontaining10ng/mlIL-7and20U/mlIL-2.About20U/mlofIL-2wasadded24hlateratregularintervals,2daysaftereachrestimulation.Lymphocyteswererestimulatedeachweekinthesamemanner.Ontheseventhday,afterthethreeroundsofrestimulation,cellswereharvestedandtestedbyELISPOTassay.
--------------AnalteredpeptideligandfornavecytotoxicTlymphocyteepitopeofTRP-2(180–188)enhancedimmunogenicity.
CancerImmunolImmunother(2007)56:
319–329第三军医大吴玉章
4.GenerationofCTLsinhealthydonors
DendriticcellsarecharacterizedbytheuniquecapacitytoactivatenaiveTcellsandinitiateprimaryT-cellresponse.Antigen-specificT-cellresponsesfromperipheralbloodmononuclearcells(PBMCs)canbeelicitedwithantigenicpeptide-orprotein-pulsedautologousDCs.Here,PBMCswereisolatedfromwholebloodof11healthyHLA-A2.1_volunteerdonorsbyFicoll/Hypaquedensitygradientcentrifugation.Humanperipheralbloodmonocyte-derivedDCsweregeneratedaspreviouslydescribedbyus.Onday5ofculture,10ng/mLrecombinanthumantumornecrosisfactorwasaddedtothemediumtoinducephenotypicandfunctionalmaturation.Then,48hourslater,DCswerepulsedwith20ug/mLpeptideinthepresenceof3ug/mLB2-microglobulinat37°Cfor3hoursandirradiatedat30Gybeforeuse.Peripheralbloodlymphocytes(PBLs,2x106)werecoculturedwith2x105peptide-pulsedirradiatedautologousDCsina24-wellplateinthepresenceof10ng/mLrecombinanthumaninterleukin-7.Thenextday,recombinanthumanIL-10wasaddedtotheculturemedium,togiveafinalconcentrationof10ng/mL.After7days,lymphocyteswererestimulatedwithpeptide-pulsedirradiatedautologousDCsinmediumcontaining10ng/mLIL-7and10ng/mLIL-10,andthensupplementedwith20IU/mLIL-224hourslater.Lymphocyteswererestimulatedeachweekinthesamemanner.At7daysafterthefourthroundofrestimulation,cellswereharvestedandtestedbyELISPOTassay,cytotoxicityassay,andtetramerstaining.CD8TlymphocyteswerepurifiedbyCD4_cell–negativedepletionusinghumanCD4microbeads.
---------WangB,ChenH,JiangX,ZhangM,WanT,LiN,ZhouX,WuY,YangF,YuYetal:
IdentificationofanHLA-A*0201-restrictedCD8+T-cellepitopeSSp-1ofSARS-CoVspikeprotein.Blood2004,104
(1):
200-206.第二军医大曹雪涛
5.抗原肽诱导CTL制备:
密度梯度离心法分离经EDAT抗凝的静脉血中的外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells,PBMC),分离得到的PBMC种于6孔细胞培养板,在含10%FCS的RPMI1640培养基中,37℃5%CO2孵育1.5h。
收集悬浮细胞(主要为淋巴细胞),以10%二甲亚矾90%小牛血清保存于液氮备用。
贴壁细胞为抗原提呈细胞-树突状细胞(DC)前体细胞,补充含GM-CSF(l000U/ml,R&D)、IL-4(l000U/ml,R&D)及含10%FCS的RPMI1640培养液,37,C5%COZ培养7d,需要时补充新鲜培养液。
5d后,加入LPS(lug/ml,Sigma)培养2d后形成成熟DC,r照射使其失去增殖活性。
将经过照射的DC与抗原肽(10umol/l)在培养液中,37℃5%CO2共孵过夜。
将l*105负载有抗原肽的DC与1x106自体PBMC种于含10%FCS的RPMI1640完全培养液的24孔细胞培养板,37℃5%coZ混合培养3d后,加入rIL-2(20U/ml,Sigma)继续培养10d,进行细胞增殖实验和细胞活性检测。
---------------结核杆菌抗原CD8+T细胞多表位“串珠式”肽疫苗研究第二军医大学长征医院实验诊断科仲人前
6.
(一)人外周血单核细胞来源的DCs的培养
1).外周血单核细胞的分离
HAL-A2.1+小PEBP+4乳腺癌病人抗凝外周全血来自长海医院和长征医院外科。
通过淋巴细胞分离液(Ficoll-Histopaque1.077)密度梯度离心(室温,400×g,30分钟),取界面细胞,置入50ml离心管中,用无钙镁PBS(pH7.2)-EDAT(2mM)
悬浮细胞,之后离心(300×g,10分钟)洗细胞一次,弃上清,无钙镁PBS重悬细胞,再此离心(200×g,5分钟)洗细胞2次,以便洗尽血小板。
之后所获得的细胞即为外周血单个核细胞(PBMC)。
2).人外周血单核细胞来源的DCs的培养
参照文献[60]的方法,人外周血单个核细胞用完全培养基(含10%胎牛血清的RPMI1640)悬浮PBMC,按1×107细胞/孔铺于6孔板,37℃、5%CO2孵育2小时后,轻晃板子,吸出悬浮细胞,用预温的培养基小心洗6孔板三遍(此部分细胞连同吸出的悬浮细胞冻存备用),剩下的细胞即为获得的贴壁的单核细胞,贴壁细胞在含人重组rhGM-CSF(500U/ml)和人重组rhIL-4(10ng/ml)的完全培养基中37℃、5%CO2进行培养。
第三天,补充完全培养基,继续培养。
3).相应候选表位肽体外致敏乳腺癌患者(hPEBP4+,HLA.A*0201+)外周血单核细胞来源的DCs
收集上述培养至第六天的hPEBP4+/HLA-A*0201+乳腺癌患者外周血单核细胞
来源的DCs,用人DCs完全培养基(RPMI1640完全培养基,500U/m1rhGM-CSF、
10ng/mlrhIL-4)调整细胞浓度为2x105细胞/ml浓度,lml/孔分入24孔板,按照实验分组加入20uMP40-48,4小时后收集细胞,弃培养基上清,用RPMI1640培养基离心洗涤细胞两次以除去原培养基中存在的刺激物,最后将2x105细胞悬浮在0.5ml人DCs完全培养基中,随即用于刺激同体的T淋巴细胞。
4).乳腺癌病人外周血淋巴细胞抗原特异性CTL的体外诱导[61.68]
复苏本部分2中所收集冻存的非贴壁细胞(富含淋巴细胞),悬浮于10%胎牛血清的RPMl6l40培养基中,调整细胞浓度为4x106细胞/m1,分别取0.5ml加
入至上述收集的各组经肽致敏的自体DCs中,于37℃、5%二氧化碳条件下共培养(淋巴细胞:
DCs=10:
1),此为第一轮的刺激。
之后于共培养的第五天加入20U/ml
rhIL-2,培养7天后收集上述淋巴细胞,同样以10:
1的比例再与新鲜制备的2xl05/ml肽致敏的同体DCs用10%胎牛血清RPMIl640培养液共培养进行第二轮的刺激。
同样的刺激每周一次共刺激三次。
培养过程中每隔3天加入一次20U/mlrhIL-2,2-3天半量更换新鲜培养基,并依据需要进行细胞的分孔扩增,末次刺激后的7天收集细胞,使用免疫磁珠阳性选择分选CD8+T细胞,方法严格依照厂商提供的说明书进行。
分选出的CD8+T细胞进行51Cr释放法和INF-rELISPOT检测。
-----------NY-BR-1在中国乳腺癌患者中的表达及其HLA-A2限制性CTL表位免疫鉴定第三军医大吴玉章
7.DC刺激的T细胞对K562细胞的杀伤作用
按上述方法培养DC(在培养第4天的DC中加入100μlK562细胞冻融抗原)。
用RPMI1640培养液调整DC、同种异体T淋巴细胞浓度分别为1×105/ml、1×106/ml。
各取DC和T淋巴细胞100μl,加入96孔培养板共培养,对照组以100μlRPMI1640培养液代替DC,37℃、5%CO2培养72小时后,加入K562细胞作为靶细胞,效∶靶=10∶1,设3个复孔。
37℃、5%CO2孵育48小时后弃悬液,每孔加入20μlMTT溶液(5mg/ml),37℃、5%CO2孵育4小时,终止培养,40×g离心5分钟,弃上清,每孔加入二甲亚砜溶液150μl,振荡10分钟,在酶标仪上测定各组在570nm处A值(结果用3孔均值表示),并计算其杀伤率(%)。
公式为:
细胞杀伤率(%)=[(效应细胞孔的A值+单纯靶细胞孔的A值-细胞毒实验孔的A值)/
单纯靶细胞孔的A值]×100%
二、Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞
1).原理
外周血单个核细胞(Peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)即外周血中具有单个核的细胞,包括淋巴细胞和单核细胞。
体外检测淋巴细胞首先要分离外周血单个核细胞,目前主要的分离方法是Ficoll-hypaque(葡聚糖-泛影葡胺)密度梯度离心法,因为血液中各有形成分的比重存在差异,因此得以分离。
红细胞和粒细胞密度大于分层液,同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。
血小板则因密度小而悬浮于血浆中,唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中,呈白膜状,吸取该层细胞递经洗涤高心重悬。
本法分离单个核细胞纯度可达95%,淋巴细胞约占90%~95%,细胞获得率可达80%以上,其高低与室温有关,超过25℃时会影响细胞获得率。
2).方法
1. 在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。
2. 取肝素抗凝静脉血与等量Hank's液或RPMI1640充分混匀,用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上,注意保持清楚的界面。
水平离心2000rpm×20分钟。
3. 离心后管内分为三层,上层为血浆和Hank's液,下层主要为红细胞和粒细胞。
中层为淋巴细胞分离液,在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带(白膜层),单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。
此外,还含有血小板。
4. 用毛细血管插到云雾层,吸取单个核细胞。
置入另一短中管中,加入5倍以上体积的Hank's液或RPMI1640,1500rpm×10分钟,洗涤细胞两次。
5. 末次离心后,弃上清,加入含有10%小牛血清的RPMI1640,重悬细胞。
取一滴细胞悬液与一滴0.2%台盼兰染液混合,于血球计数板上,计数四个大方格内的细胞总数。
6. 细胞活力检测:
死的细胞可被染成兰色,活细胞不着色。
计数200个淋巴细胞。
计算出活细胞百分率。
3)人淋巴细胞分离液的使用方法:
使用方法
例:
取抗凝血1ml,与Hank’s液1:
1混匀后,小心加于2ml的细胞分离液之液面上,以2000转/分离心(半径15cm水平转子)15分钟,收集
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- CTL 诱导 杀伤 实验