动物细胞基因组DNA中小卫星多态性的Southernblot检测.docx
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动物细胞基因组DNA中小卫星多态性的Southernblot检测
动物细胞基因组DNA中小卫星多态性的Southernblot检测
实验目的:
掌握核酸杂交检测技术(Southernblotting技术)、核酸探针的标记技术、小卫星DNA多态性检测分析技术(DNA指纹图谱技术)和化学发光检测技术。
实验原理:
Southern印迹杂交技术包括两个主要过程:
一是将待检测的核酸分子通过一定的方法转移(电转印、虹吸转印、真空转印)并结合到一定的固相支持物(硝酸纤维素、尼龙膜)上,即印迹(blotting);二是固定于膜上的核酸与特定标记[放射性同位素、地高辛(DIG)、生物素(biotin)等]的核酸探针在一定温度和离子强度下复性(退火),即分子杂交。
该技术是1975年英国爱丁堡大学Southern发明的,固命名Southern印迹杂交技术。
利用Southern印迹杂交技术可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组中某一基因的定性和定量分析、基因突变分析及限制性长度片段多态性分析(RFLP)。
固相膜核酸分子杂交的主要步骤及原理如下:
1、DNA的变性:
DNA变性解链是杂交成功的关键。
Southern印迹杂交时DNA在凝胶中变性,变性方法是将凝胶浸在数倍体积的1.5MNaCl和0.5MNaOH中1h然后用数倍体积的1MTris-HCl(pH8.0)和1.5MNaCl溶液中和1h。
DNA受酸、碱、热等处理均能发生变性,但强酸会使核酸降解。
一般认为碱变性较好,可避免DNA降解。
热变性在要低DNA浓度(100μg/ml)和低盐浓度(0.1MSSC含15mMNaCl-1.5mM柠檬酸三钠,pH7.0)下进行。
用SSC稀释DNA溶液为50μg/ml,加10MNaOH使最终浓度为0.1M(pH约12.8),室温变性10min,很快置冰盐水中,用10MHCl或5MNaH2PO4调pH到7~8(亦可用碱变性后,调至中性,再加热100℃10min),DNA变怀可用OD260增加(约30~40%)来检测,变性DNA沉淀呈雪样,完全失去纤维状沉淀。
变性后加入等量冷的12×SSC,冰浴保存。
2、变性DNA在硝酸纤维素膜上的固定:
硝酸纤维素滤膜(孔径0.45μm)先在蒸馏水中充分浸泡,再用6×SSC浸泡30min~2h,凉干。
DNA样品转移或加至硝酸纤维素膜上后,先室温干燥4h,然后在80℃真空干燥2h。
DNA样品也可以转移或加至尼龙膜(nylonmembrane)上,再用高温烘烤或紫外交联的处理固定在尼龙膜上。
3、预杂交:
湿润的滤膜放入可加热封口的塑料袋或杂交管中,按每平方厘米滤膜加0.2ml预热至60℃的预杂交液(6×SSC,0.5%SDS,5×Denhardt液,100μg/ml鲑鱼精DNA)。
鲑鱼精DNA需经过剪切和DNA酶消化处理,然后酒精沉淀纯化,调浓度至10mg/ml,用前放100℃水浴中煮沸变性10min,冰水骤冷。
若在塑料袋中杂交,尽可能将袋中气泡赶尽,可封口器将袋口封住。
将杂交袋浸入68℃水浴保温3~12h。
当预杂交液温度升至68℃时,在滤膜表面常会形成小气泡。
轻轻晃动袋中液体即可除去这些小气泡,这一点对于保证滤膜表面充分浸润预杂交液很重要。
若在杂交管中杂交,只需将杂交管置入核酸杂交炉(箱)内的旋转支架,调解到到一定转速和杂交温度,完成杂交。
4、杂交:
从水浴中取出塑料袋,用剪刀剪开一角,尽可能挤净预杂交液。
用吸管或大枪头将杂交液加入袋中,用恰好是足量的液体保持滤膜湿润(50μl/cm2)。
溶液的组成是6×SSC,0.01MEDTA,变性的标记核酸探针,5×Denhardt液,0.5%SDS,100μg/ml变性的鲑鱼精DNA。
尽可能赶尽气泡后,将塑料袋严密封口,杂交反应在68℃水浴中进行,所需时间视探针和检测靶DNA的性质及探针的比活性等情况而定,一般4~20h。
若在杂交管中杂交,只需倾去预杂交液,杂交管内加入含杂交探针的杂交液,继续在核酸杂交炉完成杂交。
5、洗膜:
取出塑料袋,用剪刀剪开,小心取出滤膜,立即浸入盛有2×SSC和0.5%SDS溶液的盘中,室温下漂洗5min。
再将滤膜移入2×SSC和0.1%SDS溶液中,室温下洗涤15min(轻轻摇动)。
然后将滤膜移入0.1×SSC和0.5%SDS溶液中;68℃轻轻摇动保温2h,更换缓冲液后继续保温30min。
洗膜的温度一般应控制在低于Tm值12℃以上。
若在杂交管中洗膜,只需倾去杂交液,杂交管内加入相同洗膜液,继续在核酸杂交炉旋转洗膜。
6、结果显示:
固相膜的放射性杂交结果显示有两种方式,一是放射性自显影法,另一种是液闪计数法。
前一种方法比较简单,只需将杂交膜与X光片在暗盒中曝光数小时至数天,再显影、定影即可。
对于杂交信号较弱的固相膜,用一块增感屏可显著增强曝光强度。
固相膜的非放射性杂交检测一般采用化学发光技术。
常用的化学发光技术系统有两种,一种是碱性磷酸酶(AP)系统,包括:
①:
ProbeDNA-DIG→Anti-DIG-Ab-AP→ChemiluminescentSubstrat(CSPD);②:
ProbeDNA-biotin→Streptavidin-HRP→ECL。
图25-1Southern凝胶转移杂交技术
图25-2Southernblot技术逐步图解
实验材料:
[1].实验24制备的基因组DNA。
实际应用中可采集人静脉血,EDTA抗凝,提取DNA。
[2].限制性内切酶HaeIII:
FermentasLifeSciences
[3].限制性内切酶HinfI:
FermentasLifeSciences
[4].Biotin标记的33.6和33.15两种人源小卫星探针。
33.6小卫星探针:
5′-Biotin-AGGGCTGGAGGAGGGCTGGAGGAGGGCTGGAGG-3′
33.15小卫星探针:
5′-Biotin-AGAGGTGGGCAGGTGGAGAGGTGGGCAGGTGGAGAGGTGGGCAGGTGG-3′
[5].5×TBE缓冲液:
0.45MTris-硼酸(borate),0.01MEDTA。
[6].6×载样缓冲液:
0.25%溴芬蓝,0.25%二甲苯青FF,30%甘油
[7].脱嘌呤液:
0.25MHCl。
[8].变性液:
0.5MNaOH,1.5MNaCl。
[9].尼龙膜(N+-nylonmembrane):
带正电荷的尼龙膜。
Roche
[10].20×SSC:
3MNaCl,0.3M柠檬酸钠(sodiumcitrate),NaOH调pH为7.0,高压灭菌,室温保存。
[11].10%SDS:
900ml水溶解100g电泳级SDS。
加热到68°C并用磁力搅拌器搅拌助溶。
若需要,加几滴浓HCl调解pH为7.2,用水定容到1000ml。
室温保存,无须灭菌。
[12].Denhardt's溶液:
0.02%聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone,PVP),0.02%聚糖体400(Ficoll400),0.02%牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)。
Denhardt’s溶液可配制成50×储存液,过滤后保存在-20°C。
使用时将储存液10倍稀释在杂交缓冲液中。
Denhardt's溶液用水配制。
50×储存液:
1%聚乙烯吡咯烷酮(PVP),1%聚糖体400(Ficoll400),1%牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)。
[13].预杂交及杂交液:
6×SSC,0.5%SDS,5×Denhardt's溶液,100μg/ml变性剪切的鲑鱼精DNA(denatured,shearedsalmonspermDNA)或酵母tRNA。
[14].探针剥离液:
0.2MNaOH,0.1%SDS。
塑料瓶室温保存。
[15].马莱酸(MaleicAcid)缓冲液:
0.1M马莱酸,0.15MNaCl;固体NaOH调pH至7.5,高压灭菌,室温保存。
[16].室温洗膜液:
2×SSC,0.1%SDS。
[17].60°C严谨洗膜液:
0.5×SSC,0.1%SDS。
[18].洗膜缓冲液:
马莱酸缓冲液加0.3%(v/v)Tween-20。
[19].封闭缓冲液:
含5%BSA的马莱酸缓冲液,现配现用。
[20].辣根过氧化物酶(HPR)标记的链亲和素(streptavidin)(HRP-Streptavidin):
北京博大泰克生物基因技术有限责任公司(北京,中国)。
[21].HRP-Streptavidin反应液:
HRP-Streptavidin1:
5000稀释在洗膜缓冲液中,现配现用。
[22].HPR化学发光底物ECL(SuperSignalWestPicoChemiluminescentSubstrate):
PierceBiotechnology(Rockford,IL)公司。
[23].杂交炉:
Model2000MicroHybridizationIncubator(RobbinsScientific)。
[24].电转印仪:
MultiphorIIElectrophoresisSystemNovaBlotKit(AmershamBiosciences);
[25].X-射线摄影暗匣:
规格203mm×254mm(汕头市粤华医疗器械厂)。
[26].X-光片:
上海申贝办公机械有限公司感光材料厂。
[27].显影液:
皇冠牌X光胶片显影粉(无锡市服务用品厂)配制。
[28].定影液:
皇冠牌X光胶片酸性坚膜定影粉(无锡市服务用品厂)配制。
实验步骤:
[1].用HaeⅢ或HinfI彻底消化10μg基因组DNA。
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[2].加入9μl的6×载样缓冲液,混匀。
[3].上样于0.8%的琼脂糖凝胶中(电泳缓冲液为0.5×TBE,胶长20cm),在20V(约1V/cm)下电泳至2kb以下片段完全出胶时停止(二甲苯青FF带离凝胶阳极端边沿4cm)。
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[4].将凝胶在脱嘌呤液中浸泡20min;室温轻轻晃动,直到溴酚蓝从蓝变黄。
[5].蒸馏水洗涤凝胶1次。
[6].将凝胶在变性液中浸泡30min
[7].将凝胶在0.5×变性液中浸泡20min。
[8].将凝胶用进行Southern转印(Southernblot):
A.虹吸转印(毛细转印):
a.将凝胶小心平推到一块玻璃板上(加样孔超上);
b.裁剪6张与凝胶同样尺寸的滤纸,用0.5×变性液浸湿后平铺在凝胶上,用玻璃棒赶去气泡;滤纸上覆盖一块玻璃板;
c.捏住两块玻璃板,翻转后放到实验台面上,再小心揭掉上面的玻璃板。
d.裁剪一张与胶同样大小的带正电荷的尼龙膜,用0.5×变性液浸湿后小心平铺在胶表面,用玻璃棒除去凝胶和膜之间的气泡;
e.裁剪6张同样尺寸的滤纸,用0.5×变性液浸湿后平铺在尼龙膜上,用玻璃棒赶去气泡;滤纸上平整覆盖5~10cm厚的吸水纸。
f.吸水纸顶上加一玻璃板。
g.将“吸水纸-滤纸-尼龙膜-凝胶-滤纸”整个转印装置用保鲜膜密封。
h.在玻璃板上放一重物(400g)。
室温下转印过夜。
B.电转印:
a.将胶小心平放在干净投影胶片上;
b.裁剪一张与胶同样大小的带正电荷的尼龙膜,用0.5×TBE浸湿后小心平铺在胶表面,用玻璃棒除去凝胶和膜之间的气泡;
c.裁剪6张同样尺寸的滤纸,用0.5×TBE浸湿后平铺在尼龙膜上,用玻璃棒赶去气泡;
d.在胶的另一面同样铺上6层0.5×TBE预先浸湿的滤纸,排除气泡;
e.将“滤纸-尼龙膜-凝胶-滤纸”转印装置移入电转印仪中,使尼龙膜面向阳极,凝胶面向阴极(即“阳极←滤纸←尼龙膜←凝胶←滤纸←阴极”),接通电源,室温下,100mA转印60min。
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图25-3毛细管虹吸法Southern转移装置
图25-4电转引装置
9].转印完成后,取出尼龙膜,在2×SSC中浸泡20min。
[10].尼龙膜DNA面朝上置于滤纸上,再覆盖一张滤纸,60ºC烤膜30min。
[11].将尼龙膜DNA面朝上装入杂交管中。
[12].尼龙膜按0.1~0.2ml/cm2预杂交液体积60℃预杂交4h。
[13].33.6或33.15小卫星探针98℃变性10min,立即放入冰浴中5min。
[14].将探针按预实验确定的信噪比最价浓度加入60℃杂交液中,杂交液按0.05ml/cm2体积60℃杂交过夜。
文献:
寡核苷酸探针33.6杂交浓度:
5nM[NucleicAcidsResearch1988,16(13):
6253]
[15].尼龙膜用室温2×SSC、0.1%(w/v)SDS漂洗2×10min
[16].尼龙膜用600.5℃×SSC、0.1%(w/v)SDS漂洗2×20min。
[17].对尼龙膜进行化学发光法检测:
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注意事项:
[1]膜杂交中32P标记探针与非放射性标记探针的用量分别为5~10ng/ml和25~1000ng/ml。
示例图片:
图25-5高度变异的人DNA指纹图谱文档来自于网络搜索
人DNA用HinfI和/或Sau3A消化,用含有人小卫星的32P-标记的单链DNA探针进行Southernblot杂交,其中人小卫星是由一个共同序列的密切相关的变异体串联重复构成。
(From:
EdSouthern.Southernblotting.NatureProtocols2006,1:
518-525)文档来自于网络搜索
图25-6DNAfingerprintsofunrelatedhumaninpidualsproducedby[33P]Chipolymericmonocoreprobe:
GCTGGTGGGCTGGTGGGCTGGTGG(lanes13–24)and33.6polymericmonocoreprobe:
AGCGCTGGAGGAGGGCTGGAGGAGGGCTGGAGGGCTGGAGG(lanes9–16).[From:
S.A.Limborska,M.I.Prosnyak,T.N.Bocharova,E.M.Smirnova,A.P.Ryskov.ThepropertiesofhumanDNAfingerprintsproducedbyPMCprobes.GeneticAnalysis:
BiomolecularEngineering1999,15:
19-24]
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