第十一章紫外可见分光光度法第十一章紫外.docx
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第十一章紫外可见分光光度法第十一章紫外
第十一章 紫外-可见分光光度法
课时目标
【知识教学目标】
1.掌握紫外-可见分光光度法的基本原理,朗伯-比尔定律的应用及其适用范围;紫外光谱定量分析的原理和方法;紫外-可见分光光度法定性分析的原理和方法。
2.熟悉紫外吸收光谱的定义及常用术语;紫外-可见分光光度法的构造及原理。
3.了解电磁辐射及其与物质的相互作用。
【能力培养目标】
1.知道朗伯-比尔定量的运用范围及正确进行相关的计算。
2.会绘制吸收曲线;对物质进行定量和定性分析。
重点
紫外-可见分光光度法的基本原理、朗伯-比尔定律
难点
紫外-可见分光光度法的基本原理、朗伯-比尔定律
教学方法
讲授、讨论
课时数
3
使用教具
多媒体课件
参考资料
《基础化学》,陆家政,人民卫生出版社
《分析化学》,潘国石,人民卫生出版社
《分析化学》(第四版)武汉大学,高等教育出版社
教学体会
本章节内容和实际生活联系比较紧密,在实际教学中可以联系我们看到的颜色等进行讲解,这样比较生动易引起学生的兴趣。
第十一章 紫外-可见分光光度法
第一节概述
1.电磁辐射和电磁波谱
在仪器分析中,根据物质发射的电磁辐射或物质与辐射的相互作用所建立起来分析方法,统称为光学分析法。
根据物质与辐射能间作用的性质不同,光学分析法又分为光谱法和非光谱法。
当物质与辐射能相互作用时,物质内部发生能级跃迁,根据能级跃迁所产生的辐射能强度随波长变化所得的图谱称为光谱(spectrum)。
利用物质的光谱进行定性、定量和结构分析的方法称为光谱分析法(spectroscopicanalysis),简称光谱法。
光谱分析法从不同的角度分为不同的类别。
如按作用物是分子或原子,可分为分子光谱法和原子谱法;物质与辐射能间的转换方向(能级跃迁方向),可分为吸收光谱法和发射光谱法;按辐射源的波长不同,可分为红外光谱法、可见光谱法、紫外光谱法、X-射线光谱法等。
非光谱分析法是物质受辐射线照射时,改变电磁波的传播方向、速度等物理性质所建立起来的分析方法。
这种方法不涉及能量转移和物质内部的能级跃迁,如折光分析法、旋光分析法、X-射线衍射法等。
2.物质对光的选择性吸收
当辐射能通过某些吸光物质时,物质的原子或分子吸收与其能级跃迁相应的能量由低能态跃迁至较高的能态,这种由物质对辐射能的选择性吸收而得到的原子或分子光谱称为吸收光谱。
几种常用的吸收光谱是:
原子吸收光谱、分子吸收光谱、核磁共振光谱等。
各种色光的波长范围
色光名称
波长(nm)
色光名称
波长(nm)
红色
橙色
黄色
绿色
760~650
650~610
610~560
560~500
青色
蓝色
紫色
500~480
480~450
450~400
在可见光中,紫色光的波长最短能量最大,红色光的波长最长能量最小。
除此之外,波长小于400nm的光称为紫外光,波长大于760nm的光称为红外光。
如果适当选配两种颜色的光按一定的强度比例混合,也可以获得白光,则这两种色光称为互补色光。
如图11-1所示,处于直线相连的两种色光互为补色光,如绿色光与紫色光互补,蓝色光与黄色光互补等等。
第二节基本原理
1.吸收光谱
光照射某物质,物质能够吸收光,使原有的基态转为激发态,只有当分子的能量(hν)与被照射物质粒子的基态和激发态能量之差(∆E)相等时才能被吸收。
M(基态)+hν→−M*(激发态)
吸收光谱又称吸收光谱曲线或吸收曲线。
它是在浓度一定的条件下,以波长或波数为横坐标,以吸光度或吸光系数为纵坐标绘制的曲线,如图11-3所示。
在吸收曲线上有一些特征吸收。
曲线上吸收最大且比左右相邻都高之处称为吸收峰,对应的波长称为最大吸收波长(λmax);峰与峰之间且比左右相邻都低之处称为谷,其对应的波长称为最小吸收波长(λmix);在吸收峰旁形状像肩的小曲折处叫肩峰,其对应的波长以λsh表示;吸收曲线上波长短的一端呈现强吸收,吸光度相当大但不成峰形的部分,称为末端吸收(endabsorption)。
2.朗伯-比尔定律
朗伯定律朗伯定律可表述为:
当一束平行的单色光通过浓度C一定的含有吸光物质的溶液时,在入射光的波长、强度以及溶液的温度等条件保持不变的情况下,该溶液的吸光度A与溶液液层的厚度L成正比。
即:
(11·9)
比尔定律比尔定律可表述为:
当一束平行的单色光通过液层厚度L一定的含有吸光物质的溶液时,在入射光的波长、强度以及溶液的温度等保持不变的条件下,该溶液的吸光度A与溶液的浓度C成正比。
即:
A∝C(11·10)
光的吸收定律综合上述两个数学公式可以得到:
(11·11)
这就是著名的郎伯-比尔定律即光的吸收定律的数学表达式。
(11·11)式中K为比例常数,称为吸光系数(absorptivity)。
3.偏离朗伯-比尔定律的主要因素
定量分析时,根据光的吸收定律,如果吸收池的厚度保持不变,以吸光度对浓度作图时,应得到一条通过原点的直线。
但在实际工作中,吸光度与浓度间的线性关系往往会产生偏离而带来误差。
偏离郎伯比尔定律的因素很多,主要有化学因素、光学因素和仪器因素三个方面。
(一)化学因素
1.吸光物质的浓度朗伯—比耳定律只适用于稀溶液,在较高浓度(通常大于0.01mol/L)时,一是由于溶液中的吸光粒子距离减小,以致每个粒子都可影响其邻近粒子的电荷分布。
这种相互作用使每个粒子独立吸收给定波长光子的能力发生改变,从而可使吸光度和浓度间的线性关系发生偏离。
二是由于浓度较大时,因溶液对光折射率的显著改变而使观测到的吸光度发生较显著的变化,导致偏离光的吸收定律。
2.吸光物质不稳定在测定过程中,溶液中的吸光物质发生离解、缔合、形成新化合物或互变异构等化学变化,可使被测组分的浓度发生变化,导致偏离郎伯-比尔定律。
(二)光学因素
1.非单色光的影响严格地说,光的吸收定律只适用于单色光,但实际上,不能得到纯粹的单色光。
一般的单色光器所提供的入射光并不是纯的单色光,而是波长范围较窄的复合光。
由于同一物质对不同波长光的吸收程度不同,所以导致对光的吸收定律的偏离。
2.反射入射光通过折射率不同的两种介质的界面时,有一部分被反射而损失。
两种介质的折射率相差越大,反射光越多,损失的光能越多。
一般情况下,可用参比溶液对比来补偿。
3.散射入射光通过溶液时,溶液中的质点对其有散射作用,造成光能的部分损失而使透过光减弱。
4.非平行光在实际测定中,通过吸收池的光,并非真正的平行光,而是稍有倾斜的光束,倾斜光通过吸收池的实际光程比垂直照射的平行光的光程长,从而影响吸光度A的测量值。
(三)仪器因素
仪器光源不稳定,吸收池厚度不匀,光电管灵敏度差,实验条件的偶然变动等都会偏离光的吸收定律而产生误差。
此外,分析者的主观因素等均可导致偏离光的吸收定律而产生误差。
第三节紫外-可见分光光度计
1.主要组成部件
紫外-可见分光光度计,是在紫外-可见光区可任意选择不同波长的光测定待测物质吸光度(或透光率)的仪器。
商品仪器类型很多,质量差别悬殊,但基本原理相似。
一般构造由五大部件组成:
光源
→
单色光器
→
吸收池
→
检测器
→
显示器及信息处理装置
(一)光源
光源的主要作用是发射强度足够均匀的稳定的连续光谱。
要使光源定,其前端一定要有稳压电源。
紫外-可见光区常用的光源有以下两类。
1.钨灯或卤钨灯
2.氢灯或氘灯
(二)单色光器
单色光器的主要作用是将来自光源的复合光,色散成为单色光,是分光光度计的关键部件。
其主要组成由进光狭缝、出光狭缝、色散元件和准直镜等部分。
色散元件色散元件是单色光器中的关键部件。
常用的色散元件有棱镜和光栅,早期的仪器大多用棱镜,近年来大多用光栅。
准直镜准直镜是以狭缝为焦点的聚光镜。
其作用是将进入单色光器的发散光变成平行光,投向色散元件,然后将色散后的平行单色光聚焦于出光狭缝。
狭缝狭缝为光的进出口,包括进光狭缝和出光狭缝
(三)吸收池
吸收池又称比色皿或比色杯,是用来盛放样品溶液的器皿。
(四)检测器
检测器的作用是将检测到的光信号转换成电信号。
(五)信号处理装置与显示器
2.分光光度计的类型
(一)单波长单光束分光光度计
(二)单波长双光束分光光度计
(三)双波长分光光度计
3.测量条件的选择
(一)吸收度范围的选择
在分光光度法中,仪器误差主要是透光率测量误差。
通过计算可证明,透光率太大或太小,测得浓度的相对误差均较大;一般精度的分光光度计只有当透光率T在20%~65%(吸光度A在0.7~0.2)范围内时,测定结果的相对误差较小(小于2%),是测量的最适宜区域。
误差最小的一点是T=36.8%,A=0.434。
所以一般吸光度值读数控制在0.2~0.7(用紫外分光光度法测定药物含量时,2005年版《中国药典》提出吸光度值控制在0.3~0.7时误差较小),但对高精度分光光度计,误差较小的读数范围可延伸到高吸收区。
可采用下列两种方法控制读数范围:
①计算并控制试样的称出量,含量高时,少取样或稀释试样;含量低时,多取样或萃取富集。
②如果溶液已显色,则可通过改变比色皿的厚度来调节吸光度值的大小。
(二)入射光波长的选择
由于有色物质对光有选择性吸收,为了使获得的测定结果有较高的灵敏度和准确度,通常是根据待测组分的吸收光谱,选择最强吸收带的最大吸收波长(λmax)为入射光波长。
当最强吸收峰的峰形比较尖锐时或有时为了消除干扰,则可选用吸收稍低、峰形稍平坦的次强峰或肩峰进行测定。
如维生素B2的测定,其吸收光谱有267nm、375nm和444nm三个吸收峰,其中267nm处最大,其次是444nm,但267nm处峰较窄,而444nm处峰较宽,易测准,所以可选444nm为测定波长,灵敏度虽低些但能确保测定的准确度。
第四节定性和定量分析方法
1.定性分析
利用紫外-可见吸收光谱对化合物进行定性鉴别,一般采用对比法。
就是将样品化合物的吸收光谱特征与标准化合物的吸收光谱特征进行严格的对照比较;当没有标准化合物时,也可以利用文献所载的化合物标准图谱进行核对。
如果吸收光谱完全相同,则两者可能是同一种化合物。
但这只是初步判断,还需用其他光谱法进一步证实。
因为结构完全相同的物质吸收光谱应完全相同,但吸收光谱完全相同的物质却并不一定是同一物质。
官能团相同的不同的有机物可能有很相似甚至雷同的吸收光谱。
如果两者的紫外-可见吸收光谱有明显差别,则肯定不是同一种化合物。
2.纯度检查
杂质检查若某化合物在紫外-可见光区没有明显吸收,而所含的杂质有较强吸收,那么含有少量杂质就可从光谱中检查出来。
如乙醇或环己烷中可含少量杂质苯,苯在256nm处有吸收峰,而乙醇和环己烷在此波长处无吸收,乙醇中苯含量低达10ppm也能从光谱中检出。
若化合物在某一波长处有较强的吸收峰,而所含杂质在此波长处无吸收或吸收很弱,则测得样品的吸光系数将降低;若杂质在此波长处比该化合物有更强的吸收,则测得的吸光系数将增大。
有吸收的杂质也将使化合物的吸收光谱变形。
这些都可作为检查杂质是否存在的依据。
杂质限量检查药物中的杂质常需制定一个允许其存在的限度:
1)以某个波长的吸光度值表示:
如肾上腺素在合成过程中有一中间体肾上腺酮。
由于肾上腺酮在0.05mol/LHCl溶液中在310nm处有吸收峰,而肾上腺素在此处几乎没有吸收。
2005年版药典规定:
取本品加盐酸溶液(9→2000)制成每1ml中含2.0mg的溶液,在310nm处测定,A不得超过0.05,以肾上腺酮在此波长处的
值(435)计算,这相当于含肾上腺酮不超过0.06%。
2)以峰谷吸光度的比值表示:
如解毒药碘解磷定,其在0.1mol/L HCl溶液的最大吸收波长为294nm,最小吸收波长为262nm。
所含杂质为顺式异构体及中间体,在294nm处几乎无吸收,在262nm处有一些吸收。
如系纯品,则A294/A262=3.39;如有杂质,则在262nm处A增加,使峰谷处A的比值小于3.39,一般规定次比值不应小于3.0。
3.定量方法
(一)单组分的定量方法
根据朗伯-比尔定律,物质在一定波长处的吸光度与浓度之间有线性关系。
因此,只要选择合适波长作为入射光测定溶液的吸光度A,即可求出浓度。
通常以待测物质吸收光谱的最大吸收峰处的波长作为测定波长。
标准曲线法:
先配制一系列浓度不同的标准溶液,以不含被测组分的空白溶液作为参比溶液,在相同条件下分别测定标准溶液的吸光度,以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制A-C关系曲线,或叫工作曲线。
此曲线应是一条通过原点的直线。
再根据样品溶液所测得的吸光度,从标准曲线上求得样品溶液的浓度。
绘制标准曲线应注意一般至少应作四个点,测定时每一浓度至少应同时作两管(平行管),同一浓度平行测到的吸光度值相差不大时,取其平均值。
标准对照法:
在相同实验条件下,配制样品溶液和标准溶液(样品溶液中的被测组分与标准溶液是同一种物质),在选定波长处,分别测量吸光度。
根据比尔定律:
用同一台仪器在同一波长处测定,因是同一物质,即K标=K样,因吸收池厚度相同,即
。
所以:
吸光系数法:
定量时吸光系数ε或
,可从手册或文献中查到,是物质的特性常数。
例维生素B12的水溶液在36lnm处的
=207,盛于1cm的吸收池中,测得溶液的吸光度A为0.621,求溶液的浓度。
解:
根据光的吸收定律,溶液的浓度为:
0.003g/100ml=30(ug/ml)
注意:
根据比吸光系数的定义,计算结果的单位应为g/100ml;如用摩尔吸光系数则结果单位应是mo1/L。
也可将待测溶液的吸光度换算成样品的比吸光系数,并计算与标准吸光系数的比值,来求待测物质的含量。
(二)多组分的定量方法
当溶液中有两种或多种组分共存时,可根据各组分吸收光谱相互重叠的程度分别考虑测定的方法。
比较理想的情况是各组分的吸收峰(λmax)所在波长处,其他组分没有吸收,则可按单组分的测定方法分别在λ1处测定a组分的浓度,在λ2处测定b组分的浓度,这样测定a、b两组分的结果互不干扰。
如果a,b两组分的吸收光谱部分重叠,可先在λ1处按单组分的测定方法测定a组分的浓度Ca,b组分在此处没有吸收,故不干扰;然后在λ2处测得混合物溶液的总吸光度
,即可根据吸光度的加和性计算b组分的浓度Cb。
设液层厚度为1cm,则:
式中a,b两组分的吸光系数
和
需事先求得。
但在混合组分测定中,实际遇到最多的情况是吸收光谱双向重叠,互相干扰,两组分在最大吸收波长处互相有吸收。
解线性方程法:
事先测知λ1和λ2处组分各自
、
、
、
之值,则在两波长处分别测得混合物的
和
后,因吸光度具有加和性,所以就可用线性方程组解得两组分的Ca和Cb,假设液层厚度为1cm,则:
因为:
所以:
式中浓度C的单位依据所用的吸光系数而定,如用比吸光系数
,则C为百分浓度。
等吸收双波长消去法:
在吸收光谱互相重叠的a、b两组分的混合物中,先设法消去组分a的干扰而测定组分b的浓度。
方法是选取两个波长λ1 和λ2,使组分a在这两个波长处的吸光度相等,即
。
而对欲测组分b在两波长处的吸光度则有尽可能大的差别。
用这样两个波长测得混合组分的吸光度之差,只与组分b的浓度成正比,而与组分a的浓度无关。
可用数学式表达如下:
另外,还有导数光谱法,系数倍率法等,这些都是消除干扰,提高灵敏度的方法。
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