医学分子生物学.docx
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医学分子生物学
医学分子生物学
医学分子生物学
名词解释:
结构基因(structuralgenes):
可被转录形成mRNA,并转译成多肽链,构成各种结构蛋白质,催化各种生化反应的酶和激素等。
ORF开放阅读框架(openreadingframe,ORF):
是指DNA链上,由蛋白质合成的起始密码开始,到终止密码为止的一个连续编码。
C值(C-value):
一种生物体单倍体基因组DNA的总量,用以衡量基因组的大小。
C值矛盾/C值悖论:
C值和生物结构或组成的复杂性不一致的现象。
基因组(genome):
是指生物体全套遗传信息,包括所有基因和基因间的区域
重叠基因
是指同一段DNA片段能够参与编码两种甚至两种以上的蛋白质分子。
SNP单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism)
是由基因组DNA上的单个碱基的变异引起的DNA序列多态性。
是人群中个体差异最具代表性的DNA多态性,相当一部分还直接或间接与个体的表型差异、对疾病的易感性或抵抗能力、对药物的反应性等相关。
SNP被认为是一种能稳定遗传的早期突变
蛋白质组(proteomics):
指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学,其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态,了解蛋白质之间的相互作用与联系,揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律.
质谱技术massspectrometry,MS
样品分子离子化后,根据不同离子间质核比(m/z)的差异来分离并确定分子量
开放阅读框=ORF
基因工程
又称为重组DNA技术,是指将外源基因通过体外重组后导入受体细胞,并使其能在受体细胞内复制和表达的技术。
限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)
是一类能识别和切割双链DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶。
逆转录酶
依赖RNA的DNA聚合酶,它以RNA为模板、4种dNTP为底物,催化合成DNA,其功能主要有:
1)逆转录作用;2)核酸酶H的水解作用;3)依赖DNA的DNA聚合酶作用。
粘性末端
被限制酶切割后突出的部分就是粘性末端(来自360问答)
载体vector
指能携带外源DNA片段导入宿主细胞进行扩增或表达的工具。
载体的本质为DNA。
多克隆位点
载体上具有多个限制酶的单一切点(即在载体的其他部位无这些酶的相同切点)称为多克隆位点
报告基因(reportergene):
是指处于待测基因下游并通过转录和表达水平来反映上游待测基因功能的基因,又称报道基因。
转化
以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程称为转化(transformation)
感受态细胞
细胞膜结构改变、通透性增加并具有摄取外源DNA能力的细胞称谓感受态细胞(competentcell)。
碱裂解法
在NaOH提供的高pH(12.0~12.6)条件下,用强阳离子去垢剂SDS破坏细胞壁,裂解细胞,与NaOH共同使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA发生变性,释放出质粒DNA。
核酸变性
变性(denaturation):
在某些理化因素的作用下,维系DNA分子二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏,DNA由双螺旋变成单链过程。
核酸复性
复性(renaturation):
指变性DNA在适当条件下,二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象,它是变性的一种逆转过程
核酸分子杂交(molecularhybridization):
两条DNA链或两条RNA链或一条DNA链和一条RNA链按碱基互补的原则缔合成异质双链的过程称为分子杂交或核酸分子杂交。
融解温度(meltingtemperature,Tm):
在热变性过程中,紫外吸收增加值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度或融解温度
退火(annealing):
热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性,此过程称之为“退火”。
核酸探针(nucleicacidprobe):
是指能与特定核苷酸序列发生特异性互补杂交,杂交后可用特殊方法检测的已知被标记的核酸分子。
Northern杂交
Northern印迹(Northernblot)杂交是应用DNA探针检测特异mRNA的另一种膜上印迹技术
Southern杂交
一种经典的膜上检测DNA的杂交技术。
通常是指通过吸附或电泳方法将经凝胶电泳分离的DNA从胶上转移到固相载体上,再与特定的核酸探针反应从而达到检测或鉴定DNA的过程。
荧光原位杂交(fluorescencein-situhybridization,FISH)
是一种利用非放射性的荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术。
PCR聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)技术:
是利用针对目的DNA序列设计的一对特异引物,以目的DNA序列为模板,在耐热的DNA聚合酶作用下,经过多次“变性-复性-延伸反应”的循环过程,体外扩增目的DNA序列的技术。
巢式PCR:
是指使用两对引物,外引物用于扩增含目的DNA片段的大片段,扩增产物作为内引物的模板进一步扩增目的DNA片段的技术。
逆转录PCR(反转录PCR,reversetranscriptionPCR,RT-PCR):
是指在逆转录酶作用下,先将模板RNA逆转录为互补DNA(cDNA),再以cDNA为模板通过PCR进行DNA扩增的技术。
多重PCR
该技术是在一个反应体系中加入多对引物,同时扩增出多个核酸片段,由于每对引物扩增的片段长度不同,可用电泳加以鉴别
TDPCR
根据引物Tm值,选定一个退火温度范围(跨越10-20℃的温度范围,引物Tm值在这个范围之内)。
在设置循环参数时,让退火温度从选定范围的最高温度开始,逐步降低退火温度(每次降低1-5℃),最后结束在选定范围的最低温度。
在每一个退火温度上循环2-5次。
荧光定量PCR
FluorescenceQuantitivePolymeraseChainReaction,FQ-PCR)是通过对PCR扩增反应每个循环结束时产物荧光信号的检测,对起始模板进行定量分析的技术。
问答题
高等动物线粒体基因组的特点?
1、母系遗传。
子代线粒体基因组来自母亲,父系的线粒体基因组在精卵结合时一般不能进入卵细胞。
因此,在子代个体发育过程中没有父母双方线粒体DNA的重组发生。
2、线粒体DNA损伤后不易修复,突变率较高,可能与衰老及某些疾病有关。
3、遗传密码与通用遗传密码存在差别,如UGA(终止密码子)编码Trp,AGA/AGG(Arg)为终止密码子,AUA(Ile)为起始密码子并编码Met。
真核生物与原核生物基因组的区别?
1)真核生物基因分布在多个染色体上,而原核生物只一个染色体。
2)真核生物在基因组转录后的绝大部分前体RNA必须经过剪接过程才能形成成熟的mRNA,而原核生物的基因几乎不需要转录后加工。
3)真核生物细胞中DNA与组蛋白和大量非组蛋白结合,并有核膜将其与细胞质隔离,结果真核细胞的转录和翻译在时间上和空间上都是分离的,而原核细胞的基因转录和翻译是同步的。
4)真核生物的基因是不连续的,中间存在不被翻译的内含子序列,而原核生物几乎每一个基因都是完整的连续的DNA片段。
何谓断裂基因,简述其基本性质?
断裂基因:
基因的编码序列在DNA上不是连续的,而是被不编码的序列隔开。
性质:
1)外显子在基因中的排列顺序和它在成熟mRNA产物中的排列顺序是相同的,
2)某种断裂基因在所有组织中都有相同的内含子成分,
3)核基因的内含子的可读框通常含无义密码子,没有编码功能。
4)通常内含子上发生的突变不能影响蛋白质的结构,其突变对生物体没有影响;但也有例外。
简述SNP研究的意义?
(来自XX)
SNP的应用范围较微卫星标记更加宽广,对群体遗传学、制药业、法医学、癌症及遗传性疾病甚至进化的研究都产生不可估量的影响。
人们希望通过研究SNP图谱,更深刻的认识癌症、糖尿病、血管性疾病和某些精神性疾病等发病率高的多基因疾病的发病机制。
1、遗传病致病基因连锁定位。
2、SNP与药物遗传学和药物基因组学:
个性化用药
何谓蛋白质组学?
请介绍目前蛋白质组学研究中最常用的基本技术流程并简述其原理?
1、蛋白质组学(proteomics):
指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学,其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态,了解蛋白质之间的相互作用与联系,揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律.
2、基于凝胶的工作流程是目前使用的较为广泛的、发展最为成熟的工作流程:
双向电泳的流程主要包括:
1)样品制备;2)第一向等电聚焦;3)第二向SDS-PAGE;4)凝胶上蛋白的检测;5)蛋白的软件的检测。
3、双向凝胶电泳(two-dimensionalelectrophoresis,2-DE)的原理:
利用蛋白质的等电点与分子量差异分离之。
第一向:
变性等电聚焦电泳,根据蛋白质的等电点进行分离;第二向:
SDS聚丙烯酰胺电泳,根据蛋白质分子量进行分离。
简要介绍酵母双杂交技术的原理及其用途?
酵母双杂交系统(Yeasttwo-hybridsystem)的原理:
1、典型的真核转录因子都含有二个结构域:
DNA结合结构域(DNAbindingdomain,DNA-BD)和转录激活结构域(activationdomain,AD)。
2、二个结构域功能上相互独立又互相依赖,只有结合才具完整活性。
3、酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白-蛋白的相互作用。
用途(来自课本P42-43)
1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质功能
2、利用酵母双杂交在细胞内研究抗原和抗体的相互作用
3、利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响
4、利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图
简单介绍质粒及其在分子生物学研究中的应用?
质粒(plasmid)是指细菌染色体以外的小分子环状双链DNA,能自我复制和表达其携带的遗传信息。
质粒克隆载体的主要用途:
①用于保存和扩增<2Kb目的DNA。
②构建cDNA文库。
③目的DNA的测序。
④作为核酸杂交时的探针来源。
作为克隆载体的质粒应具备哪些特点?
(来自360问答)
用作克隆载体的理想质粒一般具备下述特点:
①具有松驰型复制子(如ColE1),复制子(replicon)是质粒自我增殖所必不可少的基本条件,并可协助维持使每个细胞含有一定数量的质粒拷贝。
②在复制子外存在几个单一的酶切位点(或多克隆位点),以便目的DNA片段插入。
③具有插入失活的筛选标记,理想的质粒载体应具有两种抗菌素抗性标志,如氨苄青霉素抗性基因(Ampr)和四环素抗性基因(Tetr)等,以便从平板中直接筛选阳性重组子。
④分子量相对较小和较高的拷贝数。
此外,质粒的缺点是容量较小,一般只能接受小于15kb的外来DNA,插入片段过大会导致重组子扩增速度减慢,甚至使插入片段失活。
主要是对目的基因克隆,建立DNA文库和cDNA文库,其上有复制子即可。
简述分子克隆技术的基本步骤?
一、目的基因的获取
二、载体的选择
三、目的基因和载体的酶切与连接
四、重组DNA导入受体细胞
五、重组体的筛选和鉴定
简述蓝白斑筛选实验的原理?
β-半乳糖苷酶基因失活筛选(蓝白斑筛选):
使用的载体带有大肠杆菌的DNA短区段,含有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和N端146个氨基酸的编码信息,这个编码区中插入了一个多克隆位点,它并不破坏读框,宿主细胞携带编码β-半乳糖苷酶C端部分序列,虽然宿主和质粒的片段各自都没有酶活性,但能融为一体,形成具有活性的酶蛋白质-β-半乳糖苷酶,这种互补现象叫α互补,在生色物质X-gal和IPTG存在下形成蓝色菌落,但在外源基因插入到多克隆位点后,破坏了质粒载体β-半乳糖苷基因读框,不能编码β-半乳糖苷酶,就形成白色菌落。
如何进行基因组DNA的提取、纯化和鉴定?
1、生物样本预处理:
粉碎组织、理解细胞,DNA释放、蛋白质沉淀降解。
2、分离:
酚抽提法、甲酰胺解聚法、玻璃缠绕法、异丙醇沉淀法。
3、纯化:
对基因组DNA粗品通过透析、层析、电泳(PAG、AGE、PFGE)、选择性沉淀等方法提取特定DNA片段,并通过柱层析、有机溶剂抽提等方法沉淀、洗涤、得到基因组DNA纯品。
4、鉴定:
浓度鉴定、纯度鉴定、完整性鉴定。
简述寡核苷酸探针的设计原则?
设计原则:
1、探针长度:
一般要求在10~50bp
2、G/C含量为40%~60%
3、探针分子中应避免互补序列
4、避免同一碱基连续出现,一般不能多于4个,如GGGG-或-CCCC-
5、借助计算机相应软件与已知的各种基因序列进行同源性比较
理想的探针标记物应具有哪些特点?
理想的探针标记物应具有以下特点
1、检测物要灵敏、特异、稳定、简便
2、标记物与探针结合后,应不影响杂交反应,尤其是杂交特异性、稳定性和Tm值
3、标记物对环境污染小,对人体无损伤,价格低廉
4、标记物对检测方法无干扰。
核酸分子杂交的影响因素有哪些?
1、探针的选择;2、探针的标记方法;3、探针的浓度;4、杂交反应温度;5、杂交反应时间;6、洗膜温度;7、杂交液。
PCR的原理是什么?
PCR体系需具备哪些要素?
原理:
1、PCR技术实际上是模拟体内DNA半保留复制过程,在模板DNA、引物和四种dNTP存在的条件下,依赖于DNA聚合酶的酶促反应,由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成。
2、在下一轮循环中,DNA双链再经变性、退火、延伸三步,模板DNA数量翻一倍(假设扩增效率为100%)。
如此反复循环,便可使DNA以指数形式进行扩增。
每完成一个循环需2~4min,2~3h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
到达平台期(plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝数。
PCR反应体系:
模板(template);引物(primer);DNA聚合酶(DNApolymerase);dNTP;PCRbuffer
简述PCR技术的一般方案。
1、50ulPCR反应体系的组成:
样品DNA0.1~1ug;正链引物(25umol/L)1.0ul;负链引物(25umol/L)1.0ul;dNTP(各2.5mmol/L)4.0ul;10×PCR缓冲液5.0ul;MgCl2(25mmol/L)3.0ul;TaqDNA聚合酶1~2.5u;蒸馏的去离子水补至50ul。
2、对照:
阳性对照、空白对照分别以阳性模板DNA、蒸馏的去离子水取代样品DNA。
3、PCR仪工作参数的设置:
94℃30~60sec,55℃30~60sec,72℃30~60sec,循环30次,最后72℃延伸5min。
4、PCR产物的保存:
PCR产物于4℃保存。
PCR引物的设计原则有哪些?
1、长度15~30b,过短特异性降低,过长则成本增加,产量也下降。
2、引物碱基尽可能随机分布,避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象,引物G+C含量宜在45~55%左右。
3、引物内部不能含有自身互补序列,否则会形成发夹样二级结构;两个引物之间尤其在3’末端不应有互补链存在,不然会形成引物二聚体。
4、引物的碱基顺序与非扩增区域同源性小于70%或连续互补碱基少于8个。
要求在引物设计时采用计算机进行辅助检索分析。
5、引物的3′末端与模板DNA一定要配对。
另外3′末端的末位碱基最好选T、G、C,而不选A(引物3′末端碱基在错误配对时不同碱基的引发效率存在很大差异)。
6、只要与模板DNA结合的引物长度足够,引物的5′末端碱基最多可以有10个碱基不与模板DNA匹配,并不影响PCR反应进行。
TaqMan荧光定量PCR技术的原理是什么?
1、PCR扩增时,Taq酶的5’端-3’端外切酶活性将探针酶切降解,
2、3’端的荧光Q分子吸收5’端荧光R分子的荧光信号;
3、探针5’端连接的荧光R分子被Taq酶切割下来;
4、荧光R分子发出荧光,切割的荧光分子数与PCR数量成比例。
有哪些荧光定量PCR技术?
请分别简述其要点。
1、荧光染料法:
SYBRgreen荧光染料能特异性地掺入DNA双链,发出荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发出任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
2、荧光探针法
1)Taqman技术:
3’端的荧光Q分子吸收5’端荧光R分子的荧光信号;探针5’端连接的荧光R分子被Taq酶切割下来;荧光R分子发出荧光,切割的荧光分子数与PCR数量成比例。
3)LightCycler探针技术:
荧光淬灭的程度与起始模板数的量成正比
3)molecularBeacon技术(分子灯塔法)工作原理:
包括发夹形的寡聚核苷酸探针和内部淬灭的荧光团;分子灯塔形成茎环发夹结构,使荧光剂和淬灭剂紧密接触,导致荧光淬灭;单链寡核苷酸探针由于与靶基因碱基序列互补而与之杂交;探针5’和3’端分离,淬灭剂对荧光剂的淬灭作用消失,产生荧光。
4)复合探针法:
基本原理:
首先合成两个探针,一是荧光探针(25bp),5′端接一荧光分子,另一为淬灭探针(15bp),3′端接一淬灭分子,淬灭探针能与荧光探针5′端杂交。
简述荧光定量PCR的优点及其应用。
优点:
快速、重复性好、灵敏度和特异性高,可对模板精确定量。
克服了传统PCR技术普遍存在的假阳性及不能定量等问题。
1、监测患者病情、预后、指导用药;
2、大规模人群分子流行病学调查;
3、肿瘤、遗传病研究;
4、基因表达研究。
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- 医学 分子生物学