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毛发中GHB的检测及评价
毛发中GHB的检测及评价
沈敏,刘晓茜,刘伟,向平,沈保华
【摘要】[摘要]目的探索毛发中外源性GHB的检测及判断的可行性,为涉GHB的鉴定提供方法和依据。
方法建立毛发中GHB的GC/MS分析方法,并通过动物实验,考察毛发中内源性GHB的质量分数范围、外源性GHB在毛发中的时间过程以及给药剂量、毛发颜色与毛发中GHB的质量分数关系。
结果豚鼠和中国人黑色毛发中内源性GHB质量分数分别为(3.01±1.41)ng/mg(n=28)和(1.02±0.27)ng/mg(n=20);摄GHB后毛发中GHB质量分数明显增加且与给药剂量呈正相关性;GHB在毛干中呈窄带分布;深色毛发中GHB质量分数高于浅色毛发。
结论毛发中GHB的检测适用于GHB滥用和中毒的法医毒物学鉴定;根据毛发中的GHB质量分数和毛发分段分析可判断GHB的来源。
【期刊名称】法医学杂志
【年(卷),期】2006(022)001
【总页数】4
【关键词】[关键词]γ-羟基丁酸(GHB);GC/MS;毛发分析
γ-羟基丁酸(Gamma-hydroxybutyricacid,GHB)是我国列为二类精神药物管理的物质。
近年来,国外、境外与GHB有关的性犯罪案件带来了严重的社会问题,使得研究、建立体内GHB的分析、确认、评判体系成为司法鉴定实践的重大需求。
GHB不同于其它滥用药物,它是人体内固有的内源性物质,是体内抑制型神经递质γ-氨基丁酸的代谢产物,这种特殊性质给研究带来了复杂性。
本文作为体内GHB的检测、分布及评价的系统研究的组成部分,主要探索具有长检测窗优势的毛发检材检测及判断外源性GHB的可行性。
国外关于毛发中GHB的检测,有一些案例分析的报导[1-3],但GHB在毛发中的分布、时间过程以及毛发中GHB质量分数的影响因素尚未明了。
本研究在毛发中滥用药物分析的基础上,优化、建立了毛发中GHB的GC/MS分析方法,考察了中国人黑色毛发中内源性GHB的存在状况,并通过动物实验,研究外源性GHB在毛发中的时间过程以及给药剂量、毛发颜色与毛发中GHB的质量分数关系。
由此探索毛发分析判断GHB来源和判断GHB滥用史的可行性,为是否摄入GHB及GHB滥用、中毒的分析和评判提供方法和依据。
1材料与方法
1.1仪器与试剂
仪器:
Agilent6890/5973N气/质联用仪(GC/MS)。
试剂:
GHB(LancasterSynthesis)、GHB-d6(Cerilliant);衍生化试剂MTBSTFA(Supelco);乙腈(Merck);甲醇和乙酸乙酯均为国产分析纯。
1.2动物实验
实验动物:
豚鼠(普通级,体质量200~400g,雄性,中科院实验动物部提供),悬挂、分笼喂养。
适应性喂养一周后,剃去背部中央的毛发(6cm×4cm)作为取样区,进行各项实验。
1.2.1豚鼠毛发中内源性GHB的测定
选取背部黑色毛发豚鼠,剃去背部取样区的毛发,测定空白毛发中内源性GHB的质量分数。
1.2.2豚鼠毛发中GHB的时间过程
选背部黑色毛发豚鼠12个,分成二组,每组6个,给药前剃光背部取样区毛发。
一组以1000mg/kg剂量单次腹腔注射GHB,每天剃毛分别包装保存,连续10d。
并在腹腔注射GHB1h后采集毛囊。
另一组以800mg/kg剂量腹腔注射GHB,隔天一次,连续7次。
隔天剃毛分别包装保存,连续20d。
1.2.3染毒豚鼠毛发中GHB质量分数与毛发颜色的关系
选背部长有不同毛发色块(黑、白、棕)的豚鼠,n=6,给药前剃光背部取样区毛发,以800mg/kg剂量腹腔注射GHB,给药后第二天分别剃黑、白、棕色毛发。
1.2.4染毒豚鼠毛发中GHB浓度与给药剂量间关系
选背部黑色毛发豚鼠18个,分成三组,每组6个,给药前剃光背部取样区毛发。
分别以200mg/kg、400mg/kg、800mg/kg剂量腹腔注射GHB,隔天一次,连续7次。
给药后第二天开始隔天剃毛并分装保存,连续10次。
1.3样品处理方法
毛发样品用蒸馏水振荡洗涤三次,再用丙酮振荡洗涤三次,晾干后剪成2~4mm长度,保存供检。
准确称取10mg毛发,加入内标GHB-d6,0.1mol/L的NaOH0.5mL,于90℃水浴中水解45min,冷却后用2mol/L的HCl调pH值小于4,然后用3mL乙酸乙酯混合、离心、提取。
上清液吹干后加入20μL乙腈和20μLMTBSTFA微波衍生化,取1μL进样。
1.4分析条件
色谱柱:
HP-5毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm);柱温:
初始温度100℃,保持2min,20℃/min升温至280℃,保持10min;进样口温度:
250℃;接口温度:
280℃;离子源温度:
230℃;采用full-scan法,EI源(m/z40~550)。
GHB及内标GHB-d6的特征离子、保留时间和定量离子见表1。
2结果和讨论
2.1分析方法的建立和评价
分别在0.5mL0.1mol/L的NaOH和10mg空白毛发中准确加入一定量的GHB和100ngGHB-d6,制成标准系列样品,按“样品处理方法”处理,用GC/MS/SIM法测定。
结果表明在所实验的浓度范围,GHB浓度和GHB与GHB-d6峰面积比值呈线性关系(表2),方法的精密度和回收率见表3,最低检测限为0.5ng/mg(S/N≥3)。
在样品处理中,毛发的清洗是必需的步骤。
尽管文献[3]报道用水和二氯甲烷清洗毛发的较多,但由于水和二氯甲烷互不相溶,且二氯甲烷不易挥发,故在毛发的清洗过程中需要花费较大的人力和时间。
考虑到本研究检测目标物为极性的低分子量化合物,用丙酮替代二氯甲烷,既可消除干扰,又可简化毛发洗涤过程。
比较两者清洗的干净程度,无明显差异。
毛发的洗涤与否差别很大。
毛发污染是假阳性结果的主要来源,本实验可能污染来源为部分GHB通过汗液排出体外时附着在毛发的表面。
这一点得到实验数据的证实,同样的阳性毛发,清洗和未清洗的GHB质量分数分别为5.07ng/mg和253ng/mg。
Kalasinsky[1]的实验也得到同样的结果,未经清洗的GHB质量分数为2221ng/mg的阳性毛发经清洗后,其GHB质量分数下降至47.4ng/mg。
因此,毛发清洗溶剂中目标物质量分数的阴性结果是评价毛发清洗效果的一个重要指标。
毛发水解方法包括酸水解、碱水解、酶水解和甲醇超声法等。
对于结构稳定的GHB而言,碱水解可使固化在毛发中的目标物完全释放而成为首选方法。
实验结果表明:
0.1mol/L的HCl45℃水解过夜条件温和,但耗时较长且回收率较低;1mol/L的NaOH水解,杂质干扰极多,需增加净化步骤;而0.1mol/L的NaOH90℃水解45min,可得到较高的提取效率及较少的杂质干扰,且方便迅速。
本研究考察了毛发中GHB在上述所选水解条件下的稳定性,用空白毛发添加不同量GHB,水解后提取测定,并与相同量GHB直接提取吹干衍生化后测定结果相比较,结果表明:
在上述条件下水解GHB不发生分解,回收率稳定。
极性化合物GHB的衍生化是GC/MS分析的必经步骤。
研究发现,GHB用BSTFA衍生化后因毛发基质中杂质的干扰而影响分析,而改用分子量更大的MTBSTFA衍生化试剂,则可消除干扰获得较理想的结果。
2.2毛发中内源性GHB的质量分数
黑色毛发豚鼠28只,取背部毛发测定内源性GHB的质量分数,其GHB质量分数平均值、中位数、标准差、质量分数范围见表4。
同法测定20名中国健康志愿者黑色头发中内源性GHB的质量分数,数据见表4。
从表4可见,不同种属毛发中内源性GHB的质量分数是不同的。
豚鼠毛发中GHB的质量分数明显高于人头发中GHB质量分数,这与我们前期考察不同种属体液、组织中内源性GHB质量分数的结果相同。
Goulle[3]测定了不同颜色毛发中内源性GHB的质量分数,结果为:
浅色头发GHB质量分数平均值0.60ng/mg(n=12),范围0.35~0.95ng/mg;棕色头发GHB质量分数平均值0.90ng/mg(n=30),范围0.41~1.86ng/mg;黑色头发GHB质量分数平均值0.90ng/mg,范围0.32~1.54ng/mg(n=19),与本研究结果一致。
内源性GHB的存在,给阳性结果判断带来了困难。
较好的方法是测定大量内源性GHB质量分数数据,建立相关人群的cut-off值,作为阳性结果认定的阈值,高于此值时,报告阳性结果。
初步研究结果表明,毛发中内源性GHB质量分数变异范围较小,在此基础上建立的cut-off值具有应用价值。
根据测定值是否高于cut-off值,即可判断是否有外源性GHB的摄入。
2.3外源性GHB在毛发中的时间过程
豚鼠单次(1000mg/kg)和多次(800mg/kg)腹腔注射GHB后,分别测定所剃毛发中GHB的质量分数,结果如图1所示。
从图1可以看出,单次给药(1000mg/kg)后第一天毛发中GHB的质量分数即达到峰值,接下来的四天内GHB的浓度迅速下降,给药后第五天以后毛发中GHB的浓度下降的速度缓慢,至接近内源性值。
多次(800mg/kg)给药组总体药物时间过程同单次给药组,末次给药的第二天GHB的质量分数达到峰值,停药后GHB的质量分数迅速下降,但末次给药后第六天仍能从毛发中测得很高的GHB质量分数。
药物摄入后到达毛发的时间以及在毛干中的分布因药物性质而异。
上述结果表明:
(1)外源性GHB进入体内后很快到达毛发,Goulle[3]考察了健康志愿者单剂量服用GHB后,胡须中质量分数的最高值也是药后24h,与本研究结果一致。
(2)多次给药组体内GHB有蓄积现象,毛发中GHB的峰值高且下降至正常值的时间长于单次给药组。
(3)GHB在毛干中呈窄带分布,一次用药后仅在4~5d生长的毛发中表现为GHB质量分数明显增加。
药物在毛干中不存在纵向扩散是毛发分段分析推断用药史的基础。
测定染GHB后1h采取的豚鼠背部毛囊(n=6),质量分数分别为115,79,155,135,159,230ng/mg,远高于毛发GHB质量分数。
因此,毛囊也可用于GHB中毒的鉴定。
2.4给药剂量与毛发中GHB质量分数的关系
三组不同给药剂量(200,400,800mg/kg)豚鼠毛发中GHB的质量分数测定结果如图2所示,图中各点分别代表各剂量组不同时间段(每点代表前后两天)内毛发中GHB的平均质量分数。
实验结果显示,毛发中GHB的质量分数与给药剂量相关。
尽管低剂量组和中剂量组豚鼠毛发中GHB的质量分数相差不多,但高剂量组豚鼠毛发中GHB的质量分数明显高于其它两组。
各剂量组豚鼠毛发中药物浓度-时间过程基本一致。
姜宴等[4]研究了毛发中甲基苯丙胺及代谢物苯丙胺的质量分数与剂量的关系,结果表明甲基苯丙胺和苯丙胺的质量分数与给药剂量相关,即给药的剂量大毛发中所含的药物和代谢物质量分数也高。
沈敏等[5,6]考察了毛发中度冷丁、氯丙嗪、氯氮平的质量分数与剂量的关系,发现两者均存在正相关性。
毛发中药物质量分数与给药剂量相关的特性是根据毛发生长速度(约1.0~1.2cm/月)分段分析,对药物滥用方式(偶尔或反复用药)及滥用剂量进行推测的基础。
笔者认为,对于同一个体而言,内源性GHB在不同时间生长的毛发中质量分数应是比较恒定的,因此,根据毛发分段分析,比较其质量分数差异,可判断被检者是否摄入GHB以及摄药史。
建立在同一个体基础上的阳性确认较建立在群体cut-off值基础上的阳性确认更为合理和更具可操作性。
2.5毛发颜色与毛发中GHB质量分数的关系
选择GHB质量分数较高的6个染毒豚鼠的同体黑、棕、白色毛发进行检测,各色毛发中GHB的质量分数显示(图3):
同体豚鼠毛发中GHB的质量分数与颜色有关,质量分数从大到小依次为黑色、棕色、白色。
毛发颜色对毛发中药物质量分数的影响直接关系到毛发分析结果的评定。
很多学者通过多种方法研究了毛发颜色对毛发中药物质量分数的影响,结论分歧很大。
Kelly[7]和Mieczkowski[8]用大量的毛发样品的检测数据对毛发中可卡因、苯丙胺类、大麻类等滥用药物的质量分数和毛发颜色进行统计学分析,结果显示这些滥用药物的质量分数与毛发的颜色没有关系,而且这些药物也不会选择性地结合某一种颜色的毛发。
Kronstrand[9]通过研究帕金森病人毛发中苯丙胺类药物质量分数与毛发颜色的关系,得出苯丙胺类药物偏爱有色毛发的结论,也就是说在有色毛发中的质量分数高于白色毛发。
沈敏等[10]通过动物实验考察了毛发颜色与毛发中芬氟拉明、甲基苯丙胺、MDMA质量分数的关系,同样得到深色毛发药物质量分数远高于浅色毛发的结论。
分析上述研究结果的差异,其可能原因为:
一是研究方法不同。
有的从统计学的角度出发,分析了大量的数据,但是忽略了不同个体之间的差异,没有在同等的给药条件下进行比较。
而有的在同等的给药条件下进行动物或者人体实验,结论比较客观,但是样本量比较小,且不能排除个体以及种属的差异。
本研究采用的动物模型是同体豚鼠不同颜色阳性毛发中药物质量分数的比较,避免了动物的种属和个体的差异对结果的影响。
二是药物因性质不同而在毛发中有不同的表现。
药物与毛发的结合机制目前存在多种解释模型,而药物与黑色素结合仅为其中的一种解释,因此,出现药物与毛发颜色关系的不同实验结果和结论是可能并且合理的。
根据本实验结果,笔者认为GHB阳性毛发检测结果的判定必须考虑毛发颜色这个重要因素。
3结论
研究结果表明:
(1)所建毛发中GHB的分析方法满足毛发中内源性和外源性GHB测定的需要,适用于GHB滥用和中毒的法医毒物学鉴定;
(2)摄GHB后毛发中GHB质量分数明显增加且与给药剂量呈正相关性,GHB在毛干中呈窄带分布;(3)中国人黑色毛发中内源性GHB的质量分数为1.02±0.27ng/mg(n=20),根据毛发中GHB的测定量和毛发分段分析可判断GHB的来源。
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