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葛根芩连汤中不同配伍对小鼠细菌性痢疾影响的研究
葛根芩连汤中不同配伍对小鼠细菌性
痢疾影响的研究
XXXXXX大学
XXXXX学院
葛根芩连汤研究小组
2010.3—2011.5
葛根芩连汤配伍对实验性菌痢药效比较研究
摘要
目的葛根芩连汤中不同配伍对小鼠细菌性痢疾影响,探讨复方的组方原理和配伍规律。
方法采用L8(27)正交表对葛根芩连汤进行组方分解组合,将葛根作为主要因素并固定不变,以黄芩、黄连、甘草为三因素,“有”和“无”为两水平,得出含麻黄的8个组合[1]:
①葛根(15g)、黄芩(9g)、黄连(9g),甘草(6g),②葛根(15g)、黄芩(9g)、黄连(9g),③葛根(15g)、黄芩(9g)、甘草(6g),④葛根(15g)、黄芩(9g),⑤葛根(15g)、黄连(9g)、甘草(6g),⑥葛根(15g)、黄连(9g),⑦麻黄(9g)、甘草(6g),⑧葛根(15g)。
每个处方量的配伍组均加水50mL,浸15min,葛根芩连汤先煎20min,再和余药共煎30min,8层纱布过滤去渣,旋转蒸发浓缩至39mL。
使各配伍组合中各组成药生药浓度与全方中各相应生药浓度相同。
用腹腔注射痢疾志贺菌,达到细菌性感染目的建立小鼠实验菌痢疾模型,取急性细菌性感染造模成功的小白鼠,分别禁食不禁水12h后,按正交试验设计方案,分别灌服已制备的葛根芩连汤各配伍组合水煎液,定期观察总便数、稀便数和稀便级。
得出腹泻指数。
进行重复的两个水平正交设计方差分析。
结果葛根芩连汤配伍在减少腹泻小鼠DI,主要作用药物为黄连,黄芩拮抗黄连,葛根能增加黄芩的作用,而炙甘草与黄芩黄连配伍后能增强黄连的作用。
结论在葛根芩连汤的抗腹泻药效中,其最佳组合为黄连和甘草。
关键词:
葛根芩连汤;配伍规律;正交设计;细菌性痢疾
EffectsofdifferentcompositionsofGegenqinliandecoctiononexperimentalshigellosis
Abstract
Objective:
ToinvestigatetherelationsbetweendifferentcompositionsofGegenqinliandecoctionandtheireffectsonexperimentalshigellosisinmousestoexplorethecompositionprotocolofGegenqinliandecoction.
Methods:
ThecompositionprotocolofGegenqinliandecoctionwasresolvedandassociatedbyorthogonaldesign.Gegenwasregardedasthemainfactor,Scutellariabaicalensis,Coptischinensis,liquoriceandEphedrasinicausedaschangeablefactors.Making“Yes”or“no”aslevel,whichproducedeightcombinations:
①Gegen(15g),Scutellariabaicalensis(9g),Coptischinensis(9g),liquorice(6g).②Gegen(15g),Scutellariabaicalensis(9g),Coptischinensis(9g)③Gegen(15g),Scutellariabaicalensis(9g),liquorice(6g).④Gegen(15g),Scutellariabaicalensis(9g).⑤Gegen(15g),Coptischinensis(9g),liquorice(6g).⑥Gegen(15g),Coptischinensis(9g).⑦Ephedrasinica(9g),liquorice(6g).⑧Gegen(15g).Eachprescriptionwasputinto50mLwater,andsoakedfor15min.First,Gegenqinliandecoctionwasdecocted20min,thenothersingredientswereputintothedecoction,anddecocted30minagain.Usinggauzefoldedeightfloorsupfiltereddregs,andthenthroughrevolvingevaporationconcentratedthemto39mL.Makingdensityoftheeachdesignedprescription’singredientassameastheprescription’s.Mouse’smodelsofintestinalinvasioninducedbyShigellaflexneriwasestablishedbydirectlyinoculatingthebacteriuminthecolonaftercecumbypassoperation.Don’tfeedthemodelsofMousefor12hours,thenfeedingthemwithcorrespondingdesignedcombinations.Regularlyinvestigatedtheamountofthemouse’sfeces,themouse’sthickfeces,progressionofthemmouse’sthickfecesandincludingthediarrheaexponent;Makingtwolevels’investigationbyorthogonaldesignandvarianceanalysis.
Results:
AccordingtothebacterialcountofShigellainthecolon,Coptischinensis
arethemaineffectivedrugs,GeorgicouldenhancethefunctionofCoptischinensis,andliquoricecombinedwithCoptischinensisandScutellariabaicalensiscouldalsoenhancethefunctionofCoptischinensis,butScutellariabaicalensisandCoptischinensisantagonizedeachother.
Conclusion:
AmongthecomponentsofGegenqinliandecoction,thebestcombinationprotocolwasCoptischinensisandliquoriceonly.
Keywords:
Gegenqinliandecoction;compositionprinciple;orthogonaldesign;Shigellosis
目录
摘要2
目录5
1.前言6
1.1方剂组方原理研究的意义6
1.2目前中药复方拆方研究的主要思路和方法6
1.3实验选方依据6
1.4有关细菌性痢疾7
1.5实验研究目的7
2.实验材料与仪器8
2.1实验材料8
2.1.1实验动物8
2.2.1实验药品与试剂8
2.2实验仪器8
3.实验方法9
3.1药物组合的正交设计9
3.2汤药制备10
3.3痢疾动物模型制作10
3.3.1细菌制备10
3.3.2实验小鼠模型10
3.4分组造模实验10
3.5实验结果处理10
3.6统计方法10
4.实验结果11
4.1动物模型的建立及表现11
4.2葛根芩连汤配伍对腹泻小鼠的腹泻指数的影响11
5.实验讨论13
参考文献14
致谢15
附:
实验设计说明……………………………………………………………………16
1.前言
1.1方剂组方原理研究的意义
中药复方又称为方剂,它集中体现了中医理论的治则治法、配伍理论和组方
原则,是中医药防治疾病的重要形式,是介于中医基础理论和中医临床实践之间
的桥梁,是理论指导实践、实践推动理论的有效工具,其防病治病的有效性已被
几千年的临床实践所证实。
中药复方配伍是中医药的特色和优势,是中药复方的
灵魂所在,它既不是简单的药物作用在数量上的相加,也不是机械的毒副反应的
抵消,而是在辨证立法的基础上,以法立方,以方遣药的系统理论与实践[2]。
从本世纪60年代开始,随着现代科学技术的发展,随着中医药现代研究的开
展与深入,对传统方剂药理药效与配伍规律的研究也越来越引起人们的重视。
中
药复方配伍意义及作用机理的研究,不仅可以提高中医药的临床疗效,进一步提
高中药复方治疗的针对性,扩大其应用范围,并在此基础上创立和发明疗效确
切、作用机理清晰的新方:
而且可以揭示中药复方作用机理及其配伍意义的科学
内涵,对于促进中医理论的发展,推动中医药走向世界,也具有十分重要的意义。
1.2目前中药复方拆方研究的主要思路和方法
从方法学的角度来看目前拆方研究大致可以概括为以下三种[1]:
正交设计法、撤药分析法和简单拆方法[3]。
根据不同目的,所选择的拆方方法也不同。
正交设计法主要是利用正交设计表“均匀分布,整齐可比”的特点将方中各药(因素)合理安排,较适用于药味多、相互作用不可忽略时复方中诸药作用的分析。
撤药分析法则适用于研究某单味药对全方药效的影响,如刘小英[2]等在探讨泽泻及茯苓在六味地黄汤中的配伍意义时对其进行了撤药拆方,撤除泽泻、茯苓后观察方剂对小鼠免疫系统的影响。
结果表明,六味地黄汤能明显增加小鼠胸腺及脾脏的重量增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力,促进抗鸡红细胞抗体的生成,使免疫功能增强。
简单拆方是目前应用较多的一种方法,其主要拆方的依据是“君臣佐使”或“药对”等原则。
1.3实验选方依据
大量的研究证明经方不仅历经筛选,具有确切的临床有效性和实用性,而且
是“医方之祖”,是后世方剂发展的典范:
不仅最能反映中医组方理论之原始面
貌,而且具有扎实的现代药理实验研究基础。
因此,经方集中体现了中医药理论
和实践的精华,对经方配伍意义进行研究,不仅在理论探讨与临床应用上具有研
究必要性,在实验方法上具有操作可行性,而且在相同工作量的前提下,对经方
进行研究可以较研究其他方剂获取更多的信息,取得事半功倍的效果。
葛根芩连汤为医圣张仲景名方,出自《伤寒论·太阳篇》,有解表清里,升清止利之功,原用于太阳表证未解,误用攻下,邪陷阳明化热,利遂不止之“协热下利”证,主要表现为身热、下利。
现代医学认为,热利是包括菌痢、急性胃肠炎、病毒性腹泻等一类肠道病证,基本病因为病原微生物及其毒素,其下利未必为误下所致,临床凡泄泻、痢疾属里热者均可应用本方。
复方中重用葛根为君,既可解肌表之热,又能升发脾胃清阳之气而止利;黄芩、黄连为臣,性昧苦寒,善清里热,厚肠胃而治利:
甘草甘缓和中,并协调诸药为佐使[4-6]。
1.4有关细菌性痢疾
细菌性痢疾(Bacillarydysentery)简称菌痢,是一种肠道传染病。
该病终年散发,夏秋季引起流行,在卫生条件差的国家和地区发病率高。
全世界年病例数超过2亿,约5000万例需住院治疗,年死亡病例达65力。
我国近年细菌性痢疾的发病率虽有所下降,但该病仍是仅次于病毒性肝炎和结核病的重要的传染病。
志贺菌属(Shigella)细菌是细菌性痢疾的病原菌。
根据生化特性和血清学分为4个群(或种):
痢疾志贺菌(S.dysenteriae),福氏志贺菌(S.flexneri),鲍氏志贺菌(S.boydii)和宋氏志贺菌(S.sonnei)。
志贺菌的4个群均可引起菌痢,其中痢疾志贺菌Ⅰ型可产生外毒素(Shigatoxin),所致疾病相对严重,宋内志贺菌感染可出现无症状携带者。
由于抗菌药物的广泛应用,志贺菌耐药日趋严重[3]。
1.5实验研究目的
本实验研究葛根芩连汤中不同配伍对小鼠细菌性痢疾影响,探讨复方的组方原理和配伍规律,以葛根芩连汤为代表方,用药物代谢动力学方法,研究各个配伍组对该方中每味药的主要活性成分体内过程的影响。
2.实验材料与仪器
2.1实验材料
2.1.1实验动物
实验小鼠,清洁级,雌雄各半,体重18~25g,均武汉大学东湖分校实验中心提供。
分笼饲养,自由进食饮水,饲养7d,选取活动正常,无稀便者用于实验。
2.2.1实验药品与试剂
葛根芩连汤复方中四种配方葛根、黄芩、黄连、炙甘草购自与武汉市武昌区街道口北京同仁堂药店。
2.2实验仪器
高速离心机(D-37520,OsterodaamHarz)
电子天平(JY2002,上海衡平仪器仪表厂)
分析天平(AUY120,SHIMADZU)
数显鼓风干燥箱(GZX-9240MBE,上海博迅实业有限公司医疗设备)
MJ-300BS-Ⅱ霉菌培养箱(上海新苗医疗器械制造有限公司)
超速离心机(D-78532Tuttlingen,Hettich)
恒温振荡器(CHA-S,国华企业)
调速多用振荡器(HY-4,国华电器有限公司)
洁净工作台(等级:
100级,上海博迅实业有限公司医疗设备)
美的电冰箱(美的集团电冰箱制造有限公司)
3.实验方法
3.1药物组合的正交设计
《伤寒论》中葛根芩连汤组成为:
葛根15g、黄芩9g、黄连9g、甘草6g。
结合正交试验设计可减少样本量的特点,采用正交试验设计拆方分组,葛根作为主要因素并固定不变,以黄芩、黄连、甘草为三因素,以每个因素的“存在(有)”和“剔除(无)”作为二水平,设计为三因素、二水平的正交表进行拆方分组,选用L8(27)的正交表进行试验设计。
表3-1拆方分组正交设计因素水平表
因素
水平
黄芩
黄连
甘草
1
有
有
有
2
无
无
无
表3-2拆方分组正交设计表
组别
1
2
3
4
5
6
7
配伍组合
黄芩
黄连
1×2
甘草
1×4
2×4
1
1
1
1
1
1
1
1
全方
2
1
1
1
2
2
2
2
葛根+黄芩+黄连
3
1
2
2
1
1
2
2
葛根+黄芩+甘草
4
1
2
2
2
2
1
1
葛根+黄芩
5
2
1
2
1
2
1
2
葛根+黄连+甘草
6
2
1
2
2
1
2
1
葛根+黄连
7
2
2
1
1
2
2
1
葛根+甘草
8
2
2
1
2
1
1
2
葛根
注:
本文所有试验均按照表3-2排列顺序进行研究。
3.2汤药制备
《伤寒论》中煎煮方法:
“以水九升,先煮麻黄,减二升,去上沫,内诸药,煮取二升半,去滓……”。
结合现代研究及煮药习惯,设定以下煎煮方法:
精确称取葛根15g,黄芩9g,黄连9g,甘草6g,依照《伤寒论》古方,加水50ml将药材浸泡15min,先煎葛根20min,再和余药共煎两次,每次30min,两次总加水量为450ml,混合两次药液,8层纱布过滤去渣(其余配伍组合均参照此法制备)合并两次煎液,蒸发浓缩至18mL,离心20min(3000r/min),上清液过滤,得供试品溶液。
3.3痢疾动物模型制作
3.3.1细菌制备常规培养培养痢疾志贺菌,平皿稀释法计数,细菌菌液保存于4℃冰箱中备用。
临用前取保存细菌菌液,用营养肉汤稀释成1.6×109cfu/mL,进行动物接种实验。
3.3.2实验小鼠模型选取雌雄各半、健康小鼠8只,进行人为腹腔注射痢疾志贺菌,达到细菌性感染目的,观察腹泻情况,以出现明显腹泻及发热症伴大便为模型构建成功。
3.4分组造模实验
取急性细菌性感染造模成功的小白鼠,分别禁食不禁水12h后,按正交试验设计方案,分别灌服已制备的葛根芩连汤各配伍组合水煎液及生理盐水3.8mL·kg·b.w.,1次/d,连续给药7d,扣于大鼠代谢笼上的烧杯下,代谢笼里放置102中速定性滤纸,连续观察6h,每小时换一次滤纸。
共重复10次。
3.5实验结果处理
参照周干南的方法[8],定期观察总便数、稀便数和稀便级,并计算腹泻指数(DI)。
稀便级的确定:
粪便污迹直径<1cm为1,1-1.9cm为2,2-3cm为3,>3cm为4。
腹泻指数为稀便率与稀便级的乘积。
3.6统计方法
有重复的两个水平正交设计方差分析。
4.实验结果
4.1动物模型的建立及表现
造模后的小白鼠表现食欲不振,大多数小鼠出现频繁的粘液稀水便,肛周潮湿且沾染粪便,角弓反张,排尿、排粪紊乱。
4.2葛根芩连汤配伍对腹泻小鼠的腹泻指数的影响
表4-1葛根芩连汤对菌疾致泻小鼠的腹泻指数的影响(
±s,n=8)
组号
列号
DI
1
2
3
4
5
6
7
1
1
1
1
1
1
1
1
1.2211±0.2908
2
1
1
1
2
2
2
2
0.3327±0.2303
3
1
2
2
1
1
2
2
1.3119±0.3363
4
1
2
2
2
2
1
1
2.1033±0.4465
5
2
1
2
1
2
1
2
1.4248±0.2547
6
2
1
2
2
1
2
1
0.1500±0.3187
7
2
2
1
1
2
2
1
1.4981±0.2800
8
2
2
1
2
1
1
2
1.9048±0.4767
K1
66.5482
94.9931
101.0366
99.4681
102.8358
103.5757
109.4322
K2
139.7315
111.2866
105.2432
106.8116
103.4439
102.7039
96.8475
R1
-73.1833
-16.2935
-4.2066
-7.3435
-0.6081
0.6718
12.5847
表4-2葛根芩连汤对菌疾致泻小鼠的腹泻指数的影响方差分析表
变异来源
离均差平方和
自由度
均方
F值
P值
黄芩
669.4744
1
669.4744
33.81725
0.0000
黄连
33.18477
1
33.18477
1.676267
0.0005
甘草
6.740874
1
6.740874
0.340503
0.0955
黄芩×黄连
2.211935
1
2.211935
0.111732
0.0000
黄芩×甘草
0.046223
1
0.046223
0.002335
0.8897
黄连×甘草
0.095004
1
0.095004
0.004799
0.4058
误差
19.79683
2
9.89842
总和
731.5501
7
直观分析:
根据R1值,可知对菌疾致泻小鼠的影响中,各单味药的极差的绝对值以黄连、甘草与黄芩最大,葛根最小。
从方差分析来看,以主效应黄连、黄芩及甘草有统计学意义,其中黄连取1水平,黄芩取2水平,甘草取1水平,而葛根则无统计学意义。
从交互作用看,结合表4-2可知,葛根黄连、黄连黄芩、葛根黄连黄芩、葛根甘草、黄连甘草及葛根黄连黄芩甘草有交互作用。
其中葛根能拮抗黄连的作用,增强黄芩的作用;黄芩能拮抗黄连的作用,对甘草则无明显影响。
而甘草则能增强黄连的作用。
由于葛根能拮抗黄连的作用,故取葛根的2水平,即全方最佳组合为葛根2黄连1黄芩2炙甘草1。
直观分析法,从R值可知各单味药中对小鼠DI的影响以黄连与黄芩较大,而葛根与甘草影响较小。
以黄连1水平与黄芩2水平为优。
从方差分析看,对菌疾致泻小鼠DI值中,葛根、黄芩、黄连的影响有统计学意义。
从减少DI值看黄连的1水平、葛根与黄芩的2水平优;交互作用中,结合表4可知,葛根黄芩、黄连黄芩、葛根甘草、黄连黄芩甘草有统计学意义。
其中葛根能增强黄芩的作用,甘草能促进葛根的作用。
黄芩拮抗黄连的作用,甘草与黄连及黄芩均无明显影响,但是在黄连黄芩甘草配伍中,以黄连甘草为优。
从菌疾致泻小鼠的DI值角度看,最佳组合为葛根2黄连1黄芩2甘草1。
5.实验讨论
药配伍理论是中医药理论的精华.开展方剂配伍规律的现代研究是中医药现代化研究的重要组成部分.对于继承和发展中药配伍理论具有重要理论意义。
以化学成分为核心探讨葛根芩连汤的物质基础,从配伍与药理效应间的内在联系,并结合化学成分变化来阐明葛根芩连汤的配伍内涵,为指导临床应用及优质、高效新药研创提供依据。
同时也为在更大范围内开展方剂配伍规律现代研究提出可供推广、示范的模式。
葛根芩连汤解表清里,清热止痢,用于协热下痢证。
有相关文献报道,其有显著抗腹泻作用,并广泛应用于临床。
在葛根芩连汤的配伍与抗腹泻药效之间关系的研究中,选用腹泻指数作为观察指标[12]。
自周干南提出腹泻指数既能反映腹泻质的变化,亦能反映腹泻量的变化以来,已被广泛应用于止泻药的药效学研究中。
从方法学上来说,目前对于复方配伍规律的研究方法中,有单纯用药味进行组合进行研究,亦有均匀设计及正交设计,本研究正是采用正交设计方法。
其要点为比较各因素两水平的研究,而不是单纯的比较各药与对照组间的差异。
早在五十年代对葛根、黄连、黄芩、甘草的研究中就知道黄连有明显的抗腹泻作用,其机理与调节cAMP有关。
在葛根芩连汤各配伍组合减少菌疾致泻小鼠的DI中,黄连为其主要作用药物,而黄芩能明显拮抗黄连,有报道称黄连、黄芩配伍后黄连小檗碱的溶出率损失较多,此可能是黄芩能拮抗黄连作用的原因[13]。
而酸性药在煎液制备时亦存在一个溶出率的问题,有报道黄芩与甘草配伍时能影响黄芩的主要有效成分(黄芩苷)的溶出。
这可能是甘草与黄芩配伍时相互表现为拮抗的原因。
我们认为,药物配伍的本质在于药效物质的运动变化。
本实验从配伍与药效的关系出发,对葛根芩连汤配伍与抗腹泻作用之间的变化进行研究,结果表明葛根芩连汤的抗腹泻药效,通过DI值的比较,其最佳组合为黄连甘草。
葛根与黄芩对黄连与甘草的作用,或拮抗、或促进、或无关,两者不完全相同。
我们将结合配伍与化学成分变化之间关系,进一步分析该方的配伍规律。
参考文献
[1]罗佳波,余林中,谭晓梅.方剂配伍规律研究思路[J].中药药理与临床,1999,15(3):
48-50
[2]罗佳波,余林中,魏毅等.以质效为核心的中药现代研究思路[J].中药药理与临床,1998,14(增刊):
Il5
[3]余林中,伍杰勇等.葛根芩连汤配伍对实验性菌痢
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