GrMYC2基因克隆和序列分析426汇总.docx
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GrMYC2基因克隆和序列分析426汇总
编号:
xx级xxxxx号
Xx师范学院
本科生毕业论文
题目滇龙胆GrMYC2基因的克隆与序列分析
学院资源环境学院
专业生物
指导教师xxx
姓名xxx
学号xxxxxxxx
2014年4月20日
目录
摘要2
关键词2
1引言2
2材料与方法3
2.1材料与试剂3
2.2GrMYC基因的PCR扩增3
2.3PCR产物的琼脂糖凝胶电泳4
2.4GrMYC2基因片段的切胶回收4
2.5GrMYC2基因与T载体的连接4
2.6pMD19-GrMYC2质粒转化大肠杆菌感受态细胞5
2.7挑菌及质粒提取5
2.8酶切检测6
2.9测序与序列分析6
3结果与分析7
3.1滇龙胆叶片GrMYC2基因的扩增7
3.2GrMYC2基因的胶回收7
3.3pMD19-GrMYC2质粒提取与检测7
3.4pMD19-GrMYC2质粒的酶切检测8
3.5测序结果分析8
3.6GrMYC2基因的生物信息学分析10
4讨论12
5参考文献12
致谢14
滇龙胆GrMYC2基因的克隆与序列分析
生物科学姓名2010021243
(云南xxxx师范学院资源环境学院xx系)
指导教师:
xxx
摘要:
在拟南芥和长春花中,茉莉酸甲酯通过MYC2蛋白调控萜类的合成。
药用植物滇龙胆中的MYC2蛋白还未见报道。
以滇龙胆幼叶cDNA为模板,采用PCR技术成功扩增到GrMYC2基因,胶回收后,进行TA克隆,酶切检测正确后,进行DNA测序。
序列拼接后,进行生物信息学分析。
本研究将为滇龙胆GrMYC2基因功能研究奠定基础。
关键词:
滇龙胆;GrMYC2基因;基因克隆;序列分析
CloningandsequenceanalysisofGrMYC2geneinGentianarigescens
ChenmicaleducationPiChenkui2010021243
(CollegeofResourcesandEnvironment,YuxiNormalUniversity,Yuxi653100)
Instructor:
LiCaixia
Abstract:
ThesynthesisofterpenoidsareregulatedbymethyljasmonateviaMYC2proteininArabidopsisthalianaandCatharanthusroseus.TheMYC2proteinofMedicinalplantsGentianarigescenshasnotbeenreported.AGrMYC2genewasamplifiedbyPCRusingthecDNAtemplateofyoungleaves.TAcloningwasperformedafterrecycling,andthegenewassequencedafterthedigestiontestbyrestrictionenzymes.BioinformaticsanalysisofGrMYC2genewasdoneaftersplicing.ThisstudywilllayafoundationfortheresearchofgenefunctionofGrMYC2inGentianarigescens.
Keywords:
Gentianarigescens;GrMYC2gene;Genecloning;Sequenceanalysis
1引言
滇龙胆(Gentianarigescens)为龙胆科(Gentianaceae)龙胆属(GetinanaL.)多年生草本植物,别名坚龙胆、苦胆、炮仗花、兰花根、青鱼胆等[1,2]。
主要分布于中国大陆的四川、贵州、湖南、广西等地,是中国的特有植物,也是云南的药材。
滇龙胆是提取龙胆苦苷的主要野生药用原料之一,有很高的药用价值,具有清热解毒,消炎降压、保肝、健胃、利胆等功效。
野生的滇龙胆自然生长能力较低,加上人们过度挖采,该物种以陷入濒危境地[2]。
研究发现植物激素茉莉酸及其衍生物甲基茉莉酸是植物在生物或非生物胁迫下抵御逆环境的一个重要信号分子[1,3],虽然目前茉莉酸类植物的激素的直接受体还没有发现,但是其细胞信号转导过程中的上游调节蛋白和应答转录因子效应基因都已有深入研究。
MYC2就是属于植物茉莉酸类激素响应途径中的核心转录因子[3,4]。
因此对滇龙胆MYC2基因克隆与序列分析有重要的理论价值。
MYC2是一类转录因子,广泛存在于动植物中,其中MYC2是研究最为深入的一个[3,4],本文以栽培种滇龙胆植株叶片为材料,通过PCR(聚合酶链式反应)技术扩增目的基因MYC2,对基因序列进行分析[4],以期为MYC2在滇龙胆代谢调控方面的研究提供参考。
2材料与方法
2.1材料与试剂
滇龙胆叶片cDNA和GrMYC2引物由分子生物学实验室张晓东老师提供。
大肠杆菌感受态Trans5α购买于北京全氏金公司,TA克隆载体pMD19T、dNTP(2.5mM)、限制性内切酶SalI和XhoI均购自于日本Takara公司,TaqplusDNApolymerase、10×Taqplusbuffer、IPTG、X-Gal、氨苄青霉素、DNA分子量标准MarkerⅢ、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒均购自于北京天根公司。
其余试剂均为国产分析纯级试剂。
引物由上海捷瑞生物有限公司合成,DNA测序由上海生工生物工程有限公司完成。
引物GrMYC2Sal-F:
GTCGACATGGTTGATGGAATGACGGA,GrMYC2XhoI-R:
CTCGAGTCATCGATTTTCAACAATTCTAGATG。
2.2GrMYC基因的PCR扩增
以滇龙胆叶片cDNA为模板,采用TaqplusDNApolymerase进行GrMYC2基因的PCR扩增,具体PCR反应体系如下:
组分
体积
模板:
(cDNA)
1μL
引物5′(10μL)
1μL
引物3′(10μL)
1μL
dNTP(2.5mM)
1.6μL
10×Taqplusbuffer
2μL
TaqplusDNApolymerase
0.3μL
ddH2O
13.1μL
总
20μL
PCR程序设置为:
94℃3min{94℃30s50℃30s72℃2min10s}×3072℃7min4℃∞
2.3PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
(1)PCR反应结束后,使用1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行检测,电压为5V/cm,使用凝胶成像系统进行拍照。
(2)1.0%的琼脂糖凝胶的制备:
取0.3g琼脂粉,加入锥形瓶,再加入30ml1×TAE核酸电泳缓冲液,在微波炉中加热使琼脂糖粉熔化;组装制胶器;等冷却至约60℃,加入3μl溴化乙锭(EB),摇匀,倒入制胶器中。
2.4GrMYC2基因片段的切胶回收
(1)使用手术刀片,在紫外下切下含有目的片段的凝胶;
(2)使用胶回收试剂盒进行目的片段的回收。
(3)使用1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行检测回收片段的浓度及大小。
2.5GrMYC2基因与T载体的连接
(1)将回收到的目的基因,进行TA克隆的连接,连接体系如下:
组分
体积
目的片段DNA
2.5μL
pMD19-T载体
0.5μL
LigationSolutionI
3μL
Total
6μL
(2)置于16℃下金属浴,连接24h。
2.6pMD19-GrMYC2质粒转化大肠杆菌感受态细胞
(1)从-80℃中取出大肠杆菌感受态细胞置于冰上,等感受态融化后,取50μL感受态细胞于6μL的连接混合液中。
(2)用手轻轻混匀,冰上放置20min。
(3)42℃热击45s。
(4)冰上放置3-5min。
(5)加入500μL的SOC液体培养基。
(6)封口膜封口,置于37℃、250rpm摇菌1h。
(7)室温8000rpm离心1min集菌。
(8)弃上清至100μl,用移液枪头悬菌,涂布于带有Amp+IPTG+X-Gal的LB固体平板。
(9)37℃培养12-16h。
2.7挑菌及质粒提取
(1)在超净台中,使用无菌牙签,分别从平板上挑取12个白斑,接种于装有氨苄青霉素Amp的LB培养基中。
(2)37℃、250rpm摇菌12h后,用于质粒提取。
(3)分别取2mL菌液于2mL离心管中,常温10000rpm离心1min。
(4)弃上清,倒扣在卫生纸上。
(5)加SolutionⅠ200μL,震荡悬菌。
(6)加SolutionⅡ400μL,上下颠倒5-6次混匀,看到菌体变清,有拉丝现象。
(7)加SolutionⅢ300μL,上下颠倒5-6次混匀,出现白色沉淀,加10μL氯仿,颠倒混匀。
(8)常温13000rpm离心10min。
(9)取上清于1.5mL离心管中,加入600μl异丙醇,混匀,-20℃静置10min,4℃、13000rpm离心20min。
(10)弃上清,加入1mL75%乙醇洗涤除盐,4℃、12000r离心5min。
(11)弃上清,倒置于卫生纸,离心,用移液枪去除乙醇,烘干。
(12)加入带有RNaseA的1×TE(pH8.0)20μL,溶解沉淀,37℃反应30min。
(13)使用1%琼脂糖凝胶电泳检测。
2.8酶切检测
根据对照质粒,选择大小正确的质粒分别进行单酶切、双酶切。
(1)单酶切体系
10×QuickcutGreenBuffer
5μL
质粒DNA
2μL
QuickcutXhoI
1μL
ddH2O
42μL
总
50μL
(2)双酶切体系
10×QuickcutGreenBuffer
5μL
质粒DNA
2μL
QuickcutSalI
1μL
QuickcutXhoI
1μL
ddH2O
41μL
总
50μL
(3)对照体系
10×QuickcutGreenBuffer
5μL
质粒DNA
2μL
ddH2O
43μL
总
50μL
轻轻混匀后瞬时离心,37℃反应12h后,使用1%琼脂糖凝胶电泳检测。
2.9测序与序列分析
根据DNA分子量标准,判断酶切大小正确的质粒,送上海生工进行测序。
使用DNAMAN7进行序列比对分析,判断所克隆基因是否正确。
使用ClustalX2进行多序列比对,使用MEGA6中内置的NJ法进行系统发育树的构建,参数为Bootstrap=1000。
3结果与分析
3.1滇龙胆叶片GrMYC2基因的扩增
以滇龙胆叶片cDNA为模板,使用基因特异性引物进行扩增,在2000bp上方有一条亮带(图1),与预期的2052bp相吻合。
图1GrMYC2基因的PCR扩增结果。
MIII为DNA分子量标准,GrMYC2为目的条带。
3.2GrMYC2基因的胶回收
使用胶回收试剂盒,对切下的目的片段进行回收,电泳检测结果表明已经回收到目的片段(图2)。
图2GrMYC2基因片段的胶回收结果。
MIII为DNA分子量标准,GrMYC2为目的条带。
3.3pMD19-GrMYC2质粒提取与检测
使用碱裂解法,对挑取的12个克隆的菌液进行质粒提取,电泳结果如图3。
根据大小可以判断,1-4、10号为大小正确的质粒。
选择2、3、4和10号进行酶切。
图3pMD19-GrMYC2质粒的电泳结果。
MIII为DNA分子量标准,CK为对照质粒。
3.4pMD19-GrMYC2质粒的酶切检测
分别使用SalI+XhoI、XhoI对所选质粒进行酶切,以未加酶的质粒作为对照,10好结果的电泳结果如图4(其它结果未展示)。
双切能切出目的基因片段,单切产物长度为双切两片段长度之和,表明所选克隆酶切全部正确。
图4pMD19-GrMYC2质粒的酶切结果。
MIII为DNA分子量标准,SX和X分别为双切和单切的结果,CK为对照质粒。
3.5测序结果分析
测序后,进行序列拼接,结果如下:
>GrMYC2nucleotides
ATGGTTGATGGAATGACGGATTACCGGAAAATGAATATATGGCCAACAACCGGGCTTTCTGATGACAACAGCTCGATGATGGATTCCTTATTCATGAACTCGACGGATCCCAACTCTTCGTGGCCTCCATTAATAACCATAAACAACCCTCATTTATCCTCCTCGGCTTCTTGCACTACAGATTCTCCTGCCAAATCCATGGAGACTTCTTTTTTCAACGAGGAAACACTTCAACATCGACTTTTAGCTCTAATTGACGGAGCTCGTGAAAGTTGGACTTATGCTATATTCTGGCAGACCTCGCCGGTTGACTTTGTTGGACCCACCATGTTGACCTGGGGTGATGGCTATTACAAAGGGGAAGAAGATAAAGGAAAGCGCAAGAAAGCATCTTCAGCCACTTCAATAGCTGAGCAGGAACACCGGAAAAGGATTCTCCGGGAGCTCAATTCATTGATTGCTGGCACACAGGGGTCCGGCGACGACGCGGTTGATGAAGAGGTAACAGACACTGAATGGTTTTTTCTCATCTCAATGACTCAAACTTTCGTCAACGGAAGTGGGCTTCCCGGTCAGGCGTTGTATAGTTCGAGCCCTGTTTGGGTCACCGGCGGTGAGAGGCTAACAAGCTCACCCTGCGAACGGGCACGTCAGGCTCAAGGATATGGGCTTCAGACTATGGTTTGTATTCCATCGGCAAACGGCGTTGTCGAACTGGGTTCCACGGATTTGATTTTCCAGAACTCTGATCTGATGAATAAGGTTAGAGTCCTGTTCAATTTTAACAACGCTGAAGTTCCGGGTTCGGGTTTGGGCGCTGGAGCCTTCCATTTTCAGCCCGAAAACGATCCCTCAGCACTTTGGCTTACTGATCCTTCAAATTCAGCACCTGTAACTAAGGAAAATGTTACCTCTAATGCAAACTGTGTTCTAGAGAATTCAATACCTTTTGGGAATAATAACAAACAGGTTGTGTTCGGAAATGGTAATAATTTCAGTTCTAGTACCTTGACCGAAAATCCCGAAACCATCAGTGTTCACCGTCAAGATTCATCTCAGAAATCATTTTTCACAAGGGAATTGAATTTTTCTGGATATGAAGGAAGTGATGCTAGAAATGGGAAATGTAAGCCAGAATCCGGTGAAATTCTAAGTTTTGGTGGTCATAAACAGAGTGTTTCCGGTGGAAATGAGAATTTGTTTTCAGGACAATCTCAATTCGGGAATGAAGAAGAGAATAACAAGACTAAAAAGAGGTCGCCTGTATCAAGGGGTAGCAAGGACGAGGAGATGCTTTCGTTTAATTCAACTATGGTTTTACAAAACTCAGGCGTGGGGAAGTCCAACGGCGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGTGACTCGGATCATTCAGATCTTGAAGCCTCGGTTGCGAAGGAGGCGGAGAGTAGTCGAGTGGTGGACCCCGAGAAACGGCCTAGAAAACGAGGAAGAAAGCCTGCAAATGGAAGGGAAGAGCCTTTAAATCACGTGGAGGCCGAGAGACAGCGAAGGGAGAAGTTAAATCAAAGATTTTATGCTCTAAGAGCTGTTGTTCCAAACGTGTCTAAAATGGACAAAGCTTCGCTCCTCGGAGATGCCATTTCTTACATTAACGAGTTGAAGTCCAAGGTTCAAAACATCGAGACCGAAAAACAAGATATGAAGAACCAGATGGATTCTTTAAAGAAGGAAATATTAGTAGCTAATAAGGATTCGCGACATTTGTCGCCATTAGAACAAGAACTCAAGGCGGTATCATCTAGTCATCATCAAACAAGTAGTAAAATGGATATGGATCTTGACGTAAAGATCATCGGATGGGAGGCGATGATTCGAGTACAATCAAGTAAAAACAACCATCCAGCAGCAATAGTAATGGCTGCCCTTAAAGATCTTGATCTTGAATTGCTTCACGCCAGTGTTTCCGTTGTGAATGAGGTGATGATCCAGCAAAACACAGTGAGAATGGGCAACCGGTTTTACACGCAGGAGCAACTTAGGATTGCTTTGACATCTAGAATTGTTGAAAATCGATGA
>GrMYC2protein
MVDGMTDYRKMNIWPTTGLSDDNSSMMDSLFMNSTDPNSSWPPLITINNPHLSSSASCTTDSPAKSMETSFFNEETLQHRLLALIDGARESWTYAIFWQTSPVDFVGPTMLTWGDGYYKGEEDKGKRKKASSATSIAEQEHRKRILRELNSLIAGTQGSGDDAVDEEVTDTEWFFLISMTQTFVNGSGLPGQALYSSSPVWVTGGERLTSSPCERARQAQGYGLQTMVCIPSANGVVELGSTDLIFQNSDLMNKVRVLFNFNNAEVPGSGLGAGAFHFQPENDPSALWLTDPSNSAPVTKENVTSNANCVLENSIPFGNNNKQVVFGNGNNFSSSTLTENPETISVHRQDSSQKSFFTRELNFSGYEGSDARNGKCKPESGEILSFGGHKQSVSGGNENLFSGQSQFGNEEENNKTKKRSPVSRGSKDEEMLSFNSTMVLQNSGVGKSNGGGGGGGGDSDHSDLEASVAKEAESSRVVDPEKRPRKRGRKPANGREEPLNHVEAERQRREKLNQRFYALRAVVPNVSKMDKASLLGDAISYINELKSKVQNIETEKQDMKNQMDSLKKEILVANKDSRHLSPLEQELKAVSSSHHQTSSKMDMDLDVKIIGWEAMIRVQSSKNNHPAAIVMAALKDLDLELLHASVSVVNEVMIQQNTVRMGNRFYTQEQLRIALTSRIVENR*
GrMYC2基因全长2052bp,这与滇龙胆转录组测序结果一致,可以进行下一步的研究。
3.6GrMYC2基因的生物信息学分析
GrMYC2基因编码683个氨基酸,DNAMAN预测结果为该蛋白分子量为75.16kDa,等电点为5.58。
其亲水性特征如图5,表明该蛋白为两性蛋白,既含有亲水基团,又含有疏水基团。
图5GrMYC2蛋白的亲水性分析结果。
使用NCBIBLASTn,对GrMYC2基因比对结果如下:
Description
Maxscore
Totalscore
Querycover
Evalue
Ident
Accession
CatharanthusroseusMYC2(myc2)mRNA,completecds
446
446
48%
5e-121
75%
AF283507.2
这表明所克隆的GrMYC2基因与长春花中的CrMYC2基因相似性较高,可能具有CrMYC2基因的功能。
Description
Maxscore
Totalscore
Querycover
Evalue
Identity
Accession
MYC2[Catharanthusroseus]
890
890
99%
0.0
70%
AAQ14332.1
MYC1btranscriptionfactor[Nicotianatabacum]>gb|ADU60100.1|MYC2atranscriptionfactor[Nicotianatabacum]
813
813
99%
0.0
63%
ADH04268.1
MYC1atranscriptionfactor[Nicotianatabacum]>gb|ADU60101.1|MYC2btranscriptionfactor[Nicotianatabacum]>gb|ADU60102.1|MYC2ctranscriptionfactor[Nicotianatabacum]
809
809
99%
0.0
62%
ADH04267.1
PREDICTED:
transcriptionfactorMYC2-like[Vitisvinifera]
800
800
99%
0.0
62%
XP_002280253.1
transcriptionfactorMYC2-likeprotein[Nicotianaattenuata]
792
792
98%
0.0
62%
AGL98101.1
transcriptionfactorMYC2[Nicotianaattenuata]
786
786
99%
0.0
63%
AGL98100.1
PREDICTED:
LOWQUALITYPROTEIN:
transcriptionfactorMYC2[Solanumlycopersicum]
787
787
99%
0.0
61%
XP_004245895.1
MYC2btranscriptionfactor[Nicotianatabacum]
783
783
99%
0.0
62%
ADH04270.1
MYCtranscriptionfactor2[Solanumlycopersicum]
783
783
99%
0.0
61%
AGZ94899.1
MYC2atranscriptionfactor[Nicotianatabacum]
778
778
99%
0.0
62%
ADH04269.1
这表明所克隆的GrMYC2基因与长春花中的CrMYC2基因相似性较高,可能具有CrMYC2基因的功能。
对GrMYC2蛋白进行系统发育分析,结果表明其与长
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