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仪器分析
第二章光谱分析法
1、物质分子内部三种运动形式
(1)电子相对于原子核的运动;
(2)原子核在其平衡位置附近的相对振动;
(3)分子本身绕其重心的转动。
分子具有三种不同能级:
电子能级、振动能级和转动能级
紫外可见吸收光谱:
分子价电子能级跃迁。
波长范围:
100-800nm。
(1)远紫外光区:
100-200nm
(2)近紫外光区:
200-400nm
(3)可见光区:
400-800nm
紫外吸收光谱的应用
applicationofUltravioletspectrometry
可用于结构鉴定和定量分析。
电子跃迁的同时,伴随着振动转动能级的跃迁;带状光谱。
2、常用术语
生色团:
能吸收UV-VIS的原子团或结构系统。
最有用的紫外-可见光谱是由π→π*和n→π*跃迁产生的,这两种跃迁均要求有机物分子中含有不饱和基团。
这类含有π键的不饱和基团称为生色团。
简单的生色团由双键或叁键体系组成。
助色团:
本身不吸收,但使生色团的吸收峰向长波方向移动,并增加其吸收强度。
红移与蓝移
λmax向长波方向移动称为红移,向短波方向移动称为蓝移(或紫移)。
吸收强度即摩尔吸光系数ε增大或减小的现象分别称为增色效应或减色效应。
3、有机化合物的紫外可见光谱
有机化合物的紫外—可见吸收光谱是三种电子跃迁的结果:
σ电子、π电子、n电子。
当外层电子吸收紫外或可见辐射后,就从基态向激发态(反键轨道)跃迁。
主要有四种跃迁所需能量ΔΕ大小顺序为:
n→π*<π→π* 4、光的吸收定律 朗伯-比尔定律A=ebc(A=abc) ①同一种物质对不同波长光的吸光度不同。 吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长λmax ②不同浓度的同一种物质,其吸收曲线形状相似λmax不变。 而对于不同物质,它们的吸收曲线形状和λmax则不同。 ③吸收曲线可以提供物质的结构信息,并作为物质定性分析的依据之一。 ④不同浓度的同一种物质,在某一定波长下吸光度A有差异,在λmax处吸光度A的差异最大。 此特性可作作为物质定量分析的依据。 在λmax处吸光度随浓度变化的幅度最大,所以测定最灵敏。 吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。 ★ 5、分光光度计基本结构 紫外-可见分光光度计的基本结构是由五个部分组成: 光源、单色器、吸收池、检测器和信号指示系统。 5.1光源 对光源基本要求: 足够光强、稳定、连续辐射且强度随波长变化小。 分光光度计中常用的光源有热辐射光源和气体放电光源两类。 A、白炽光源: 钨灯、碘钨灯。 波长: 320-2500nm B、气体放电光源: 氢灯、氘灯。 波长: 200-350nm 5.2单色器 单色器包括: 入射狭缝、准光器、色散元件、聚焦元件和出射狭缝。 其核心部分是色散元件,起分光的作用。 色散元件: 棱镜或光栅,使不同波长的光以不同角度传播。 棱镜有玻璃和石英两种材料,玻璃棱镜只能用于可见光域内;石英棱镜可使用的波长范围较宽,可用于紫外、可见和近红外三个光域。 5.3吸收池 比色皿,玻璃(可见)石英(可见、紫外) 6、定量测定方法 ★定量分析的依据A=εbc A: 吸光度, ε: 摩尔吸光系数,指一定波长时,溶液的浓度为1mol/L,光程为1cm时的吸光度值。 b: 吸收池的厚度, c: 待测物质的浓度 ε值小时,须使被测物质与显色剂生成颜色较深的有色物质而进行测定,显色剂多为络合剂。 7、紫外-可见分光光度法的优缺点 可见-紫外分光光度法具有操作简单、快速、重现性好、样品用量少等优点,但光谱的特征性不强,且大多数简单官能团在近紫外区只有微弱吸收或无吸收,因此应用有一定的局限性。 第三章红外吸收光谱法 红外光谱又称分子振动-转动光谱,属分子吸收光谱,样品收到频率连续变化的红外光照射时,分子吸收其中一些频率的辐射,使振动-转动能级从基态跃迁到激发态,相应于这些区域的透射光强减弱,记录百分透过率T%对波数或波长的曲线,即红外光谱。 研究在振动中伴有偶极距变化的化合物(无偶极距变化的为拉曼光谱) 波长范围约为0.75~1000µm 近红外(near-infrared)0.75-2.5µm 中红外(middle-infrared)2.5-25µm(常用为2.5-15µm) 远红外(far-infrared)25-1000µm 1、红外吸收光谱的特点 2、红外光谱与紫外可见光谱的区别 3、红外光谱的表示方法 4、分子的振动类型 4.1.双原子分子的振动 简谐振动近似处理)谐振子振动和非谐振子振动 4.2.多原子分子的振动(简正振动) 伸缩振动vs: 原子沿着价键方向来回运动,键长变,键角不变。 5、红外吸收区域划分 官能团区: 4000-1300cm-1伸缩振动,区内的峰是由伸缩振动产生的吸收带,比较稀疏,容易辨认,常用于鉴定官能团。 指纹区: 1300-600cm-1单键伸缩变形振动,,除单键的伸缩振动外,还有因变形振动产生的谱带。 这种振动与整个分子的结构有关。 当分子结构稍有不同时,该区的吸收就有细微的差异,并显示出分子特征 未知物结构不饱和度的计算: W=1+N4+(N3–N1)/2即: 环+双键数N1、N3、N4分别为一、三、四价原子数 官能团区可分为三个区域: (1)4000~2500cm-1X-H伸缩振动区,X可以是O、H、C或S等原子。 (2)2500~1900为叁键和累积双键区 主要包括-C≡C、-C≡N等叁键的伸缩振动,以及-C=C=C、-C=C=O等累积双键的不对称性伸缩振动。 (3)1900~1200cm-1为双键伸缩振动区 该区域主要包括三种伸缩振动: ①C=O伸缩振动、②C=C伸缩振动、③苯的衍生物的泛频谱带。 指纹区: (1)1800(1300)~900cm-1区域是C-O、C-N、C-F、C-P、C-S、P-O、Si-O等单键的伸缩振动和C=S、S=O、P=O等双键的伸缩振动吸收。 (2)900~650cm-1区域的某些吸收峰可用来确认化合物的顺反构型。 6、吸收谱带的强度 极性较强的基团(如C=0,C-X等)振动,吸收强度较大;极性较弱的基团(如C=C、C-C、N=N等)振动,吸收较弱。 红外光谱的吸收强度一般定性地用很强(vs)、强(s)、中(m)、弱(w)和很弱(vw)等表示。 按摩尔吸光系数e的大小划分吸收峰的强弱等级,具体如下: εe>100非常强峰(vs) 20<εe<100强峰(s) 10 1 7、红外光谱法的特点 1紫外、可见吸收光谱常用于研究不饱和有机物,特别是具有共轭体系的有机化合物, 2红外光谱法主要研究在振动中伴随有偶极矩变化的化合物(没有偶极矩变化的振动在拉曼光谱中出现)。 因此,除了单原子和同核分子如Ne、He、O2、H2等之外,几乎所有的有机化合物在红外光谱区均有吸收。 3红外光谱分析特征性强,气体、液体、固体样品都可测定,并具有用量少,分析速度快,不破坏样品的特点。 因此,红外光谱法不仅与其它许多分析方法一样,能进行定性和定量分析,而且该法是鉴定化合物和测定分子结构的最有用方法之一。 8、红外光谱法IR的应用 红外光谱法广泛用于有机化合物的定性鉴定和结构分析 8.1.已知有机化合物的鉴定 将试样的谱图与标准的谱图进行对照,或者与文献上的谱图进行对照。 如果两张谱图各吸收峰的位置和形状完全相同,峰的相对强度一样,就可以认为样品是该种标准物。 8.2.未知物结构鉴定 如果未知物不是新化合物,可以通过两种方式利用标准谱图进行查对: (1)查阅标准谱图的谱带索引,与寻找试样光谱吸收带相同的标准谱图; (2)进行光谱解析,判断试样的可能结构,然后在由化学分类索引查找标准谱图对照核实。 当WΩ=1时,可能有一个双键或脂环; 当Ω=2时,可能有两个双键和脂环,也可能有一个叁键; 当ΩW=4时,可能有一个苯环等。 但是,二价原子如S、O等不参加计算。 (1)萨特勒(Sadtler)红外标准光谱图集 (2)Aldrich红外谱图库 (3)SigmaFourier红外光谱图库 (4)DMS穿孔卡片 (5)“API”红外光谱数据。 8.3.定量分析 红外光谱吸收谱带的吸收强度与分子组成或化学基团的含量有关,可通过对特征吸收谱带强度的测量来进行定量分析和纯度鉴定。 9、红外光谱应用实验技术 A.样品的制备B.注意防潮 气体气槽在红外灯下准备样品 液体液膜(选择溶剂) 固体压片(KBr) 第四章色谱分析法 色谱法是一种分离技术,试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配过程。 其中的一相固定不动,称为固定相;另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体(气体或液体),称为流动相。 1、色谱法分类 (1)气相色谱: 流动相为气体(称为载气)。 按分离柱不同可分为: 填充柱色谱和毛细管柱色谱; 按固定相的不同又分为: 气固色谱和气液色谱。 (2)液相色谱: 流动相为液体(也称为淋洗液)。 按固定相的不同分为: 液固色谱和液液色谱。 离子色谱: 液相色谱的一种,以特制的离子交换树脂为固定相,不同pH值的水溶液为流动相。 (3)其他色谱方法 薄层色谱和纸色谱: 比较简单的色谱方法 凝胶色谱法: 测聚合物分子量分布。 超临界色谱: CO2流动相。 高效毛细管电泳: 九十年代快速发展、特别适合生物试样分析分离的高效分析仪器。 2、色谱法特点 (1)分离效率高: : : 复杂混合物,有机同系物、异构体。 手性异构体。 (2)灵敏度高: : : 可以检测出μg.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。 (3)分析速度快: : : 一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。 (4)应用范围广: : : 气相色谱: 沸点低于400℃的各种有机或无机试样分析。 液相色谱: 高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。 不足之处: : : 被分离组分的定性较为困难。 3、色谱分离过程 气固(液固)色谱的固定相: 多孔性的固体吸附剂颗粒。 固体吸附剂对试样中各组分的吸附能力的不同。 气液(液液)色谱的固定相: 由担体和固定液所组成。 固定液对试样中各组分的溶解能力的不同。 气固色谱的分离机理: 吸附与脱附的不断重复过程。 气液色谱的分离机理: 气液(液液)两相间的反复多次分配过程。 4、色谱流出曲线与术语 4.1基线 无试样通过检测器时,检测到的信号。 4.2保留值 时间表示的保留值: 保留时间(tR)、死时间(tM)、调整保留时间(tR') 体积表示的保留值: 保留体积(VR)、死体积(VM)、调整保留体积(VR') 相对保留值r21: r21=t´R2/t´R1=V´R2/V´R1 4.3区域宽度 用来衡量色谱峰宽度的参数,有三种表示方法: (1)标准偏差(): 即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。 (2)半峰宽(Y1/2): 色谱峰高一半处的宽度Y1/2=2.354 (3)峰底宽(Wb): Wb=4 5、色谱理论 5.1塔板理论—柱分离效能指标 5.2速率理论—影响柱效的因素 速率方程(也称范.弟姆特方程式) H=A+B/u+C·u H: 理论塔板高度, u: 载气的线速度(cm/s) A─涡流扩散项: 固定相颗粒越小dp↓,填充的越均匀,A↓,H↓,柱效n↑。 B/u—分子扩散项: 与流速有关,流速↓,滞留时间↑,扩散↑;M载气↑,B值↓。 C·u—传质阻力项: 减小担体粒度,选择小分子量的气体作载气,可降低传质阻力。 载气流速与柱效——最佳流速 载气流速高时: 传质阻力项是影响柱效的主要因素,流速↑,柱效↓。 载气流速低时: 分子扩散项成为影响柱效的主要因素,流速↑,柱效↑。 6、分离度 ①柱效较高,△K(分配系数)较大,完全分离; ②△K不很大,柱效较高,峰较窄,基本上完全分离; ③柱效较低,,△K较大,但分离的不好; ④△K小,柱效低,分离效果更差。 R=0.8: 两峰的分离程度可达89%; R=1: 分离程度98%; R=1.5: 达99.7%(相邻两峰完全分离的标准)。 (1)分离度与柱效 分离度与柱效的平方根成正比,r21一定时,增加柱效,可提高分离度,但组分保留时间增加且峰扩展,分析时间长。 (2)分离度与r21 增大r21是提高分离度的最有效方法,计算可知,在相同分离度下,当r21增加一倍,需要的n有效减小10000倍。 增大r21的最有效方法是选择合适的固定液。 7、薄层色谱法 7.1样品的预处理 制备样品供试液所用的溶剂要求: 溶解度范围不宜太宽;粘度不宜太大;沸点不宜太高或太低。 常用甲醇或乙醇。 样品预处理: 溶剂提取、蒸馏、升华、小型色谱柱、离子交换等。 7.2薄层板的制备(制板) 软板: 不含黏合剂,疏松,操作不便; 硬板: 含黏合剂。 铺好的薄层板先晾干,在105~110℃活化0.5~1.0h。 7.3点样 薄层板: 20cm×20cm 滤纸长度: 20~25cm,宽度以样品个数决定。 溶液浓度: 0.01~1% 原点距离底边: 1cm 原点扩散直径: 2~3mm,<5mm 各点间距离: 1~2cm 点样设备: 毛细管、微量注射器、点样笔、自动点样装置 7.4吸附剂性能 吸附剂颗粒越细,比表面积越大,分离效率越高。 酸性吸附剂分离含酸性基团的化合物;碱性吸附剂分离碱性化合物。 对碱敏感的化合物如酯类,不宜用碱性氧化铝,采用中性氧化铝;氧化铝吸附剂的活度(含水量)影响较大;硅胶G长期存放黏合力降低,不同厂家或不同批次的商品硅胶,重现性较差。 7.5展开 展开前色谱床及层析缸应先用溶剂蒸汽饱和——平衡。 展开方式: 上行展开、下行展开、径向展开、水平展开(溶剂从两边向中间展开) 7.6温度与相对湿度 温差较大的条件下,色谱展开可能会有差异;不同的相对湿度下点样和展开,可能导致薄层色谱差异。 7.7边缘效应 同一化合物点在同一薄层板的中间和边缘,中间的Rf值往往小于两边——边缘效应。 因此要增加色谱缸内溶剂蒸气的饱和度。 采用小的色谱缸; 在缸内壁贴上溶剂浸过的滤纸; 薄层板不接触展开剂时放置一段时间,待溶剂蒸气饱和后再展开。 8、气相色谱仪 8.1载气系统 包括气源、净化干燥管和载气流速控制。 常用的载气有: 氢气、氮气、氦气; 净化干燥管: 去除载气中的水、有机物等杂质(依次通过分子筛、活性炭等); 载气流速控制: 压力表、流量计、针形稳压阀,控制载气流速恒定。 8.2进样装置 进样装置: 进样器+气化室。 气体进样器(六通阀): 推拉式和旋转式两种。 试样首先充满定量管,切入后,载气携带定量管中的试样气体进入分离柱; 液体进样器: 不同规格的专用注射器,填充柱色谱常用10μL;毛细管色谱常用1μL;新型仪器带有全自动液体进样器,清洗、润冲、取样、进样、换样等过程自动完成,一次可放置数十个试样。 气化室: 将液体试样瞬间气化的装置。 无催化作用。 8.3分离系统由柱箱和色谱柱组成。 柱箱: 一般为配备隔热层的不锈钢壳体,内装一恒温风扇和测温热敏元件,由电阻丝加热,电子线路控温。 色谱柱: 由玻璃、石英或不锈钢制成的圆管,管内装有固定相。 分为装满填料的填充柱和空心的开管柱。 8.4检测系统 检测器: 广普型——对所有物质均有响应; 专属型——对特定物质有高灵敏响应; 常用: 热导检测器、氢火焰离子化检测器。 8.5温度控制系统 温度是色谱分离条件的重要选择参数,气化室、分离室、检测器三部分在色谱仪操作时均需控制温度; 气化室: 保证液体试样瞬间气化; 检测器: 保证被分离后的组分通过时不在此冷凝; 分离室: 准确控制分离需要的温度。 当试样复杂时,分离室温度需要按一定程序控制温度变化,各组分在最佳温度下分离 9、气相色谱检测器 浓度型检测器、质量型检测器、广普型检测器、专属型检测器。 9.1响应值(或灵敏度)S: 在一定范围内,信号E与进入检测器的物质质量m呈线性关系: E=SmS=E/m S表示单位质量的物质通过检测器时,产生的响应信号的大小。 S值越大,检测器(也即色谱仪)的灵敏度也就越高。 检测信号通常显示为色谱峰,则响应值也可以由色谱峰面积(A)除以试样质量求得: S=A/m 9.2最低检测限(最小检测量) 灵敏度越高,最低检测限越低 9.3线性度与线性范围 检测器的线性度定义: 检测器响应值的对数值与试样量对数值之间呈比例的状况。 检测器的线性范围定义: 检测器在线性工作时,被测物质的最大浓度(或质量)与最低浓度(或质量)之比。 热导检测器(TCD) 氢火焰离子化检测器(FID) 电子捕获检测器(ECD) 火焰光度检测器(FPD): 化合物中硫、磷 热离子检测器(TID): 氮、磷检测器。 10、气相色谱条件的选择 10.1固定相的选择 气-液色谱,应根据“相似相溶”的原则 ①分离非极性组分时,通常选用非极性固定相。 各组分按沸点顺序出峰,低沸点组分先出峰。 ②分离极性组分时,一般选用极性固定液。 各组分按极性大小顺序流出色谱柱,极性小的先出峰。 ③分离非极性和极性的(或易被极化的)混合物,一般选用极性固定液。 此时,非极性组分先出峰,极性的(或易被极化的)组分后出峰。 ④醇、胺、水等强极性和能形成氢键的化合物的分离,通常选择极性或氢键性的固定液。 ⑤组成复杂、较难分离的试样,通常使用特殊固定液,或混合固定相。 10.2柱长和柱内径的选择 增加柱长对提高分离度有利(分离度R正比于柱长L2),但组分的保留时间tR↑,且柱阻力↑,不便操作。 10.3柱温的确定 首先应使柱温控制在固定液的最高使用温度(超过该温度固定液易流失)和最低使用温度(低于此温度固定液以固体形式存在)范围之内。 柱温升高,分离度下降,色谱峰变窄变高. 柱温↓,分离度↑,分析时间↑。 对于难分离物质对,降低柱温虽然可在一定程度内使分离得到改善,但是不可能使之完全分离,这是由于两组分的相对保留值增大的同时,两组分的峰宽也在增加,当后者的增加速度大于前者时,两峰的交叠更为严重 柱温一般选择在接近或略低于组分平均沸点时的温度。 组分复杂,沸程宽的试样,采用程序升温。 10.4载气种类和流速的选择 载气摩尔质量大,可抑制试样的纵向扩散,提高柱效。 载气流速较大时,传质阻力项起主要作用,采用较小摩尔质量的载气(如H2,He),可减小传质阻力,提高柱效。 热导检测器需要使用热导系数较大的氢气有利于提高检测灵敏度。 在氢焰检测器中,氮气仍是首选目标。 10.5气化温度的选择 气化温度一般较柱温高30~70°C,防止气化温度太高造成试样分解。 10.6毛细管色谱具有以下优点 (1)分离效率高: 比填充柱高10~100倍; (2)分析速度快: 用毛细管色谱分析比用填充柱色谱速度; (3)色谱峰窄、峰形对称。 较多采用程序升温方式; (4)灵敏度高,一般采用氢焰检测器; (5)涡流扩散为零。 11、气相色谱定性定量分析色谱法分离好,定性难 11.1定性鉴定方法 A、利用纯物质定性 利用保留值定性: 通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰,来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中位置。 不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比。 利用加入法定性: 将纯物质加入到试样中,观察各组分色谱峰(峰高)的相对变化。 优点: 简单缺点: 要有纯样,适于已知物,操作条件稳定 B、利用文献保留值定性 相对保留值r21: 相对保留值r21仅与柱温和固定液性质有关。 在色谱手册中都列有各种物质在不同固定液上的保留数据,可以用来进行定性鉴定。 优点: 比绝对法重现性好缺点: 也需要纯样,比绝对法麻烦 C、保留指数定性 又称Kovats指数(Ⅰ),将正构烷烃作为标准,规定其保留指数为分子中碳原子个数乘以100(如正己烷的保留指数为600)。 其它物质的保留指数(IX)是通过选定两个相邻的正构烷烃,其分别具有Z和Z+1个碳原子。 被测物质X的调整保留时间应在相邻两个正构烷烃的调整保留值之间. 优点: 测得Ix值与文献值对照就可定性。 缺点: 1.要有正构烷烃纯样。 2.可供查阅的文献值太少。 3.柱子与柱温要与文献规定相同。 D、双柱定性: 一根极性柱,一根非极性柱。 对于一根柱子上有相同保留值的组分可采用双柱定性。 若二根柱上tR未知与tR已知都吻合,则定性可靠性就增一倍。 11.2定量检测方法 定量校正因子f 为什么要用f? ——不同组分有不同的响应值。 A、归一法 优点: 是相对法,与进样量无关,定量较准确。 缺点: 要求全出峰(样品所有组分都要出峰) 全知峰(有所有组分的标准品) B、外标法(标准曲线法) 优点: 快速简单,只要待测组分出峰且完全分离即可 缺点: 绝对法,进样量、操作条件要不变 无需各组份都被检出、洗脱;需要标样;标样及样品测定的条件要一致;进样体积要准确。 C、外标一点法 用一定浓度i组分的标准溶液对比测定样品溶液中i组分含量的方法。 方法简单,但要求进样量准确及实验条件恒定。 为了降低实验误差,应尽量使配制的标准溶液浓度与样品中i组分的浓度相近,进样体积相等。 D、内标法定量 配制一系列浓度的标样,其中加有内标样。 无需各组份都被检出、洗脱;需要标样,需要内标样;结果与进样体积无关。 对内标物的要求 化学结构与待测组分相似(同系物、异构体); 在样品中不存在; 不与样品中组份发生任何化学反应; 保留值与待测组分接近; 浓度(响应值)与待测组分相当; 其色谱峰与其他色谱峰分离好。 12、高效液相色谱法的特点 特点: 高压、高效、高速 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。 12.1主要部件 (一)高压输液系统 储液瓶高压输液泵梯度洗脱装置 (二)进样系统 通常使用耐高压的六通阀进样装置。 (三)色谱柱 色谱柱性能评价指标: 1.柱效;2.分析速度: <30min;3.峰的对称性: 不对称因子0.8~1.2,拖尾因子T0.95~1.05;4.柱渗透性: 柱压降↓,柱渗透性↑,分离速度↑。 (四)检测器 通用型检测器(总体性质检测器): 灵敏度低,不适于痕量分析,不能用于梯度洗脱,e.g.示差折光检测器、蒸发光散射检测器etc. 专用型检测器(溶质性质检测器): 灵敏度高,受外界影响小,可用于梯度洗脱,选择性响应某些物质,应用受局限,e.g.紫外检测器、荧光检测器、化学发光检测器etc.。 为什么要脱气? 怎么脱气? 流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡。 气泡进入检测器后会在色谱图上出现尖锐的噪音峰。 小气泡慢慢聚集后会变成大气泡,大气泡进入流路或色谱柱中会使流动相的流速变慢或出现流速不稳定,致使基线起伏。 气泡一旦进入色谱柱,排出这些气泡则很费时间。 在荧光检测中,溶解氧还会使荧光淬灭。 溶解气体还可能引起某些样
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