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蒲黄松花粉等花粉类药材及其混伪品的DNA条形码鉴定
蒲黄、松花粉等花粉类药材及其混伪品的DNA条形码鉴定
[摘要]目前市场上花粉类药材品种较多,由于在外观形态均呈粉末状,很难区分,加之市场价格较高等因素,故混用和掺伪的情况时有发生,因此花粉类药材的准确鉴定对公众的用药安全显得尤为重要。
该研究采用DNA条形码技术,对蒲黄、松花粉及其混伪品的基原植物及药材共60份样本进行研究。
通过primerpremier6.0设计出蒲黄ITS2特异性引物PhF-R,其扩增效率高达100%,实验结果表明蒲黄药材的ITS2序列长度为234~249bp,种内K2P平均距离与同属种间K2P平均距离十分接近,但远小于其与混伪品的种间K2P平均距离;松花粉药材的ITS2序列长度均为247bp,ITS2序列种内平均K2P遗传距离远小于其与混伪品种间平均K2P距离。
利用ITS2序列构建的邻接(NJ)树表明蒲黄、松花粉及其混伪品可明显区分,并呈现出良好的单系性。
因此,DNA条形码可对该实验材料准确鉴定,有助于花粉类药材的监管及市场流通。
[关键词]ITS2;蒲黄;松花粉;DNA条形码
花粉为植物的雄性细胞,由于其中蕴含着丰富的营养物质,所以具有很高的营养价值和药用价值[1]。
蒲黄[2]为香蒲科植物水烛香蒲TyphaangustifoliaL.、东方香蒲T.orientalisPresl.或同属植物的干燥花粉,始载于《神农本草经》,其味甘、性平,具有凉血止血、活血化瘀的功效[3-6]。
松花粉[7],即松科植物马尾松PinusmassonianaLamb.、油松P.tabuliformisCarr.或同属数种植物的干燥花粉,始载于《新修本草》,味甘平无毒[8],具有收敛止血、燥湿敛疮的功效。
近年来国内花粉市场异常火爆,其价格连年攀升。
有文献报道[9-13]蒲黄、松花粉、海金沙Lygodiumjaponicum(Thunb.)Sw.及市售的玉米花粉ZeamaysL.存在掺伪的情况,因此对几种易混花粉类药材进行有效鉴定显得至关重要。
陈树山[9]、贾荷丽[10]、陈永林[11]、任燕[13]等曾从性状、理化及显微方面对花粉类药材进行鉴别,但传统的鉴定方法在一定程度上由于药材本身、实验仪器、实验设计等方面的差异而影响对药材的准确鉴定。
基于DNA测序和序列比对的DNA条形码技术是近年来分子生药鉴定的研究热点和方向[14]。
DNA条形码(DNAbarcoding)是利用基因组中一段公认标准的、相对较短的DNA片段来进行物种鉴定的分子诊断新技术。
该技术于2003年由加拿大分类学家PaulHebert首次提出,并受到各国学者的广泛关注。
Paul提出以一段650bp的线粒体基因COI作为动物的通用条形码[15-16]。
在植物方面,陈士林等对6000余份药用植物样本进行DNA条形码序列筛选,提出以ITS2为主,psbA-trnH为辅的药用植物条形码鉴定体系[17-21]。
该体系已在羌活[22]、金银花[23]、冬虫夏草[24]、石斛[25]等贵重药材上得到了验证。
因此本研究选用ITS2序列来鉴定易混淆花粉类药材,为确保药材质量及临床用药安全提供参考。
1材料
本实验所研究的材料共60份,其中19份为基原植物样本,采集于新疆、河北、河南、安徽、广东、广西、云南、北京等地,所有基原植物经中国医学科学院药用植物研究所林余霖研究员鉴定,凭证标本保存于中国中医科学院中药研究所,材料来源见表1;其余41份为药材样本,购于北京、河北、安徽、重庆、黑龙江等地的药市或药店,详细信息见表2。
2方法
2.1DNA的提取对于叶片样本,取样品约25mg,用球磨仪(Sceintz-48,宁波新芝)以50次/s研磨2min,使用植物基因组DNA提取试剂盒(TiangenBiotechCo.,China)提取总DNA;而粉末状药材,取样品约40mg,加700μLDNA裂解液,在56℃水浴的条件下过夜,采用植物基因组DNA提取试剂盒(TiangenBiotechCo.,China)提取总DNA。
2.2蒲黄引物设计利用MEGA5.0对ITS2通用引物扩增出的序列进行分析,定位至蒲黄的“保守区域”,并运用primerpremier6.0设计特异性引物PhF-R。
其序列如下,Ph-F:
5′-CGCGAACCATCGAGTCTTT-3′,Ph-R:
5′-GTTTCTTCTCCTCCGCTTATTT-3′。
2.3PCR扩增和测序对于非香蒲属样本,选取ITS2通用引物S2F:
5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′和S3R:
5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′作为扩增引物。
反应条件为94℃变性5min,经过40个循环(94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸45s),最后72℃延伸10min。
反应体系为2×TaqPCRMasterMix12.5μL,引物2.5μmol?
L-1各1.0μL,DNA模板量约30~60ng,其余用ddH2O补至25μL;而香蒲属样本,选用PhF-R为ITS2扩增引物,退火温度54℃,其他条件同上。
电泳检查PCR扩增情况,进行双向测序。
2.4ITS2序列分析对获得的测序结果使用CodoncodeAlignerV3.7.1校对拼接,删除低质量区,去除引物区。
基于隐马尔可夫模型HMMer注释除去5.8S和28S,从而获得ITS2序列。
运用软件MEGA5.0对所有ITS2序列进行分析比对[26]。
基于K2P模型进行遗传距离的计算、系统聚类树的构建,对于系统树各分支的置信度采用自举检验法bootstrap检验(1000次重复)。
3结果与分析
3.1蒲黄PCR扩增效率本实验中,以蒲黄药材及基原植物共29份样本的总DNA为模板,采用通用引物进行PCR扩增,结果仅有2份样本的DNA扩增成功,且测序正常,扩增效率仅为6.70%。
根据已获得的2条蒲黄ITS2序列,对蒲黄重新设计引物。
采用针对蒲黄已知序列设计的新引物,对之前提取的总DNA进行重新扩增,结果显示29份样本全部扩增成功,其中26份样品测序结果合格,扩增效率高达100%。
3.2市场上购买的药材的鉴定对市场上购买的41份药材样本进行实验,得到的ITS2序列进行BLAST比对后发现:
22份蒲黄药材中有7份样品(KJ474686~92)与GenBank登陆号KF265389的相似度为100%,比对结果为长苞香蒲;有6份样品(YC0518MT10~15)与GenBank登录号KF265390的最高相似度为84%,比对结果为香蒲属植物,暂不能鉴定到种;有6份样品(KJ474656~61)与GenBank登陆号FJ949066,DQ996015的相似度为100%,比对结果为水稻;此外,22份蒲黄药材中有3份样品(YC0518MT16~18)在测序过程中存在套峰的情况。
8份松花粉药材中有5份样品(KJ474648~52)与GenBank登录号GQ434744的相似度为100%,比对结果为马尾松;其余3份样品与GenBank登录号JF829712,JF829701,GQ434747的相似度均为100%,比对结果为松属植物,暂不能鉴定到种。
按照同样的方法,4份海金沙药材的鉴定结果均为海金沙。
7份玉米花粉材料的鉴定结果均为玉米。
3.3松花粉、蒲黄及混伪品的种内、种间变异分析马尾松P.massoniana种内不同来源样品8条ITS2序列长度为247bp,平均GC含量为60.73%,种内K2P距离为0,种内无变异位点,共获得KJ474648型1种单倍型。
油松P.tabuliformis种内不同来源样品3条ITS2序列长度为247bp,GC含量为60.32%,种内K2P距离为0,种内无变异位点,共获得KJ474642型1种单倍型。
松花粉未定种的3份样品(YC0405MT02~04)的ITS2序列长度为247bp,共获得YC0405MT02型1种单倍型。
对3个物种的序列分析发现,仅在74bp处有一变异位点,即马尾松在74bp处的碱基为C,油松和未定种样品的序列在74bp处为T。
油松与马尾松的种间距离为0.004,与混伪品的最小种间距离为0.657;马尾松与混伪品的最小种间距离在0.670。
长苞香蒲T.domingensis种内不同来源样品9条ITS2序列长度为234bp,平均GC含量为78.63%,种内K2P距离为0,种内无变异位点,共获得KJ474686型1种单倍型。
水烛香蒲T.angustifolia种内不同来源样品3条ITS2序列长度为234bp,平均GC含量为79.92%,有2个位点存在变异,即81位点处A-G变异和141位点处T-C变异,共获得3种单倍型。
种内最大K2P距离为0.022,与混伪品的最小种间距离为0.337。
蒲黄未定种的6份样品(YC0518MT10~15)的ITS2序列长度为249bp,共获得YC0518MT10型1种单倍型。
序列比对信息见表3。
海金沙L.japonicum种内不同来源样品7条ITS2序列长度为267bp,共获得5种不同的单倍型,其中KJ474663型3条,KJ474662型1条,KJ474665型1条,KJ474666型1条,KJ474668型1条。
玉米花粉Zeamays种内不同来源样品10条ITS2序列长度为224bp,共获得4种不同的单倍型,其中KJ474669型7条,KJ474671型1条,KJ474674型1条,KJ474678型1条。
水稻Oryzasativa种内不同来源样品6条ITS2序列长度为232bp,共获得KJ474656型1种单倍型。
基于得到的ITS2序列的单倍型,运用邻接法(NJ)构建系统发育树,见图1。
从所构建的系统发育树中可以看出松花粉、蒲黄、海金沙、玉米花粉、水稻各独聚一支,因此,ITS2序列能准确鉴别蒲黄、松花粉等花粉类药材及其混伪品。
4讨论
蒲黄为多年水生草本单子叶植物,国外学者对水生单子叶植物的DNA条形码有比较深入的研究[27]。
在本研究的过程中,笔者发现当采用通用引物(ITS2F-3R)扩增蒲黄药材时,扩增效率仅为6.70%,这有可能是ITS2F-3R在单子叶植物中的通用性不高导致的。
因此笔者以己获得的2条蒲黄序列为研究对象,运用PrimerPremier6.0软件重新设计了一对引物(PhF-R),其扩增效率可以达到100%。
从鉴定效率角度上看,基于ITS2序列构建的NJ树可以将蒲黄与其混伪品明显分开,但香蒲属下种级物种间并没有很好的区分,这可能与香蒲属植物的亲缘关系较近有关。
而从蒲黄药材的角度来看,《中国药典》2010年版规定蒲黄为同属植物花粉均可,所以对于蒲黄鉴定到属级别已可实现其与混伪品的准确鉴定。
对于松花粉而言,由于种内均无变异位点,并且经过序列分析后发现3个物种间仅在74bp处有一变异位点,未定种的样品序列(YC0405MT02~04)与油松、黄山松(JF829701)、台湾松(JF829712)序列相同,暂不能鉴定到种,但从松花粉药材的角度来看,其鉴定到属级别已满足市场的需求。
本研究在实验中发现蒲黄药材的测序结果中存在套峰的情况,这可能是由于所购的药材为多种植物花粉的混合物或者是多拷贝基因的存在所导致的[28]。
此外,购买的蒲黄药材检测为水稻,且掺伪药材份数占蒲黄药材总数的27.27%,一方面说明药材的掺伪情况可以通过DNA条形码技术检测出来,同时确定混用或掺伪的具体混伪品;另一方面说明了在市场上蒲黄掺伪情况突出。
这有可能影响蒲黄的药效甚至是影响到用药者的健康,因此相关部门应该加大蒲黄药材的监管力度。
本文采用DNA条形码技术,基于ITS2序列,对60份蒲黄、松花粉及其混伪品样品进行研究,实验中设计的蒲黄ITS2引物PhF-R的扩增效率高达100%,实验结果证明ITS2序列能够准确鉴定蒲黄、松花粉及其混伪品。
此研究为花粉类中药材的鉴定提供了新思路,为药材原料的准确采购、市场流通及质量监管提供了新的技术手段。
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Identificationofcattailpollen(Puhuang),pinepollen(Songhuafen)and
itsadulterantsbyITS2sequence
MAXiao-xi1,2,SUNWei2,RENWei-chao2,XIANGLi2,ZHAOBo2,ZHANGYa-qin1,
SONGMing1,MUZe-jing3,CHENShi-lin2*
(1.SchoolofChemicalEngineering,WuhanUniversityofTechnology,Wuhan430070,China;
2.InstituteofChineseMateriaMedica,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China;
3.JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004,China)
[Abstract]DNAbarcodingmethodwasconductedfortheauthenticationofpollenmaterialsduetodifficultyofdiscriminatingpollenmaterialsbearingmorphologicalsimilarity.Inthisstudy,aspecificfocuswastoidentifycattailpollen(Puhuang)andpinepollen(Songhuafen)samplesfromtheiradulterantswhicharefrequentlymixed-together.Regionsoftheinternaltranscribedspacer(ITS2)from60samplesweresequenced,andnewprimersforcattailpollenweredesignedaccordingtothesequenceinformation.TheresultsfromtheNJtreesshowedthatthespeciesofpinepollen,Puhuangandtheiradulterantscanbeclassifiedasobviousmonophyly.Therefore,weproposetoadaptDNAbarcodingmethodologytoaccuratelydistinguishcattailpollen,pinepollenandtheiradulterantmaterials.Itisagreathelpfordrugregulatoryagencytosupervisethequalityofmedicinalmaterials.
[Keywords]ITS2;cattailpollen;pinepollen;DNAbarcode
doi:
10.4268/cjcmm20141208
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