芭蕉属植物cpDNAL16序列限制性片段长度多态性研究毕业论文.docx
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芭蕉属植物cpDNAL16序列限制性片段长度多态性研究毕业论文
2011年度本科生毕业论文(设计)
芭蕉属植物cpDNAL16序列限制性片段长度多态性研究
学院:
生物科学与技术学院
专业:
生物科学
年级:
2007级
学生姓名:
姚益娟
学号:
07408052014
导师及职称:
冯慧敏(助教)
2011年5月
2011AnnualGraduationThesis(Project)oftheCollegeUndergraduate
TheRestrictionFragmentLengthPolymorphismAnalysisofBananasbasedoncpDNAL16Sequeces
Department:
Biologicalscientificandtechnicalcollege
Major:
Biologicalsciences
Grade:
2007
Student’sName:
Yaoyijuan
StudentNo.:
07408052014
Tutor:
FengHuimin(TeachingAssistant),
FinishedbyMay,2011
摘要
香蕉和大蕉在发展中国家是第四大重要的作物,香蕉和可食用芭蕉作为水果在世界贸易量中所占比重保持着第二至第三的排名(粮农组织统计,2007年),FAO(联合国粮农组织)把香蕉认定为仅次于水稻、小麦、玉米之后的第四大粮食作物。
我国是香蕉的主产国之一,但香蕉的遗传育种研究相对落后,主栽培品种一直依赖于从国外引进。
香蕉栽培品种的起源与演化一直是香蕉遗传育种基础研究的重点,但是研究结果并不完全一致。
目前国内很少有关于通过叶绿体DNA对芭蕉属植物进行研究的报道。
在本研究中,用限制性内切酶Sau3AI、MspI、TaqαI、AluI分别对获得的L16基因序列进行理论酶切。
通过限制性内切酶酶切后,酶切片段大小相同的记为1,不同的记为0。
相似系数和聚类分析应用NTSYS-pc2.01数据分析软件进行,采用Nei的方法计算相似系数,UPGMA方法聚类,绘制树状图。
得出芭蕉属种间存在较为丰富的cpDNAPCR-RFLP多态性,种内差异性不明显,有些亚种间无法区分开。
而M.acuminata具有丰富的亚种和变种,遗传差异大,多样性丰富。
关键词:
香蕉L16基因;cpDNA;遗传多样性;PCR-RFLP分析;亲缘关系
ABSTRACT
Bananaandplantainarethefourthimportantfarmcropinthedevelopingcountries.Asthefruits,bananaandedibleusebananakeepsthesecondtothirdamidthespecificgravityintheworldtradequantity(foodagricultureorganizationstatistics,2007),.BananaisaffirmedbyFAO(unitednationsfoodagricultureorganization)forthefourthcommissaryfarmcropandsecondonlytopaddyrice,wheatandcorn.Ourcountryisoneofthelordproducebananacountries,buttheheredityandbreedingresearchofbananacomparativelyfallbehind,lordcultivationspecieshavebeenrelyingonindraughtfromabroad.Thefiliationandevolvementofbanana'splantingvarietieshavebeentheemphasesofbanana'sheredityandbreedingbaseresearch,butthestudyresultsareincompletelyidentical.CurrentlydomesticreportseldomcoverbananastudythoughcpDNA.Inthisresearch,usefourinsiderestrictionenzymesSau3AI,MspI,TaqαIandAluItoslicetotheL16sequecesbytheoryenzymesslicemethod.Afterenzymesslice,thesameoralikedimensionsrecordto1,dissimilaritiesrecordto0.AlikecoefficientandgatheratypeanalyticaluseNTSYS-pc2.01dataanalysissoftwareprogresstoanalyze,adoptNeimethodcomputingalikecoefficient,theUPGMAmethodgathersatypeandthendrawstreediagram.TheresultsuggeststhattheMusahaveacolourfulcpDNAPCR-RFLPgeneticdiversitybetweenkinds.Butthereisnotobviousgeneticdiversity,andsomesubspeciescannotdifferentiate.Inaddition,M.acuminatahasprolificsubspeciesandaberrantspecies,andhaveabighereditydiscrepancy.
Keywords:
BananaL16gene;cpDNA;Geneticdiversity;PCR-RFLPalasysis;Relationship
目录
第一章前言1
1.1研究概况1
1.1.1芭蕉属植物分类的研究概况1
1.1.2cpDNA的研究概况1
1.1.3PCR-RFLP技术的研究概况2
1.2研究的意义与目的3
1.2.1研究意义3
1.2.2研究目的3
第二章材料与方法4
2.1实验材料4
2.1.1用于芭蕉属植物cpDNAL16基因研究的实验材料4
2.1.2选择合适的引物扩增芭蕉属植物的cpDNAL16基因7
2.1.3选择适当的限制性内切酶对获得的芭蕉属植物的cpDNAL16基因进行理论酶切7
2.2实验方法8
2.2.1DNA的提取与纯化8
2.2.2PCR扩增8
2.2.3扩增产物的纯化和克隆9
2.2.4克隆产物测序11
2.2.5理论酶切的方法11
2.2.6数据统计与分析11
第三章结果与分析12
3.1酶切片段的多态性12
3.2遗传多样性分析19
3.2.1野生蕉的遗传多样性分析19
3.2.2栽培蕉的遗传多样性分析21
第四章结果与讨论24
4.1理论酶切结果24
4.2.供试材料间的遗传关系24
参考文献25
致谢27
附录1野生焦的遗传相似系数28
附录2栽培焦的遗传相似系数29
第一章前言
1.1研究概况
1.1.1芭蕉属植物分类的研究概况
林奈(1778)建立了芭蕉属Musa,于1778年开始对芭蕉属植物进行分类。
Sagot(1887)首次提出将芭蕉属属下按组分类,建议将其属下分为大株型的象腿蕉组、可以食用的香蕉组和带有直立花序的观赏型芭蕉组。
Baker(1893)采用了Sagot的建议,正式将Musa属下分成Physocaulis、Eumusa和Rhodochlamys三个亚属。
Cheesman[1](1947)依据形态学和染色体数目等,将芭蕉属植物分成四个组,分别为真蕉组(Sect.Eumusa)(2n=22)、观赏蕉组(Sect.Rhodochlamys)(2n=22)、红花蕉组(Sect.Callimusa)(2n=20)、澳蕉组(Sect.Australimusa)(2n=20)。
Simmonds[2-3](1960,1962)又新增加了不确定组(Incertaesedis),认为此组仅含有两个种MusaingensSimmonds(2n=14),MusabeccariiSimmonds(2n=18)。
Argent[4](2000)将M.ingens归纳为新的组Sect.Ingensmusa,Hakkinen(2005)将M.beccarii归为Callimusa组。
Simmonds(1960,1962)认为芭蕉属共约30-40种,起源于热带亚热带区域,并将芭蕉属各种的地理分布进行了归纳整理。
并且对芭蕉属野生种质形态建立了分类法,制作了芭蕉属野生种的形态特征性状分类表,从形态上将芭蕉属野生种质进行了系统的分类。
香蕉具有特殊的遗传方式,即叶绿体母本遗传和线粒体父本遗传(Fauré等,1993),这种遗传方式为我们寻找香蕉栽培种的原始父母本,提供了可能。
但是香蕉栽培品种具有单性结果、多倍体、高度不育、没有种子等特性,这为香蕉常规育种带来了极大的困难,同时,对于商业栽培的主栽品种巴西和威廉斯Cavendish两个原始品种杂交亲本的野生亚种没有完全确定,导致杂交育种亲本的选择具有盲目性,育种效率低。
因此要做好香蕉的抗性育种,首先要搞清香蕉起源的亲本,从而有针对地知道亲本的选择,提高抗性育种的效率。
当前,全球主栽香蕉品种为巴西、威廉斯Cavendish系列品种,品种趋同性高。
由于遗传基础狭窄,随着种植面积的扩大,病虫害日益突出,香蕉枯萎病和香蕉根际线虫病已成为威胁香蕉生存的头号敌人,培育具有抗性的香蕉品种成为急需解决的问题。
1.1.2cpDNA的研究概况
长期以来,许多国内外学者应用形态学、细胞学和分子生物学标记对芭蕉属植物的起源进化、亲缘关系、系统重建进行了长期的研究。
其中,DNA分子标记【5】在芭蕉的品种鉴定、遗传分类、系统发育和基因克隆等多领域已得到广泛应用,但是研究对象主要为总基因组,胞质基因组研究相对较少。
相对于核基因组,胞质基因组较少,序列保守但是进化速度较快,并且胞质基因组遗传为非孟德尔遗传方式,对于芭蕉品种的系统发育研究具有独特的优势,可以排除父本干扰。
同时,胞质基因组分析结果可以为总基因组研究提供佐证,使得芭蕉属植物类群系统发育重建更加准确。
植物基因组包含细胞核基因组和细胞质基因组,其中细胞质基因组包括叶绿体基因组(cpDNA)和线粒体基因组(mtDNA)。
高等植物叶绿体为基因组为母性遗传,相对于核基因基因组结构和序列非常保守,进化速率仅为核基因的1/5[6]。
cpDNA呈环状,通常由两个反向重复序列(IR)将一个大的单拷贝区域(LSC)和一个小的单拷贝区域(SSC)分开。
与核DNA相比,cpDNA具有分子量小、多考贝和结构简单的特点,这些都有利于对叶绿体基因组进行分析。
所以,cpDNA被认为是研究种间甚至种内材料进化和亲缘关系的理想工具,目前己设计出很多适用于系统发育和群体遗传学研究的通用引物[7-10]。
在叶绿体编码基因中,L16内含子是植物系统学研究中较常用的叶绿体基因组非编码序列。
L16基因,即编码核糖体蛋白16的大亚基,位于植物叶绿体组的大单拷贝区,长约1000bp,变化范围多在811-1208bp间,为cpDNA中进化相对较快的内含子之一。
在远缘类群中,此区域长度变异明显,排序困难,故主要用于科内水平或属下等低分类阶元或近缘类群间,以及较晚分化类群间的系统学研究。
【11】L16基因研究也可用于种内变异研究中,但仅占少数。
1.1.3PCR-RFLP技术的研究概况
聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-restrictionfragmentlengthpolymorphism,PCR-RFLP)技术是一种常用的快速简便分析物种组成的方法。
它是利用基因组某一区段DNA序列的多态性和限制性内切酶识别的专一性,将不同物种的一段同源片段用同一种或不同种的内切酶消化,利用产生不同的片段式样达到区分物种的目的【12】。
目前,cpDNA序列比较和酶切特异扩增片段已经应用于植物种类鉴定研究、遗传多样性和系统进化研究。
基于cpDNA的PCR-RFLP分析目前是cpDNA系统学研究中使用最为广泛的技术,也是物种鉴别、种间杂种鉴定、物种混杂分析等研究的有力工具。
Talbert【13】等把部分小麦RFLP标记进行测序、设计PCR引物,将其转化为PCR-RFLP标记,并定位于小麦的7个部分同源群染色体上,且发现16对引物中的9对引物能在20份小麦材料间揭示出多态性。
EMAD【14】等通过PCR-RFLP和微卫星技术发现了叶绿体标记的山楂属遗传多态性,首次用叶绿体核苷酸序列阐明了叙利亚南部山楂属内的系统发生关系。
20世纪80年代以来,随着分子生物学技术和分子遗传学理论的迅速发展,随着分子克隆及DNA重组技术的日趋完善,随着研究人员对基因结构和功能研究的进一步深入,开始在分子水平上寻找DNA的多态性,以此为标记进行各种遗传分析。
DNA分子标记直接反映DNA水平上的遗传变异,能稳定遗传,可重复,信息量大,可信度高,基本消除了环境影响【15】。
1.2研究的意义与目的
1.2.1研究意义
香蕉和大蕉在发展中国家是第四大重要的作物,香蕉和可食用芭蕉作为水果在世界贸易量中所占比重保持着第二至第三的排名(粮农组织统计,2007年),并且为全球约4亿人口提供充足的食物来源。
FAO[16](联合国粮农组织)把香蕉认定为仅次于水稻、小麦、玉米之后的第四大粮食作物。
我国是香蕉的主产国之一,但香蕉的遗传育种研究相对落后,主栽培品种一直依赖于从国外引进。
当前,全球主栽香蕉品种为巴西、威廉斯Cavendish系列品种,品种趋同性高。
由于遗传基础狭窄,随着种植面积的扩大,病虫害日益突出,香蕉枯萎病和香蕉根际线虫病已成为威胁香蕉生存的头号敌人,培育具有抗性的香蕉品种成为急需解决的问题。
香蕉具有特殊的遗传方式,即叶绿体母本遗传和线粒体父本遗传[17,18](Fauré等,1993),这种遗传方式为我们寻找香蕉栽培种的原始父母本,提供了可能。
但是香蕉栽培品种具有单性结果、多倍体、高度不育、没有种子等特性,这为香蕉常规育种带来了极大的困难,同时,对于商业栽培的主栽品种巴西和威廉斯Cavendish两个原始品种杂交亲本的野生亚种没有完全确定,导致杂交育种亲本的选择具有盲目性,育种效率低。
因此要做好香蕉的抗性育种,首先要搞清香蕉起源的亲本,从而有针对地知道亲本的选择,提高抗性育种的效率。
1.2.2研究目的
香蕉栽培品种的起源与演化一直是香蕉遗传育种基础研究的重点,但是研究结果并不完全一致。
目前国内很少有关于通过叶绿体DNA对芭蕉属植物进行研究的报道。
因此,本研究对芭蕉属植物的叶绿体DNAL16基因进行PCR-RFLP分析,以期为芭蕉属植物的起源与分类提供分子依据,并为芭蕉属植物的进化和演化分析提供新的依据。
第二章材料与方法
2.1实验材料
2.1.1用于芭蕉属植物cpDNAL16基因研究的实验材料
本研究以所收集到的90份芭蕉属野生种和栽培品种为研究对象,其中野生蕉56份,栽培蕉47份。
来自中国的材料16份,其他国家的材料74份。
样品来源于比利时鲁汶大学IBINAP的ITC以及本课题组陈友老师在云南采集的材料。
野生种中,真蕉组材料41份,红花蕉组材料2份,澳蕉组材料6份,观赏蕉组材料6份,未被分入任何组的材料1份。
栽培种中AA种29份,AAA种2份,AAAB种1份,AAB种1份,AB种1份。
所有的材料均保存于-70℃备用,具体材料见表1。
表2-1材料来源
用于叶绿体非编码区序列的实验材料
Tab2-1SourcesofmaterialsforcpDNAsequence
No.
VernacularName
Statusofplant
Section
Species/
Group
SubSpecies/SubGroup
Donorcountry
source
M1
I0
Advancedcultivar
AA
China
海南澄迈
M2
Rose
Advancedcultivar
AA
China
广东农科院
M3
海贡
Advancedcultivar
AA
China
广东农科院
M4
Type3×
Wild
Eumusa
acuminata
Ssp/sgr503
France
ITC0060
M5
Type2×
Wild
Eumusa
acuminata
Ssp/sgr505
France
ITC0069
M6
PahangIRFA
Wild
Eumusa
acuminata
Ssp/sgr517
France
ITC0070
M7
Tavoy
Wild
Eumusa
acuminata
burmannica
France
ITC0072
M8
malaccensis
Wild
Eumusa
acuminata
malaccensis
France
ITC0074
M9
Calcutta4
Wild
Eumusa
acuminata
burmannicoides
France
ITC0249
M10
Borneo
Wild
Eumusa
acuminata
microcarpa
France
ITC0253
M11
Higa
Wild
Eumusa
acuminata
Ssp/sgr528
Honduras
ITC0378
M12
Hybrid
Wild
Eumusa
acuminata
Ssp/sgr507
Honduras
ITC0382
M13
truncata
Wild
Eumusa
acuminata
truncata
CostaRica
ITC0393
M14
Pa(Musore)no.3
Wild
Eumusa
acuminata
Ssp/sgr521
France
ITC0406
M15
PisangCiciAlas
Wild
Eumusa
acuminata
Ssp/sgr529
France
ITC0415
M16
MargesElargies
Wild
Eumusa
acuminata
Ssp/sgr522
France
ITC0421
M17
A3617/9
Wild
Eumusa
acuminata
Ssp/sgr512
Fiji
ITC0530
M18
Hybrid
Wild
Eumusa
acuminata
Ssp/sgr511
Honduras
ITC0607
M19
Hybrid
Wild
Eumusa
acuminata
Ssp/sgr513
Honduras
ITC0608
M20
Selangor2
Wild
Eumusa
acuminata
Ssp/sgr523
Colombia
ITC0629
M21
PisangCici
Wild
Eumusa
acuminata
Ssp/sgr516
France
ITC0681
M22
Musaacuminatassp.banksii
Wild
Eumusa
acuminata
banksii
Australia
ITC0806
M23
Agutay
Wild
Eumusa
acuminata
Ssp/sgr504
France
ITC1028
M24
THA018
Wild
Eumusa
acuminata
Ssp/sgr527
France
ITC1067
M25
zebrina
Wild
Eumusa
acuminata
zebrina
France
ITC1177
M26
Vietnamno.5
Wild
Eumusa
acuminata
Ssp/sgr526
France
ITC1251
M27
RungHoaXoan
Wild
Eumusa
AA
AASsp/sgr742
VietNam
ITC1432
M28
MakyughuII
Wild
Eumusa
AA
AAM'chare
Tanzania
ITC1446
M29
小果野蕉
Wild
Eumusa
acuminata
var.chinensis
China
云南景洪
M30
紫罗兰野蕉
Wild
Rhodochlamys
chunii
China
云南盈江
M31
阿宽蕉
Wild
Eumusa
itinerans
China
云南盈江
M32
野蕉(BB)
Wild
Eumusa
balbisiana
China
云南盈江
M33
血红蕉Ⅰ
Wild
Rhodochlamys
sanguinea
sanguinea
China
云南景洪
M34
血红蕉Ⅱ
Wild
Rhodochlamys
sanguinea
angle
China
云南瑞丽
M35
云南芭蕉
Wild
yunnanensis
China
云南盈江
M36
粉芭蕉
Wild
Eumusa
nagensium
China
云南盈江
M37
芭蕉
Wild
Eumusa
basjoo
China
四川雅安
M38
河口指天蕉
Wild
Callimusa
paracoccinea
China
云南金平
M39
Musatextilis(Abaca)
Wild
Australimusa
textilis
textilis
France
ITC0079
M40
Musaornata
Wild
Rhodochlamys
ornata
ornata
Australia
ITC0370
M41
Musajackeyi
Wild
Australimusa
jackeyi
jackeyi
Australia
ITC0588
M42
M.schizocarpaN?
Wild
Eumusa
schizocarpa
Ssp/sgr502
Australia
ITC0599
M43
Musalaterita
Wild
Rhodochlamys
laterta
laterta
Colombia
I
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