ABI测序仪的测序原理和操作规程.docx
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ABI测序仪的测序原理和操作规程
ABI型DNA测序仪的测序原理和操作规程
DNA序列测定分手工测序和自动测序,手工测序包括Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学降解法。
自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。
美国PEABI公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA测序仪,其中310型是临床检测实验室中使用最多的一种型号。
本实验介绍的是ABIPRISM310型DNA测序仪的测序原理和操作规程。
【原理】ABIPRISM
310型基因分析仪(即DNA测序仪),采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳,应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法),因此通过单引物PCR测序反应,生成的PCR产物则是相差1个碱基的3''''''''末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物,使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳,从而避免了泳道间迁移率差异的影响,大大提高了测序的精确度。
由于分子大小不同,在毛细管电泳中的迁移率也不同,当其通过毛细管读数窗口段时,激光检测器窗口中的CCD(charge-coupleddevice)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测,激发的荧光经光栅分光,以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光,并在CCD摄影机上同步成像,分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列,从而达到DNA测序的目的。
分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。
它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。
PE公司还提供凝胶高分子聚合物,包括DNA测序胶(POP6)和GeneScan胶(POP4)。
这些凝胶颗粒孔径均一,避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。
它主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。
电脑中则包括资料收集,分析和仪器运行等软件。
它使用最新的CCD摄影机检测器,使DNA测序缩短至2.5h,PCR片段大小分析和定量分析为10~40min。
由于该仪器具有DNA测序,PCR片段大小分析和定量分析等功能,因此可进行DNA测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析,临床上可除进行常规DNA测序外,还可进行单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变检测、HLA配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。
【试剂与器材】
1.BigDye测序反应试剂盒主要试剂是BigDyeMix,内含PE专利四色荧光标记的ddNTP和普通dNTP,AmpliTaqDNA
polymeraseFS,反应缓冲液等。
2.pGEM-3Zf(+)双链DNA对照模板0.2g/L,试剂盒配套试剂。
3.M13(-21)引物TGTAAAACGACGGCCAGT,3.2μmol/L,即3.2pmol/μl,试剂盒配套试剂。
4.DNA测序模板
可以是PCR产物、单链DNA和质粒DNA等。
模板浓度应调整在PCR反应时取量1μl为宜。
本实验测定的质粒DNA,浓度为0.2g/L,即200ng/μl。
5.引物
需根据所要测定的DNA片段设计正向或反向引物,配制成3.2μmol/L,即3.2pmol/μl。
如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物,如M13(-21)引物,T7引物等。
6.灭菌去离子水或三蒸水。
7.0.2ml或和0.5ml的PCR管盖体分离,PE公司产品。
8.3mol/L醋酸钠(pH5.2)称取40.8gNaAc?
3H2O溶于70ml蒸馏水中,冰醋酸调pH至5.2,定容至100ml,高压灭菌后分装。
9.70%乙醇和无水乙醇。
10.NaAc/乙醇混合液取37.5ml无水乙醇和2.5ml3mol/LNaAc混匀,室温可保存1年。
11.POP6测序胶ABI产品。
12.模板抑制试剂(TSR)ABI产品。
13.10×电泳缓冲液ABI产品。
14.ABIPRISM310型全自动DNA测序仪。
15.2400型或9600型PCR仪。
16.台式冷冻高速离心机。
17.台式高速离心机或袖珍离心机。
【操作步骤】
1.PCR测序反应
(1)取0.2ml的PCR管,用记号笔编号,将管插在颗粒冰中,按下表加试剂:
所加试剂测定模板管标准对照管
BigDyeMix1μl1μl
待测的质粒DNA1μl-
pGEM-3Zf(+)双链DNA-1μl
待测DNA的正向引物1μl-
M13(-21)引物-1μl
灭菌去离子水2μl2μl
总反应体积5μl,不加轻矿物油或石蜡油,盖紧PCR管,用手指弹管混匀,稍离心。
(2)将PCR管置于9600或2400型PCR仪上进行扩增。
98℃变性2min后进行PCR循环,PCR循环参数为96℃10s,50℃
5s,60℃4min,25个循环,扩增结束后设置4℃保温。
2.醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物
(1)将混合物离心,将扩增产物转移到1.5mlEP管中。
(2)加入25μl醋酸钠/乙醇混合液,充分振荡,置冰上10min以沉淀DNA。
12000r/min于4℃离心30min,小心弃上清。
(3)加70%(V/V)的乙醇50μl洗涤沉淀2次。
12000r/min于4℃离心5min,小心弃上清和管壁的液珠,真空干燥沉淀10~15min。
3.电泳前测序PCR产物的处理。
(1)加入12μl的TSR于离心管中,剧烈振荡,让其充分溶解DNA沉淀,稍离心。
(2)将溶液转移至盖体分离的0.2mlPCR管中,稍离心。
(3)在PCR仪上进行热变性(95℃2min),冰中骤冷,待上机。
4.上机操作
按仪器操作说明书安装毛细管,进行毛细管位置的校正,人工手动灌胶和建立运行的测序顺序文件。
仪器将自动灌胶至毛细管,1.2kV预电泳5min,按编程次序自动进样,再预电泳(1.2kV,20min),在7.5kV下电泳2h。
电泳结束后仪器会自动清洗,灌胶,进下一样品,预电泳和电泳。
每一个样品电泳总时间为2.5h。
电泳结束后仪器会自动分析或打印出彩色测序图谱。
5.仪器将自动进行序列分析,并可根据用户要求进行序列比较。
如测序序列已知,可通过序列比较以星号标出差异碱基处,提高工作效率。
6.测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。
【计算】
测序反应精确度计算公式:
100%-差异碱基数(不包括N数)/650×100%
差异碱基即测定的DNA序列与已知标准DNA序列比较不同的碱基,N为仪器不能辨读的碱基。
【注意事项与评价】
1.ABIPRISM310基因分析仪是高档精密仪器,需专人操作、管理和维护。
2.本实验测序PCR反应的总体积是5μl,而且未加矿物油覆盖,所以PCR管盖的密封性很重要,除加完试剂后盖紧PCR管盖外,最好选用PE公司的PCR管。
如PCR结束后PCR液小于4~4.5μl,则此PCR反应可能失败,不必进行纯化和上样。
3.作为测序用户来说,只需提供纯化好的DNA样品和引物,一个测序PCR反应使用的模板不同,需要的DNA量也就不同,PCR测序所需模板的量较少,一般PCR产物需30~90ng,单链DNA需50~100ng,双链DNA需200~500ng,DNA的纯度一般是A260nm/A280nm为1.6~2.0,最好用去离子水或三蒸水溶解DNA,不用TE缓冲液溶解。
引物用去离子水或三蒸水配成3.2pmol/μl较好。
4.本实验使用的测序试剂盒是BigDye荧光标记终止底物循环测序试剂盒,一般可测DNA长度为650bp左右。
本仪器DNA测序精确度为(98.5±0.5)
%,仪器不能辨读的碱基N<2%,所需测定的长度超过了650bp,则需设计另外的引物。
为保证测序更为准确,可设计反向引物对同一模板进行测序,相互印证。
对于N碱基可进行人工核对,有时可以辨读出来。
为提高测序的精确度,根据星号提示位置,可人工分析该处彩色图谱,对该处碱基作进一步核对。
一.PumpBlock的清洁及维护
在机器运行前,必须确认PumpBlock是干净的,使用POP-6测序时,注意POP-6室温下4天须更换。
1.打开310主机,然后打开Macintosh微机,打开DataCollection软件。
2.在Instrument菜单下,选择manualcontrol。
3.选中syringehome,点execute执行。
4.取下1ml玻璃注射器,去离子水洗净,晾干。
5.松开capillaryfitting,取下毛细管。
6.取下bufferreservior
7.双手执稳pumpblock,均匀用力,将其径直拔出。
8.取5ml塑料注射器,用去离子水反复清洗pumpblock,特别注意管路的清洗。
9.晾干后装上block,并装上毛细管。
二.安装毛细管,灌胶
1.从4°C冰箱取出POP-6胶,室温回温30分钟。
2.吸取少量POP-6,将注射器来回抽动几次使胶浸润注射器内壁,然后将胶排净。
3.吸取POP-6适量(≈0.2ml),用DIH2O洗净注射器外壁,擦干,于PumpBlock右侧上紧。
将胶放回4°C冰箱。
4.重新装好毛细管。
5.进入ManualControl菜单,关闭缓冲阀门(BufferValveClose),松开废液阀门,手指压注射器排净管道中气泡,关上阀门(BufferValveClose)。
6.进入ManualControl菜单,打开缓冲阀门(BufferValveOpen),同样方法排净管道中气泡,然后关闭缓冲阀门。
7.松开capillaryfitting,排净毛细管一侧的气泡,关紧fitting,注意毛细管顶端位于管路十字架的右边缘。
8.将毛细管固定于检测窗口holder处,注意毛细管窗口之清洁(可用无水乙醇清洗),毛细管窗口应与机器检测窗口位置的吻合(此点可用毛细管上的Marker位于检测窗边缘来证实)。
9.毛细管另一端插入电极端,使尖端比电极略低约0.5mm,同时用手指轻轻左右调节毛细管,使之尖端贴近电极尖端(间隔约2毫米),调好后用胶带固定,合上控温板门。
10.在Instrument菜单下执行AutosamplerCalibration命令,出现AutosamplerCalibration窗口,根据右下角的提示进行操作。
11.打开ManualControl,执行SyringeHome,然后选择SyringeDown,输入合适的值并执行,使曲柄几乎与注射器的活塞顶部接触。
12.具体方法:
可先输入较大的值,如200,然后待靠近后,将值减少,如100,50,20,5…。
三.样品准备
1.将10XBuffer稀释到1XBuffer(需约15ml)。
2.将1XBuffer加入到BufferReservior及1号BufferVial,注意将液面达到Marker。
3.2号位为装有约4mlDIH2O的BufferVial,3号位为注入DIH2O的去盖1.5mleppendorf管。
4.用适量的TSR溶解测序样品(根据试剂盒的Protocol),变性,冰上剧冷后,转入专用0.5ml样品管,盖好septa。
5.于ManualCtrl中,执行AutosamplerHomeX,Yaxis和AutosamplerHomeZaxis命令。
6.按PumpBlock左边的Tray键,待自动样品盘伸出后将上述样品及试剂放置到相应位置,按Tray退回,关好前门。
四.测序程序的运行
1.于打开的收集软件之File菜单中选中New。
2.于跳出的菜单中选Seq.SampleSheet.48Tubeor96Tube,(依Tray的不同而定)
3.以样品的实际位置为准输入相应的样品名并选择相应的mobilityfile和instrumentfile(Matrixfile)。
4.存盘(save)关掉SampleSheet。
5.同上所述再次选New,于眺出菜单中选Seq.InjList。
6.Seq.InjList表中,可见SampleSheet下拉菜单,选中刚才编好的SampleSheet(有时间及日期显示名)。
7.在第一个样品前须做一个TestCCD4-Color程序。
具体方法是,用鼠标选中Inj#项的No.1,于Edit下拉菜单中,选中Insert,有一个空行插入于表的No.1处。
任选一个Tube&SampleName后,于Module下拉菜单处,选TestCCD4-Color,不选择自动分析即完成。
正常情况下4条信号线应在2048(Y轴值)以下,如高于次值则需暂停机器并将毛细管窗口擦净后再继续运行。
8.编好InjList后,存盘(save)(注意Module的选择)。
9.选择Run运行此编好InjList。
五.测序结果的分析
一般分析软件可对结果进行自动分析,用户可直接打开Samplefile查看测序结果。
如果用户想对样品重新分析,可按以下步骤进行。
1.双击打开SequenceAnalysis软件,有一个SampleManager页面弹出。
2.点一下AddFile,有一个菜单弹出,找到要分析的原始数据所在的文件夹(位于HD/ABIPRISM310/RUNS中),加入需分析的原始数据,加完后点一下Done。
3.针对不同的样品的原始数据进行的分析,须注意不同的DyeSet/Primerfile,InstrumentFile的选定。
4.编好SampleManager后,点一下Start开始分析。
5.双击分析完的SampleFileName,可得到测序结果。
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- ABI 测序仪 原理 操作规程
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