实验报告二 液相.docx
- 文档编号:16249488
- 上传时间:2023-07-12
- 格式:DOCX
- 页数:14
- 大小:460.84KB
实验报告二 液相.docx
《实验报告二 液相.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《实验报告二 液相.docx(14页珍藏版)》请在冰点文库上搜索。
实验报告二液相
实验报告
课程名称:
生物仪器分析指导老师:
成绩:
__________________________
实验名称:
液相应用实验类型:
探究同组学生姓名:
一、实验目的和要求二、实验内容和原理
三、主要仪器设备四、操作方法和实验步骤
五、实验数据记录和处理六、实验结果与分析
七、讨论、心得
1、实验目的和要求
1、学习高效液相色谱仪(HPLC)的原理和使用方法。
2、利用HPLC分析有机酸的特征和含量。
3、了解保留时间、吸收光谱特征与结构之间的关系
2、实验内容和原理
内容:
1、测定有机酸混合标准品的色谱。
2、测定未知浓度的水果(火龙果)的液相色谱。
3、计算该水果的有机酸含量。
原理:
储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色谱柱(固定相)内;由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数,在两相中作相对运动时,经过反复多次的吸附-解吸的分配过程,各组分在移动速度上产生较大的差别,被分离成单个组分依次从柱内流出;通过检测器时,样品浓度被转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形式打印出来。
在适宜的条件下,高效液相色谱可分离溶液中的不同组分。
样品进高效液相色谱仪,经反相C18液相色谱分离后,以色谱峰的保留时间定性,利用色谱峰面积在一定范围内与浓度成线性关系进行定量。
本实验采用外标法,用紫外检测器测定有机酸混合标准品,分析未知浓度的水果(火龙果)中有机酸含量。
三、主要仪器设备
1、仪器:
岛津高效液相色谱仪(LC-20AT,日本Shimadzu公司),主要由高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和数据记录与处理系统五部分组成。
还配有辅助装置,如自动进样系统。
2、材料和试剂:
甲醇,有机酸混合标准液,火龙果样品溶液。
3、色谱条件:
流动相:
乙腈/重蒸水=80/20(V/V),流速1.0mL/min;0.05mol/ml(NH4)2PO4;柱温:
30℃;进样量:
10uL;氨基柱:
4.6×250mm;C18柱;紫外检测器:
SPD-20A;示差检测器:
RID-10A。
四、操作方法和实验步骤
1、开机,依次接通分离单元、检测器、计算机的电源。
2、流动相脱气,确认所有溶剂管路都充满溶剂。
3、启动溶剂管理系统,冲洗自动进样器和进样针,装入样品与转盘,编辑分析方法及执行样品分析表。
4、样品测定:
色谱条件:
可溶性糖测定:
色谱柱(NH2柱,4.6mmx250mm,5µm);流动相,乙腈:
水=8:
2(v/v);流速,1ml/min;柱温:
30℃。
有机酸测定:
C18柱;紫外检测器:
SPD-20A;流速1.0mL/min;流动相:
0.05mol、ml(NH4)2PO4;柱温:
25℃
单点外标法定量:
取标准品和类样品溶液20μL注入高效液相色谱仪进行分离。
记录各个峰的峰面积。
按下式计算相对含量(浓度):
5、关机,使用完毕,按规定用适当的溶剂冲洗色谱柱、系统管路、自动进样器、进样针和柱塞杆密封垫,关闭电源开关。
数据采集完毕后,关闭紫外检测器电源开关。
处理数据后,关闭计算机电源开关,并做使用登记。
五、实验数据记录和处理
H3
H4
样品第一次
样品第二次
样品第三次
1、标准品
H3浓度μg/ml
H4浓度μg/ml
出峰时间/min
H3面积
H4面积
柠檬酸
0.04
0.06
3.0左右
397878
622638
苹果酸
0.4
0.6
5.2左右
24732
37477
酒石酸
0.4
0.6
7.49左右
149069
226140
2、样品
第一次面积
第二次面积
第三次面积
柠檬酸
136748
249421
126157
苹果酸
1397847
1621624
1248110
酒石酸
27438
44556
60272
第一次浓度μg/ml(H3)
第二次浓度μg/ml(H3)
第三次浓度μg/ml(H3)
第一次浓度μg/ml(H4)
第二次浓度μg/ml(H4)
第三次浓度μg/ml(H4)
柠檬酸
0.0137
0.0251
0.0127
0.0132
0.0240
0.0122
苹果酸
22.61
26.23
20.19
22.38
25.96
19.98
酒石酸
0.0736
0.120
0.162
0.0728
0.118
0.160
6、实验结果与分析
1、用H3标准品和H4标准品测得的值基本相同,说明H3和H4标准品都比较标准,可以用于本次实验结果的计算。
1、样品中,柠檬酸浓度第二次明显高于其他两次,是由于第二次液相时,中段集体向上漂移的原因,计算平均值时建议舍去,所以可得样品中柠檬酸浓度=0.0130μg/ml。
2、苹果酸的出峰位置在5.2min左右,但是样品中在5.2min处没有明显的峰,只有在5.8min处有一个较明显的峰,用这个峰计算的苹果酸含量=22.89μg/ml。
还需进行进一步实验确定样品中究竟是苹果酸含量极少,还是出峰位置因为某些化合物影响发生了改变。
3、样品中酒石酸含量=0.118μg/ml。
7、讨论、心得
1、HPLC常用检测器有哪些?
列举用途。
(1)紫外检测器
UV-Vis是目前HPLC中应用最广泛的检测器,对大部分有机化合物有响应,简称紫外检测器。
这种检测器灵敏度高,线性范围宽,对流速和温度变化不敏感,可用于梯度洗脱分离。
紫外检测器要求被检样品组分在紫外或可见光区有吸收,而使用的流动相无紫外吸收或紫外吸收波长与被检组分紫外吸收波长不同,在被检组分紫外吸收波长处没有吸收。
紫外检测器属选择性检测器,流通池可做的很小(1mm×10mm,容积8μL);同时它是非破坏性检测器,可用于制备色谱。
(2)光电二极管阵列检测器(Diodearraydetctor,DAD或photo-diodearray,PDA)
光电二极管阵列检测器:
1024个二极管阵列,各检测特定波长,计算机快速处理,三维立体谱图,如图所示。
普通的UV-Vis检测器只能测定某一波长时吸光度与时间关系曲线,即只能作二维图谱。
要测定某组分的紫外可见吸收光谱图,需采用“停留扫描”的方法,PDA能够同时测定吸光度、时间、波长三者的关系,通过计算机处理,可以得到三维图谱。
也可做出任意波长的吸光度-时间曲线(色谱图)和任意时间的吸光度-波长曲线(紫外可见光谱图)。
PDA的一个重要用途是峰纯度检验。
(3)示差折光检测器(RefractiveIndexDetector,RID)
RID也称光折射检测器,是一种通用型检测器。
基于连续测定色谱柱流出物光折射率的变化而用于测定溶质浓度。
溶液的光折射率是溶剂(流动相)和溶质各自的折射率乘以其物质的浓度之和,溶有样品的流动相和流动相本身之间光折射率之差即表示样品在流动相中的浓度。
原则上凡是与流动相光折射率有差别的样品都可用它来测定。
其检测限可达10-6-10-7g/mL,一般不能用于梯度分析。
(4)蒸发光散射检测器(EvaportivelightScatteringDetector,ELSD)
ELSD是一种质量型检测器,它可以用来检测任何不挥发性化合物,包括氨基酸、脂肪酸、糖类、表面活性剂等,尤其对一些较难分析的样品,如磷脂、皂苷、生物碱、甾族化合物等无紫外吸收或紫外末端吸收的化合物更具有其他HPLC检测器无法比拟的优越性。
此外,ELSD对流动相的组成不敏感,可以用于梯度洗脱。
ELSD的检测灵敏度要高于低波长紫外检测器和示差折光检测器,检测限可低至于10-10g。
(5)荧光检测器((fluorescencedetector,FLD)
许多化合物,特别是芳香族化合物、生化物质,如有机胺、维生素、激素、酶等被入射的紫外光照射后,能吸收一定波长的光,使原子中的某些电子从基态中的最低振动能级跃迁到较高电子能态的某些振动能级,之后,由于电子在分子中的碰撞,消耗一定的能量而下降到第一电子激发态的最低振动能级,再跃迁回到基态中的某些不同振动能级,同时发射出比原来所吸收的光频率较低、波长较长的光,即荧光。
被这些物质吸收的光称为激发光(λex),产生的荧光称为发射光(λem)。
荧光的强度与入射光强度、量子效率、样品浓度成正比。
FLD的最大优点是的高灵敏度和良好的选择性。
一般来说,它比紫外吸收检测器的灵敏度要高10-1000倍,可达mg/L级,而且它所需要的试样很少,因此在药物和生化分析中有着广泛的用途。
(6)电导检测器(Conductivitydetector,CD)
CD是离子色谱中使用最广泛的检测器,其原理是用两个对电极测量水溶液中离子型溶质的电导,由电导的变化测定淋洗液中溶质浓度。
这种检测器的死体积小,如采用抑制电导法,其灵敏度可达10-8g/mL,线性动态范围为103。
(7)安培检测器(Amperedetector,AD)
AD采用固体工作电极,电极可用于较高的正电位,故能检测氧化还原性物质,适用范围很宽。
AD结构简单,池体积小,响应快,噪声低,灵敏度高。
但是由于电极表面容易被污染,需要经常抛光更新。
AD有直流、脉冲和积分之分,也是离子色谱常用的检测器之一。
(8)质谱检测器(MassSpectrometerdetector,MSD)
一般是指HPLC-MS或HPLC-MS/MS等联用,通常作为结构测定或化合物鉴定等使用。
有极高的灵敏度和分辨率。
目前流行的接口是电喷雾离子化(ESI)和大气压化学电离(APCI),并有正负二种离子方式,应用范围极其广泛。
(9)化学反应检测器ChemicalReactionDetector,CRD*
也就是将被检物质进行某种化学反应(衍生反应,酶反应等)后再用高灵敏度的某种检测器检测。
如氨基酸分析仪,固相化学反应检测器(固定化酶反应器)等。
(10)介电常数检测器dielectricconstantdetector,DCD*
介电常数检测器是一种通用型检测器,灵敏度低,通用性强。
其工作原理是:
随流动相中流出组分的改变,其介电常数、电容量也改变,因此测定流动相的电容量变化,即可检测组分的变化。
介电常数检测器性能类似于RID,但其应用不如后者普遍。
(11)电位测定检测器*
电位测定检测器利用离子选择电极测定流出液的电位,流出液组成改变,电位也发生变化。
使用不同的离子选择电极(如卤离子电极,银离子电极等)可测定不同的离子浓度变化情况。
(12)放射性检测器—flowscintillationanalyzer,FSA*
放射性检测器是一种检测流动相中有放射性标记组分的特殊检测器。
其响应范围很宽,对没放射性的流动相成分的改变不敏感,可有效地使用梯度洗脱技术。
(13)光电导检测器*
光电导检测器是利用某些化合物受强烈紫外光照射引起光电离形成离子的现象,在电导池中检测。
这种检测器对卤代物和许多含硫和氮的光敏化合物有选择性响应。
光电导检测器对某些化合物的灵敏度比紫外-可见光吸收检测器还高,两者线性范围相当。
(14)红外光谱检测器,infrareddetector*
红外检测器可用作HPLC的选择性检测。
这种方法主要用于凝胶色谱,且只能用于流动相对所用红外波长没有吸收的体系。
目前应用较多的是傅里叶变换红外光谱检测器,即HPLC-FTIR联用,由于扫描速度快,不用停留就可以得到每一个色谱峰的红外光谱图。
(15)库仑阵列电化学检测器*
库仑阵列电化学是一种新型的检测器,灵敏度非常高(10-15),用于测定电化学活性物质,可得到三维的色谱图(时间、电势、浓度)。
(16)粘度检测器*
粘度检测器主要用于凝胶色谱中测定高分子的相对分子量。
2、什么是外标法?
什么是内标法?
二者有什么区别?
内标法:
是一种间接或相对的校准方法。
在分析测定样品中某组分含量时,加入一种内标物质以校谁和消除出于操作条件的波动而对分析结果产生的影响,以提高分析结果的准确度。
内标法在气相色谱定量分析中是一种重要的技术.使用内标法时,在样品中加入一定量的标准物质,它可被色谱拄所分离,又不受试样中其它组分峰的干扰,只要测定内标物和待测组分的峰面积与相对响应值,即可求出待测组分在样品中的百分含量。
外标法:
用待测组分的纯品作对照物质,以对照物质和样品中待测组分的响应信号相比较进行定量的方法称为外标法。
此法可分为工作曲线法及外标一点法等。
工作曲线法是用对照物质配制一系列浓度的对照品溶液确定工作曲线,求出斜率、截距。
在完全相同的条件下,准确进样与对照品溶液相同体积的样品溶液,根据待测组分的信号,从标准曲线上查出其浓度,或用回归方程计算,工作曲线法也可以用外标二点法代替。
通常截距应为零,若不等于零说明存在系统误差。
工作曲线的截距为零时,可用外标一点法(直接比较法)定量。
外标一点法是用一种浓度的对照品溶液对比测定样品溶液中i组分的含量。
将对照品溶液与样品溶液在相同条件下多次进样,测得峰面积的平均值,用下式计算样品中i组分的量:
W=A(W)/(A)
式中W与A分别代表在样品溶液进样体积中所含i组分的重量及相应的峰面积。
(W)及(A)分别代表在对照品溶液进样体积中含纯品i组分的重量及相应峰面积。
外标法方法简便,不需用校正因子,不论样品中其他组分是否出峰,均可对待测组分定量。
但此法的准确性受进样重复性和实验条件稳定性的影响。
此外,为了降低外标一点法的实验误差,应尽量使配制的对照品溶液的浓度与样品中组分的浓度相近。
外标法externalstandardmethod色谱分析中的一种定量方法,它不是把标准物质加入到被测样品中,而是在与被测样品相同的色谱条件下单独测定,把得到的色谱峰面积与被测组分的色谱峰面积进行比较求得被测组分的含量。
外标物与被测组分同为一种物质但要求它有一定的纯度,分析时外标物的浓度应与被测物浓度相接近,以利于定量分析的准确性。
简单的说:
内标法就是用在样品中定量加入你要分析的物质,通过测得的实际样品量和加入样品量的比值来定量所要分析的样品含量。
内标法主要优点是简单,快速。
缺点是没有标准曲线法定量精确。
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 实验报告二 液相 实验 报告
![提示](https://static.bingdoc.com/images/bang_tan.gif)