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HLA4
HLA
【摘要】目的探讨急性肾小球肾炎发生及发展与HLA-DRB1等位基因的关系,寻找该病的HLA-DRB1易感基因。
方法采用序列特异性引物-聚合酶链反应方法对急性肾小球肾炎患儿和正常儿童的HLA-DRB1等位基因进行分析,并分析了HLA-DRB1ˇ15基因型在急性肾小球肾炎中所起的作用。
结果急性肾小球肾炎患儿HLA-DRB1ˇ15基因频率为,与正常对照组比较差异有非常显着性;HLA-DRB1ˇ15型急性肾小球肾炎患儿临床症状表现重。
结论HLA-DRB1基因型对急性肾小球肾炎的发生、发展有一定的影响;探讨急性肾小球肾炎的HLA-DRB1基因型对于病情预测有重要意义。
关键词急性肾小球肾炎HLA-DRB1基因ssp/PCR
TheinfluenceofHLAgeneonacuteglomerulonephritis
【Abstract】ObjectiveTostudytherelationbetweenacuteglomerulonephritisoccurenceanddevelopmentandHLAgene,thentofindHLApredisposinggeneofthis Usingssp-PCRmethodtostudyacuteglomerulonephritispatient’sHLAgeneandassaydifferentclinicalsituationsofdifferentHLAgene Thegenefrequencyofacuteglomerulonephritispatients%.Itissignificantlyhigherthannormalcontrolgroup;AcuteglomerulonephritispatientswhowasHLA-DRB1ˇ15weremore Theoccurˉrenc
eandthedevelopmentofchildrenacuteglomerulonephritishavesomerelationswithHLA-DRB1ˇ isimporˉtanttostudyHLAgeneofchildrenacuteglomerulonephritisforjudgingprognosis.
KeywordsacuteglomerulonephritisHLAgenessp/PCR
目前公认免疫机制是大多数肾小球疾病发病机制的主要环节。
其直接证据如:
病变肾脏沉着有免疫球蛋白和补体成分,同时肾小球疾病病程中血清有免疫成分的异常。
肾小球疾病的免疫发病机制十分复杂,有多种因素参与。
对于免疫发病机制的研究不仅有其理论意义,还可以指导疾病的防治,具有重要的临床意义。
HLA即人类白细胞抗原也称人组织相容性抗原系统,是参与机体特异性免疫识别和免疫应答的主要成分[1]。
我们对86例急性肾小球肾炎患者和82例健康儿童的HLA-DRB1基因进行了分型研究,以期发现免疫机制在急性肾小球肾炎的发病机制中所起的作用,现报告如下。
1对象与方法
对象观察组为86例急性肾小球肾炎患儿,男42例,女44例,年龄3~16岁,诊断标准参照诸福棠第七版《实用儿科学》有关章节。
对照组82例,男43例,女39例,年龄4~16岁,排除肾脏疾病,体格检查及化验均未见异常。
观察组与对照组均为无血缘关系的汉族儿童。
2方法
主要试剂TaqDNA聚合酶、dNTPs均为上海复生生物工程公司产品,琼脂糖为上海东海制药厂产品。
DNA片段长度标准×174/HacⅢMarkers为北京鼎国生物工程公司产品。
扩增引物设计与合成引物按参考文献[2]所示,见表1,由北京赛百盛生物工程公司合成。
内对照引物参照参考文献[2]在DRB1第3内含子内设计,由赛百盛生物工程公司合成,这个引物无位点序列特异性,可以作为内对照,序列如下:
5′-TGCCAAGTGGAGCACCCAAA,3′-GCATCTTGCTCTGTGCAGAT;产生796bp的产物。
阳性细胞DNA由北京医科大学人民医院基因配型室馈赠。
人基因组DNA提取抽取静脉血,2%EDTA抗凝。
分离白细胞采用常规酚-氯仿方法提取DNA,然后用紫外分光光度计测其浓度。
DRB1位点的特异性PCR抗增通过SSP/PCR进行,一个标本需完成19个PCR反应,方能完成DRB1位点的分型。
反应混合物包括2~4个位点或组特异PCR引物,内对照引物浓度很低,约为特异引物浓度的1/3,MgCl210mmTrist-Cl、,%明胶,200mmdNTPs,1μm位点组特异引物,μm内对照引物,2UTaq酶。
PCR扩增在TC-1扩增仪上完成,循环条件:
先94℃预变性5min,然后每个循环包括94℃1min,57℃1min,72℃1min,共35个循环,然后72℃保温5min。
通过琼脂糖凝胶电泳对产物进行分析PCR产物的存在及缺失通过2%琼脂糖凝胶电泳进行,加2μl的6x上样缓冲液,10μlPCR产物,电压40V,电泳40min,溴化乙啶染色。
在紫外分光光度计下观察结果,拍照。
统计学方法用SAS软件包进行处理。
表1引物序列、长度及区分位点略
2结果
分型结果DR位点基因共分19个型,其中3与17、18,18与14′有交叉,52、53可作为阳性对照,因52可与11、12、13、13′、14、14′、17、18同时出现阳性带,53可与4、7、9同时出现阳性带,分型结果见图1、2。
图1略
图2略
肾小球疾病患儿DRB1基因型及基因频率86例肾小球疾病患者与82例正常人HLA-DRB119个位点基因型及基因频率见表2,肾小球疾病组HLA-DRB1ˇ15基因频率为,与正常对照组比较χ2=,,HLA-DRB1ˇ15基因阳性发生急性肾小球肾炎的相对危险性OR为,其他位点两组间差异无显着性,见表2。
表2HLA-DRB1基因频率基因型正常对照组略
3肾小球肾炎患儿临床表现86例急性肾小球肾炎有11例HLA-DRB1ˇ15型,其临床表现浮肿、血尿较非HLA-DRB1ˇ15型重,基因型与临床症状的关系见表3。
3讨论
HLA已经被证实与自身免疫疾病相关联,是参与机体特异性免疫识别和免疫应答的主要成份,已知HLA是机体的正常生理识别和免疫应答的主要成分。
所以HLA与机体正常的生理功能和病理变化有密切关系,是参与机体特异性免疫识别和免疫应答的主要成分,参与免疫调节,约束免疫细胞间的相互作用;参与抗原的处理;参与免疫细胞分化;疾病易感基因学说认为在HLA区域中尤其是HLA-D区域附近可能存在一些疾病易感基因,这些基因的存在可导致某些疾病,但具体是一位点与一种疾病相关,还是多个位点与一种疾病相关,还不能肯定。
我们这一研究旨在探讨小儿急性肾小球肾炎与HLA的相关性。
因为经典的HLA-Ⅱ类基因指的是HLA-DR、-DQ、-DP,其中以DR基因位点最多,且迄今所建立的HLA的DNA分型技术也以对HLA-DRB1多态性的分析最为成熟,故我们将研究重点放在HLA-DRB1上。
表3急性肾小球肾炎组HLA-DRB1ˇ15型与临床表现的关系
对于肾小球疾病,我国儿科应用的分类包括肾小球肾炎、肾病综合征、单纯性血尿或蛋白尿、家族性肾炎等。
我们主要研究了急性肾小球肾炎86例。
国内尚未见有关报道汉族人群小儿肾小球疾病与HLA-DR位点关联的报道。
本文对86例急性肾小球肾炎患儿和82例正常人HLA-DR位点基因的多态性进行调查,结果表明急性肾小球肾炎组HLA-DRB1ˇ15基因频率增高,,86例肾小球肾炎有11例HLA-DRB1ˇ15型,其临床表现浮肿、血尿较非HLA-DRB1ˇ15型重,上述结果证实,吉林省汉族小儿肾小球疾病的发生与HLA-DRB1ˇ15关联。
关于肾小球疾病与HLA关系,最初有人报道小儿原发性肾病综合征与一些HLA-B抗原存在弱相关;1976年国外学者Thomson、1980年Alfiler、1990年Clara分别报道肾病综合征患儿HLA-B12、HLA-DR7较正常对照高。
1999年国内肖露露研究认为成人慢性肾小球肾炎与HLA系统免疫机制强相关[3],HLA-B55、DR10、DQ7可能是广东人群易感慢性肾小球肾炎的风险因子。
1999年许铃娣等实验结果DQB10302等位基因可能与上海汉族IgA肾病的发病有一定关联[4]。
我们的研究有所不同,HLA-DRB1ˇ15可能是吉林省小儿人群肾小球疾病的易感基因,其原因可能在于我们研究的人群和病种有所不同。
通过对患者与正常人的HLA-DR位点的多态性分析,我们对小儿肾小球疾病有了进一步的认识,各个基因型之间的碱基差异虽然不是很大,但可以导致表达的氨基酸不同,最终引起免疫应答的差异等一系列的变化;随着对疾病认识的深入,将为我们治疗疾病提供科学依据。
参考文献
1曹孟德,秦东春,孙含笑.HLA分子生物学及临床应用.郑州:
河南医科大学出版社,1998,148.
2OlleOlerup,henrik typingbyPCRamplificationwithsequence-specificprimersin2hours:
AnalternativetoserologicalDRtypinginclinicalpracticeincludingdonor-recipientmatchingincadaveric Antigens,1992,39:
225.
3肖露露,于立新,陈洪涛,等.慢性肾小球肾炎与HLA免疫遗传强相关联.中华泌尿外科杂志,1999,20:
592.
4许玲娣,范丽安,陈楠,等.原发性IgA肾炎与HLA-DQB1等位基因遗传多态性的研究.免疫学杂志,1999,15:
253.
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