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培养陕西结核病防治研究所
结核菌药物敏感性测定
标准化操作及质量保证手册
国家结核病参比实验室
2010年3月
前言
结核病细菌学检查是结核病控制规划重要的组成部分,随着现代结核病控制策略(DOTS)在我国的广泛实施,以及结核病控制三大目标的全面实现,结核病防治政策与技术策略有了很大的发展,在继续扩展高质量的DOTS的基础上,积极应对耐多药肺结核(MDR-TB)、结核菌/艾滋病病毒(TB/HIV)和其他挑战。
为满足当前结核病防治工作的需要,结核病实验室的工作任务也从之前的以痰涂片镜检发现传染性肺结核病人为重点,扩展到细菌学诊断、耐药结核病诊断等更加广泛的服务领域。
结核分枝杆菌药物敏感性测定(简称)是耐(多)药结核病防治中必不可少的重要工具,其主要作用是诊断耐药结核病、选择和调整耐药结核病治疗方案、开展耐药监测以了解某一地区结核分枝杆菌的耐药水平。
目前耐多药结核病规划性管理(PMDRTB)已在我国部分地区开展了试点,并将以较快的速度在全国扩展。
但在我国公共卫生领域,分枝杆菌药敏试验开展得并不普遍,大部分结核病防治机构的结核病实验室没有相应的经验和技术,缺乏系统的标准化文件,存在标准不一致、操作不规范、质量良莠不齐的问题。
为进一步规范药敏试验的操作,保证工作质量和试验人员安全,国家结核病参比实验室与世界卫生组织合作,编制了本册《结核分枝杆菌药物敏感性测定标准化操作手册》,详细描述结核菌药敏试验各个过程的操作程序。
目前世界卫生组织推荐的药敏试验方法包括比例法、绝对浓度法和液体培养法。
其中比例法为目前我国流行病学监测和耐多药结核病规划管理项目所采用的方法,将在本手册中重点介绍。
绝对浓度法是我国三十多年沿用的药敏试验方法,为目前我国大多数结核病专科医院常规使用的用于临床检测的方法,本手册也有独立章节进行描述,方法引自《中国防痨协会结核病诊断实验室检验规程》。
本手册参考世界卫生组织系列的结核病实验室标准化操作程序(SOP)的主要框架和内容,按照我国结核病规划的实际情况和具体要求进行了调整,并通过在部分省份的试点进一步进行了修改和完善,使之更具有可操作性,供开展药敏试验的实验室使用。
梅里埃基金会和第七轮全球基金结核病项目为本手册的制定和修订提供了支持,世界卫生组织驻华代表处为本手册试点提供了支持,江苏省、辽宁省部分实验室为本手册提供了修改意见。
编者2010年3月
目录
概述5
图1比例法间接法操作流程图6
图2绝对浓度法间接法操作流程图6
第一章药敏试验的基本要求7
第一节实验室设计和环境安全7
第二节实验室设备及耗材7
第三节实验室管理8
第四节个人防护操作程序9
第二章比例法药敏试验标准化操作程序16
第一节培养基的制备16
第二节药敏试验菌株的准备19
第三节菌液的制备21
第四节接种22
第五节培养23
第六节结果的判读和解释23
第七节废弃物处理26
第八节菌株的短时保存和运送26
第三章绝对浓度法药敏试验标准化操作程序28
第一节培养基的制备28
第二节药敏试验菌株的准备29
第三节菌液的制备29
第四节接种29
第五节培养30
第六节结果的判读和解释30
第七节废弃物处理31
第八节菌株的短时保存和运送31
第四章药敏试验质量保证33
第一节实验室网络及职能33
第二节室内质量控制34
第二节室间质量评估37
一、现场评价37
二、药敏试验复检38
三、熟练度测试40
第五章、仪器的使用和维护43
第一节生物安全柜43
一、简述43
二、安装43
三、使用43
四、安全注意事项44
五、甲醛熏蒸消毒44
第二节恒温培养箱44
一、简述44
二、采购与安装45
三、使用步骤和注意事项45
四、质量控制和温度监测45
五、校正45
六、维护45
第三节蒸汽凝固器46
一、基本要求46
二、使用步骤46
三、清洁46
四、注意事项46
第四节天平46
一、基本要求46
二、操作程序47
三、维护47
第五节高压灭菌器48
一、简述48
二、定义和缩写48
三、应用范围48
四、安装48
五、适宜高压灭菌的物品49
六、指示试剂49
七、个人资质49
八、操作程序49
参考文献52
附件53
附件1可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)种或样本运输管理规定53
附件2人间传染的病原微生物名录(节选)57
概述
无论是对临床个体诊断还是对流行病学调查和监测,标准可信的药敏试验方法都是至关重要的。
目前结核病实验室常用的细菌学药敏试验方法包括比例法和绝对浓度法,分别由法国的G.canetti、J.Grossete和德国科学家G.Meissner于上世纪六十年代首先提出。
虽然药敏试验是有着近半个世纪历史的比较成熟的技术,也是结核病细菌学实验室的常规工作,但操作较为复杂、影响因素较多。
从实验室操作角度讲,比例法与绝对浓度法并无很大差别(见比例法操作流程、绝对浓度法操作流程),但由于比例法是通过计算耐药菌比例来解释结果的,对药敏试验中的重要变异因素——接种量进行了一定程度的校正,故结果较之绝对浓度法更为稳定。
无论比例法还是绝对浓度法,都可以使用直接法和间接法的药敏试验。
直接法是指将临床标本进行前处理后,根据涂片镜检的菌量进行稀释,再直接接种到对照和含药培养基上的药敏试验方法,它适用于经显微镜验证含菌量较多的标本。
而间接法则是首先对临床标本进行分离培养,待得到肉眼可见的细菌纯培养物后再进行药敏试验。
直接法的优点是分离培养和药敏试验同时进行,可以比间接法提前3-4周报告结果,缺点是接种量不易量化、难以控制污染。
与之相反,间接法报告结果较慢,但基于纯培养物的操作相对容易控制菌量、结果比较准确污染率较低。
在《中国结核病防治规划实施工作指南(2008)》中,推荐的药敏试验方法为比例法间接法。
本手册主要介绍比例法间接法、绝对浓度法间接法的标准化操作程序,包括培养基制备、菌株的传代和准备、菌液的制备、接种、培养、结果的判读和解释、结果记录和报告、污染物的处理、菌株的保存和运输以及有关仪器设备的使用和维护。
图1比例法间接法操作流程图
图2绝对浓度法间接法操作流程图
第一章药敏试验的基本要求
根据我国《病原微生物实验室生物安全管理条例》、《实验室生物安全通用要求》、《人间传染的病原微生物名录》和《医疗机构临床实验室管理办法》的规定,结核分枝杆菌药物敏感性试验应在符合生物安全二级(Bio-safetyLevel2,BSL-2)或二级以上环境中进行。
实验室所用设施、设备和材料(含防护屏障)均应符合国家相关的标准和要求。
生物安全实验室必须符合以下三个基本原则:
(1)实验室的设计及工程施工必须合理;
(2)需配备相应的安全设备;(3)制定实验室管理制度和规范的操作程序。
第一节实验室设计和环境安全
必须满足国家生物安全二级(BSL-2)实验室标准的要求,主要包括:
1.实验室门应为外开门,应带锁并可自动关闭,实验室的门应有可视窗;
2.在实验室门上应该标有国际通用的生物危害警告标志;
3.实验室墙壁、天花板和地板易清洁、不渗液以及耐化学品和消毒剂的腐蚀,地面应防滑;
4.实验操作台面应能耐热防水,耐消毒剂、酸、碱和有机溶剂的腐蚀;
5.在实验室内部,有在黑暗中可明确辨认的出口指示标识;
6.应有足够的存储空间摆放物品以方便使用,在实验室工作区域外还应当有供长期使用的存储空间。
7.应设洗眼设施或设备,必要时应有应急喷淋装置;
8.有可靠的电力供应和应急照明。
必要时,重要设备如培养箱、生物安全操作柜、冰箱等应设备用电源;
第二节实验室设备及耗材
实验室内至少应配备二级生物安全操作柜、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器、环形加热炉、涡旋振荡器、普通冰箱;如果自制培养基还需要蒸汽凝固灭菌器、蒸馏水制备装置或去离子水制备装置;使用和维护方法详见本手册第五章。
药敏试验所需耗材为培养基、试管架、烧杯、量桶、移液管、接种环、废液缸。
第三节实验室管理
一、组织机构与制度管理
1.实验室所在单位应成立实验室生物安全委员会,法人代表必须为生物安全委员会负责人,实验室负责人必须是生物安全委员会成员。
2.根据本实验室的工作需要、实验室工作类型以及本地的情况,生物安全委员会制定完整的安全政策、安全手册、以及执行安全手册的支持程序、定意外事故处理方案等,并监督实施;
3.实验室应设专人负责实验室安全;
4.实验室中管理制度必须包括准入制度、个人防护制度、标本接收制度、废弃物处理制度、意外事故处理预案、生物安全培训制度、生物安全自查制度、废弃物处理制度、仪器维护维修制度;
二、培训与健康监测
(一)实验员应接受实验室生物安全培训,至少包括;
1.健康潜在危险(结核症状和传播)。
2.小心尽量减少气溶胶的产生,预防暴露。
3.健康要求。
4.佩戴使用保护性设备和衣服。
5.处理潜在的感染性物质。
6.如何预防事故(生物的、化学的、电、火)发生,发生事故要采取的措施。
7.良好的实验室操作程序。
(二)培训应该:
1.在工作开始前时。
2.严格监督。
3.在工作条件改变时。
4.定期复训。
学员应该给予证书证明他们对于培训的理解和培训的操作正确。
(三)健康监测
依据国家法律法规,应该在以下情况下安排结核实验室工作人员进行相关健康监测,并保存监测结果备查:
1.招聘进入结核实验室前。
2.上岗后定期健康监测。
3.任何危险事故后。
4.一旦有结核症状时。
个人的健康记录应该在职业暴露后保存至少10年,根据国家的法律法规。
5.工作人员应该被告知结核的症状,并且一旦出现症状应该能够提供便捷的免费就医条件。
6.根据国家法律法规判定的由于职业暴露于危险物质的疾病或者死亡应该报告给主管机构。
三、实验室操作
1.实验室应制定各种试验操作和仪器设备操作的标准化操作程序;
2.实验员必须接受相关专业知识和操作技能的培训,方能进行试验操作;
3.受过相关培训的实验员操作时,必须符合标准化操作程序;
4.负责生物安全管理的人员,有责任制止不规范操作,以及处理意外事故。
5.严格按照有关规定进行废弃物处理。
四、菌种或样本运输安全管理
为保障人体健康和公共卫生安全,在运输可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)种或样本时,须按照《可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)种或样本运输管理规定》的要求进行审批、包装、运输、操作、保藏和管理,具体见附件。
第四节个人防护操作程序
结核菌培养属于进行分离高致病性病原微生物的操作,实验室实验人员进入培养试验区须穿防护服、鞋套,实验中须戴手套、帽子、防护面罩(N95口罩或过滤式呼吸器)。
针对呼吸道传播的传染病,按照带双层手套的条件下,个人防护物品穿戴顺序:
口罩、帽子、防护服、护目镜、鞋套、双层手套;脱下顺序为:
外层手套、护目镜、防护服、内层手套、帽子、鞋套、口罩[7]。
一、防护服
根据制作材质的不同,防护服可分为一次性防护服和再重复使用的布制防护服,防护服应为联体式或背开式,袖口应为紧袖。
如果是短时参观而不进行操作,按照如下进行穿脱防护装备,出实验室前洗手。
如果进行试验操作而且防护服为背开式,防护服内应穿长袖隔离衣。
(一)布制防护服衣穿脱标准程序
1.穿重复使用布制防护服:
(1)右手提衣领,左手伸入袖内,右手将衣领向上拉,使左手露出。
(2)换左手持衣领,右手伸入袖内,使右手露出。
(3)两手持衣领,由领子中央顺着边缘向后系好颈带。
(4)再扎好袖口。
(5)将隔离衣一边(约在腰下5cm)处渐向前拉,见到边缘捏住。
(6)同法捏住另一侧边缘。
(7)双手在背后将衣边对齐。
(8)向一侧折叠,一手按住折叠处,另一手将腰带拉至背后折叠处。
(9)将腰带在背后交叉,回到前面将带子系好。
2.脱重复使用布制防护服:
(1)解开腰带,在前面打一活结。
(2)解开两侧袖带,将袖带塞入袖袢内,充分暴露双手,进行手消毒。
(3)解开颈后带子。
(4)右手伸入左手腕部套袖内,拉下袖子过手。
(5)用遮盖着的左手握住右手隔离衣袖子的外面,将右侧袖子拉下。
(6)双手转换渐从袖管中退出,脱下隔离衣。
(7)左手握住领子,右手将隔离衣两边对齐,若挂在污染区,污染面向外,否则污染面向里。
(二)一次性防护服穿脱标准程序
1.穿一次性防护服
无论是联体还是分体防护服,先穿下衣,再穿上衣,然后戴好帽子,最后拉上拉锁。
2.脱一次性防护服
(1)脱分体防护服时应先将拉链拉开。
向上提拉帽子,使头部脱离帽子。
脱袖子,脱下上衣将污染面向里放入医疗废物袋。
脱下衣,由上向下边脱边卷,污染面向里,脱下后放入医疗废物袋。
(2)脱联体防护服时,先将拉链拉到底。
向上提拉帽子,使头部脱离帽子,脱袖子。
从上向下边脱边卷。
脱下衣,将污染面向里脱下后放入医疗废物袋内。
(三)注意事项
1.穿防护服之前要检查防护服有无破损。
2.穿防护服后只限在规定区域内进行操作活动。
3.穿着防护服时勿使衣袖触及面部及衣领。
4.防护服有破损应立即更换。
5.脱防护服时要注意避免污染。
二、鞋套/工作鞋
对于进行操作的实验员,应配备实验区内用的鞋;短时参观人员需要进入污染区,应穿鞋套。
1.鞋套的作用:
防止鞋、袜受到样本污染。
防止污染清洁环境。
2.鞋套的选择要求:
鞋套应具有良好的防水性能,并一次性应用。
3.鞋套的应用范围:
从清洁区进入污染区时。
4.鞋套只在规定区域内穿,离开该区域时应将鞋套脱掉。
5.鞋套如有破损时应及时更换。
三、呼吸防护用具
针对结核病实验室应用的有效呼吸防护面罩,包括过滤式呼吸器和生物安全口罩。
过滤式呼吸器特点是不需要做适合度测试(fittest),可以长时间反复使用(使用时间根据使用环境不同而不同),穿戴比生物安全口罩舒适,但价格较高。
生物安全口罩但需要进行适合度测试,佩戴时口罩固定带对面部压迫力度较大,实验员较长时间佩戴会感到不适;生物安全口罩不能长时间使用,而且长时期使用其总的成本并不低。
但由于生物安全口罩的一次性价格较低,所以应用较多,本手册主要介绍生物安全口罩,如果条件允许,也可以使用过滤式呼吸器。
■生物安全口罩有很多种,目前应用最多的是N95口罩。
N95口罩是美国国家职业安全卫生研究所(NIOSH)认证的医用防护口罩。
“N”的意思是指非油性的颗粒物,“95”是指在NIOSH标准规定检测条件下,截获率达到95%,要选择适合自己脸型的口罩,才能有较好的密合性,从而保证佩戴人员的呼吸安全。
只有获得NIOSH认证的呼吸器才能标注NIOSHN95,单独标注N95说明没有获得NIOSH认证
(一)NIOSHN95口罩穿戴方法:
1、将口罩外部朝向掌心放置在手上,口罩鼻片部份朝向指尖,单手手指穿过固定带;
2、将口罩罩在面部;
3、另一只手将上方固定带越过头顶,使其固定于头部上方;
4、将下方固定带越过头顶,固定于两耳下之颈后位置;
5、使用双手压紧鼻片两侧,使与鼻部契合;
6、以双手掌杯形覆盖在口罩上并用力呼气,如果密合不好,会有空气沿着边缘(鼻侧等处)泄漏;
7、如果呼气时空气由鼻侧逸出,请重复步骤5;如仍有空气由口罩四周逸出,应调整固定带位置后,重新检查或更换适合个人脸型之口罩;
8、避免固定带压迫耳朵;
9、当口罩有破损或扭曲、或不能维持较贴和的脸部佩戴时、或者连续佩戴达到4小时、口罩沾上液体,必须马上更换口罩。
(二)NIOSHN95口罩的适合度检测
每个实验员在选择N95口罩时,应进行适合度检测(fittest)以选择合适型号的口罩。
适合度检测的方法和设备产品很多,考虑到成本和可操作性,现以3M公司的测试产品为例进行说明。
1、测试设备和材料主要包括:
(1)头套式面罩
(2)敏感性测试喷雾器
(3)测试喷雾器
2、测试程序
测试前注意事项:
●受试者应了解测试过程中会吸入微量的苦味剂(苯酸苄胺酰铵,Denatoniumbenzoate)。
由于使用浓度极低,在通常使用条件下是安全的。
●受试者在检测前15分钟内不得进食、喝饮料(水除外)或咀嚼口香糖;
●检测原理是通过受试者的味觉是否感受到苦味,从而判定口罩是否适合,因此在测试过程中要求受试者呼吸为张口呼吸,并将舌头适当伸出。
(1)敏感性测试
带上头罩,不佩戴N95口罩,使用敏感性测试喷雾器通过面罩上的管道(正对着口鼻)向面罩内喷测试液,如果被测试人员感觉到测试液的味道,说明此人对测试液敏感,可以进行下一步测试,如果喷入30次受试者仍然感觉不到,应改变测试液或测试方法。
(2)测试试验(约10分钟)
记录被测试口罩生产厂家、型号,准备测试;
摘下面罩,按照上文所述,进行正确的N95口罩佩戴,然后带上面罩。
使用适合性测试喷雾器将适合性测试喷入头罩,次数与敏感性所需次数相同,至少喷10次。
每项测试每隔30秒钟,再将测试液喷入头罩,次数为敏感性所需次数的一半。
●正常呼吸测试:
使用测试喷雾器通过面罩上的管道,向面罩喷测试液,瞩被测试人员进行正常呼吸约60秒,如果被测试人员没有感觉到测试液的味道,进行下一步测试;
●深呼吸测试:
使用测试喷雾器通过面罩上的管道,向面罩喷测试液,嘱被测试人员进行深呼吸约60秒,如果被测试人员没有感觉到测试液的味道,进行下一步测试;
●摇头测试:
使用测试喷雾器通过面罩上的管道,向面罩喷测试液,嘱被测试人员向左向右摇头约60秒,如果被测试人员没有感觉到测试液的味道,进行下一步测试;
●点头测试:
使用测试喷雾器通过面罩上的管道,向面罩喷测试液,嘱被测试人员进行低头和抬头约60秒,如果被测试人员没有感觉到测试液的味道,进行下一步测试;
●言谈测试:
使用测试喷雾器通过面罩上的管道,向面罩喷测试液,嘱被测试人员持续说话约60秒,如果被测试人员没有感觉到测试液的味道,进行下一步测试;
●运动测试:
使用测试喷雾器通过面罩上的管道,向面罩喷测试液,嘱被测试人员进跳跃运动约60秒,如果被测试人员没有感觉到测试液的味道,进行下一步测试;
●正常呼吸测试:
使用测试喷雾器通过面罩上的管道,向面罩喷测试液,嘱被测试人员进行正常呼吸约60秒,如果被测试人员没有感觉到测试液的味道,进行下一步测试;
●记录各项测试报告结果,测试人员和被测试人员签字确认。
生成测试记录,存档备查。
如果以上任何一个步骤被测试人员闻到测试液的味道,则适合度测试不合格,这种型号的口罩不适用于被测试人员。
四、手套
1.手套的作用:
预防样本、试验物品上的病原微生物传播给实验室人员。
在接触病人的样本时,或接触实验室污染物品时应戴手套。
2.戴手套原则:
戴手套之前应检查手套气密性,用手将手套手掌部撑开后,抽出手后将握紧手套腕部,逐步挤压手套手掌部分、手指部分,观察手套是否膨胀而不漏气。
手套腕部应罩住防护服腕部。
3.脱手套方法
(1)一手捏住手套污染面的边缘将手套脱下。
(2)用脱下手套的手指插入另一只手套清洁面(内面)的边缘,将手套脱下。
4.注意事项
(1)操作完成后脱去手套,必须按规定程序与方法洗手,戴手套不能替代洗手,必要时进行手消毒。
(2)戴手套操作中,如发现手套有破损时应立即更换。
五、帽子
1.帽子的作用:
主要预防医务人员头发受到感染性物质污染,预防微生物通过头发上的灰尘、头皮屑等途径污染环境和物体表面。
2.帽子的分类:
根据制作材质的不同,帽子可分为一次性帽子及布类帽子两类。
3.注意事项
(1)布制帽子每次试验结束后更换,高压后清洁。
(2)如被样本或污染物质污染时应立即更换。
(3)一次性帽子不得重复使用。
(4)每次戴帽子应将头发置于帽子内。
六、手卫生
手卫生是指所有手部清洁行为的通称,包括洗手、卫生手消毒和外科手消毒。
这里只介绍洗手和卫生手消毒。
洗手是指用普通或者抗菌肥皂(皂液)和流动水洗手,清除手部皮肤污垢和暂居菌的过程。
卫生手消毒是指使用速干手消毒剂(主要为酒精擦手液即揉搓手,减少手部暂居菌的过程,无需冲洗或干手设备。
(一)洗手
1.采用流动水洗手,使双手充分浸湿;
2.取适量皂液,均匀涂抹至整个手掌、手背、手指和指缝;
3.认真揉搓双手至少15秒钟,应注意清洗双手所有皮肤,清洗指背、指尖和指缝,具体揉搓步骤为:
(1)掌心相对,手指并拢,相互揉搓;
(2)手心对手背沿指缝相互揉搓,交换进行;
(3)掌心相对,双手交叉指缝相互揉搓;
(4)右手握住左手大拇指旋转揉搓,交换进行;
(5)弯曲手指使关节在另一手掌心旋转揉搓,交换进行;
(6)将五个手指尖并拢放在另一手掌心旋转揉搓,交换进行;
(7)对手腕的清洗。
4.在流动水下彻底冲净双手,用纸巾或烘手机干燥双手。
(二)手消毒
脱去手套后,医务人员手无可见污染物时,可以使用速干手消毒剂消毒双手代替洗手。
具体方法是:
1.取适量的速干手消毒剂于掌心;
2.严格按照洗手的揉搓步骤进行揉搓;
3.揉搓时保证手消毒剂完全覆盖手部皮肤,直至手部干燥,使双手达到消毒目的。
第二章比例法药敏试验标准化操作程序
第一节培养基的制备
推荐用于分枝杆菌药敏试验的基础培养基为中性改良罗氏培养基。
一、设备和材料
1.天平(灵敏度为0.01g)
2.分析天平(灵敏度为0.0001g)
3.称量匙或勺、称量纸
4.高压灭菌器或电炉
5.PH计
6.蒸汽凝固器(带有斜面隔架)
7.培养基分装机或简易分装装置
8.打蛋器
9.水浴
10.培养管(螺旋盖)
11.广口瓶、锥形瓶、量桶、刻度吸管
12.镊子
13.消毒纱布、漏斗(过滤混匀的鸡蛋)
14.棕色瓶
15.培养基制备的一般仪器和玻璃容器
二、试剂和溶液
1.70%乙醇
2.2%孔雀绿溶液,单独配制
∙孔雀绿染料2g
∙灭菌去离子水100ml
使用无菌技术溶解染料于灭菌去离子水中(放置于36°C温箱中1-2小时)或者在水浴中加热。
配制好的溶液储存于深色瓶中。
此溶液长时间放置并不稳定,如果发生沉淀,应丢弃并重新配制。
3.二甲基甲酰胺试剂:
用于溶解水溶性较差的抗结核药。
4.表2-1培养基盐溶液
成份
改良L-J,(IUATLD/WHO)
磷酸二氢钾(KH2PO4)
2.4g
硫酸镁(MgSO4·7H20)
0.24g
枸橼酸镁(Magnesiumcitrate)
0.6g
L-半胱氨酸(L-Asparagine)
3.6g
谷氨酸钠(Sodiumglutamate)
─
蒸馏水
600ml
甘油(Glycerol)
12ml
鸡蛋匀液
1000ml
2%孔雀绿(Malachitegreen)
20ml
pH值
6.8
将各种盐类成分溶解于灭菌蒸馏水中,煮沸30分钟或者121°C灭菌30分钟,制备成盐溶液,冷却待用。
三、基础液的制备
1、清洁、消毒桌面。
2、用肥皂水清洁鸡蛋,并用70%乙醇擦洗,晾干。
3、鸡蛋开口,打入灭菌的
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