产普鲁兰降解酶菌株的分离筛选及酶学特性的研究 建平中学 蔡羽洁.docx
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产普鲁兰降解酶菌株的分离筛选及酶学特性的研究建平中学蔡羽洁
科学论文
个人项目
11年级
产普鲁兰降解酶菌株的分离筛选
及酶学特性的研究
高中
产普鲁兰降解酶菌株的分离筛选及酶学特性的研究
摘要:
I型普鲁兰酶(EC3.2.1.41)能够专一水解普鲁兰多糖α-1,6糖苷键,在工业、食品业、医疗保健等行业中具有重要的应用意义。
本研究采用唯一碳源法从稻田来源的土样中培养筛选到若干株产普鲁兰降解酶的菌株,并通过16SrDNA序列分析鉴定了其中的产酶菌株Ps-1为假单胞菌属。
该菌株在可溶性淀粉为底物诱导条件下表达,摇瓶发酵产普鲁兰酶的水平达到15U/mL。
该酶的最适酶活反应温度为60℃,最适酶活反应pH为6.0,具有良好的温度稳定性和适应性;适应工业发展的需求。
通过TLC和HPAEC方法鉴定该菌株所产的普鲁兰酶为I型普鲁兰酶,能够专一水解普鲁兰多糖中的α-1,6葡萄糖糖苷键产生麦芽三糖。
将Ps-1所产普鲁兰酶与淀粉糖化酶协同糖化淀粉比单一添加糖化酶的实验组别具有更高的葡萄糖含量,两酶协同作用更利于高葡萄糖产物的制备,具有一定的工业应用价值。
关键词:
普鲁兰降解酶;I型普鲁兰酶;酶学特性;假单胞菌属;
一、研究背景
普鲁兰降解酶(pullulandegradingenzymes)是一种能够专一水解普鲁兰多糖和相应低聚糖中的α-1,6葡萄糖糖苷键以及特定位置的α-1,4葡萄糖糖苷键,生成麦芽糖及麦芽三糖等产物糖基水解酶[1]。
它广泛的分布于动物、植物、真菌、酵母和细菌中。
根据IUBMB(InternationalUnionofBiochemistryandMolecularBiology)建立的两类分类标准[2](催化反应和底物特异性)把普鲁兰降解酶分成四类(见下图):
不同类型的普鲁兰降解酶鉴定标准如下表:
普鲁兰降解酶分类
酶学分类编号
水解键类型
水解普鲁兰多糖产物
γ-淀粉酶
EC3.2.1.3
外切酶
葡萄糖
新普鲁兰酶
EC3.2.1.135
α-1,4糖苷键
潘糖(三糖)、少量单糖
异普鲁兰酶
EC3.2.1.57
α-1,4糖苷键
异葡糖基麦芽糖(三糖)
I型、II型普鲁兰酶
EC3.2.1.41
α-1,6糖苷键
麦芽三糖
其中I型普鲁兰酶能够专一水解1,6糖苷键,与α-淀粉酶、β-淀粉酶等协同作用可以将最小单位的支链分解,最大限度的利用淀粉原料。
因此,它在淀粉加工工业中有着重要的用途。
比如:
I型普鲁兰酶与淀粉酶并用生产高葡萄糖浆、超高麦芽糖浆[3]、提高啤酒中的发酵度[4];在食品、医药化妆品、分析化学等领域,能够逆向合成麦芽糖基-α-环糊精,相比目前广泛应用的环糊精,无任何毒性与溶血性;普鲁兰酶将支链淀粉转变成具有很好的抗水性和成膜性的直链淀粉,有望用于可食性包装膜的生产,解决“白色污染”问题;除此之外,采用普鲁兰酶将各类淀粉脱支后再糊化老化处理可增加抗消化淀粉的含量,后者对人体血糖水平、肥胖、癌症、脂质代谢和能量等方面有重要生理功能[5]。
普鲁兰酶极大的提高了淀粉资源的利用率,然而目前国内外分离产普鲁兰酶菌的产酶酶活较低,产酶水平一般为2~5U/mL;且这些产酶菌主要来源于芽孢杆菌属和克雷伯菌属[17,18]。
淀粉加工时通常采取50~55℃的反应温度,这就对普鲁兰酶在该温度下的物理化学的稳定性提出了较高的要求。
筛选新型高酶活、具有一定热稳定性的普鲁兰降解酶,具有重要的应用意义。
二、材料与方法
2.1实验材料
2.1.1样品
2014.08采自上海市南汇区稻田土壤、污泥及菜地土壤。
2.1.2引物
引物名称
用途
序列
27F
扩增16SrDNA
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
1492R
扩增16SrDNA
TACCTTGTTACGACTT
519F
16SrDNA测序引物
CAGCAGCCGCGGTAATAC
2.1.3实验主要试剂
1)酶类、DNAMarker、试剂盒
Taq酶和Pfu酶、博大胶回收试剂盒
2)主要生化试剂
普鲁兰多糖、马铃薯淀粉、直链淀粉、等多糖购于Sigma公司;发酵时使用的可溶性淀粉购于市场;磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠、DNS试剂、柠檬酸、柠檬酸三钠等试剂为国产分析纯试剂;PCR引物和DNA测序由上海英潍捷基生物技术有限公司完成。
3)培养基
LB培养基:
1.0%蛋白胨,0.5%酵母膏,0.5%NaCl,pH7.0~7.2;
平板富集培养基:
普鲁兰多糖3.0g,(NH4)2SO45.0g,KH2PO40.5g,MgSO4·7H2O0.1g,琼脂糖20.0g,加水至1000mL,pH值6.0。
菌种分离培养基:
蛋白胨10.0g,牛肉膏3.0g,NaCl5g,加水至1000mL,pH值6.0。
产酶种子培养基:
可溶性淀粉1.2%,蛋白胨0.8%,酵母粉0.2%,MgSO4·7H2O0.05%,KH2PO40.1%,pH7.0。
产酶发酵培养基:
可溶性淀粉1.5%,蛋白胨1.0%,酵母粉0.5%,MgSO4·7H2O0.05%,KH2PO40.1%,pH7.0。
2.2实验仪器
PCR扩增仪:
T-100PCRExpress,Thermo-Electric公司
生化培养箱:
SPX-250B上海博讯医疗设备厂
TGL-16G型台式高速离心机,上海医用分析仪器厂
721分光光度计,上海第三分析仪器厂
紫外凝胶-显微成像仪和扫描仪为上海复日生物技术研究所研制
分析软件为SmartViewTM电泳图像分析系统
Bio-Rad酶标仪
漩涡混合器、电子天平、超净工作台、隔水式电热恒温培养箱、电热恒温水浴锅、1.56kg/cm2高压蒸汽灭菌锅、显微镜、DNA电泳仪
电热恒温培养箱
2.3实验方法:
2.3.1菌种筛选、分离和纯化方法
普鲁兰酶产生菌的初筛:
取10g土样加入到装有90mL无菌水和玻璃珠的三角瓶中,振荡30min,使样品充分打散后,吸取100µL悬浮液稀释后分别涂布于LB平板和以普鲁兰多糖为唯一碳源的平板富集培养基上,30℃温箱中培养48h。
从富集培养基上挑取不同形态单克隆各2个接于菌株分离培养基上,并对挑取的单克隆进行反复纯化供复筛使用。
随后,将平板保存纯化后的菌种接入产酶种子液体培养基中,30℃振荡培养24h后,制得菌悬液。
将菌悬液以5%接种量接入产酶发酵培养基,30℃振荡培养48h,初步测定发酵液上清中普鲁兰降解酶的酶活。
2.3.2菌株16SrDNA分析
(1)产普鲁兰降解酶菌株基因组DNA抽提方法:
离心收集3mL过夜培养的菌体,无菌水洗去残留培养基成分。
震匀菌体,加入200µL裂解液(100mMNaCl,1mMEDTA,20mMTris-HClpH7.0,0.5%NonidetP40,使用前加入0.1mg/mLPMSF),加入0.3g玻璃珠和200µL酚/氯仿/异戊醇(25:
24:
1),漩涡震荡3min。
加入200µLTE(pH8.0),漩涡震荡3min。
12000rpm离心5min,收集上清。
用无水乙醇沉淀(约30min),12000rpm离心5min,小心弃去上清,烘干,加入100µL的TE(pH8.0)。
再加入3µLRNaseA,37℃温浴30min。
加入10µL3MNaAc和1mL无水乙醇沉淀。
12000rpm离心10min,烘干,加入70~100µLTE(pH8.0)溶解。
(2)PCR扩增菌株16SrDNA基因:
本实验采用细菌16SrDNA通用引物(27F和1492R)进行PCR扩增。
PCR扩增条件为:
95℃5min,1个循环;(94℃30s,50℃30s,72℃2min)30个循环;72℃10min,1个循环。
PCR扩增产物纯化后送至上海英潍捷基生物技术有限公司DNA测序(使用测序引物为519F)。
2.3.3Ps-1菌株所产普鲁兰降解酶酶活力测定方法
DNS还原糖法测定普鲁兰酶的酶活:
取10μL稀释的酶液(或原液)加入90μL含1%的普鲁兰多糖的20mMTris-HCl缓冲液(pH8.0),60℃反应10min,加入100μLDNS终止反应,煮沸10min显色;以10μL煮沸灭活的酶液为空白对照,570nm测定吸光值,根据标准曲线计算产生还原糖的量,每组反应做3个平行样品。
酶活单位定义:
在此条件下,每分钟释放1μmol还原糖(以葡萄糖计)定义为一个酶活力单位(U)。
2.3.4Ps-1菌株所产普鲁兰酶的酶学特性分析
2.3.4.1酶促反应中pH对酶活力的影响
分别配制含1%普鲁兰多糖的pH3.0~10.0的缓冲液,其中pH3.0~6.0为20mM柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液,pH7.0为20mM的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液,pH8.0~10.5为20mM的Tris-HCl缓冲液,pH11.0为20mM的甘氨酸-NaOH缓冲液。
取含有底物的缓冲液90L与10L稀释后的酶液一起在水浴中60℃反应10min。
测定普鲁兰酶活力,其中酶活力最高的设为100%。
2.3.4.2酶促反应中温度对酶活力的影响
将10L稀释后的酶液与90L含1%普鲁兰多糖的Tris-HCl中(pH8.0)混匀,分别在20,30,40,50,60,70和80℃温度下反应10min,然后用DNS法测定普鲁兰酶活力,其中酶活力最高的设为100%。
2.3.4.3酶的热稳定性测定
将适量的酶液放置在55℃、60℃和65℃下恒温水浴中,每隔15min取样测定剩余酶活力,以保温0min时的酶活力计为100%
2.3.4.4底物专一性的测定
用20mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)配制1%的普鲁兰多糖、马铃薯淀粉、直链淀粉,取10L稀释后的酶液与90L底物混合,于60℃反应10min,用DNS还原糖法测定普鲁兰酶对不同底物的水解酶活。
将其水解普鲁兰多糖的能力设为100%,计算其水解淀粉、糖原等多糖的能力。
2.3.5薄层层析和离子色谱(HPAEC)分析普鲁兰酶水解普鲁兰多糖产物
薄层层析用于分辨不同聚合度的寡糖,以检测普鲁兰降解酶对普鲁兰多糖底物的水解方式和水解产物。
10L酶液加入到90L的底物(含1%普鲁兰多糖的20mMTris-HCl缓冲液,pH8.0),60℃反应3h,取2~3µL水解后样品点样于Silicagel60F254板上,吹干后将硅胶板放置在丁醇/乙醇/水(5:
3:
2)展层液中展2~3次。
展层结束后,在硅胶板上喷上甲醇/浓硫酸(9:
1)显色液,于110℃烘干显色5min。
将上述反应后的酶解液稀释2000倍,取1mL上样于色谱柱,使用Dionex600离子色谱分析系统检测酶解液的组成,稀释2000倍的1%的麦芽三糖作为标准品。
HPAEC洗脱条件:
在100mMNaOH中以0~250mM醋酸钠梯度洗脱30min,流速为1mL/min。
2.3.6普鲁兰酶与淀粉糖化酶对淀粉的协同糖化作用
配置5%的马铃薯淀粉浆液,使用NaOH调节其pH为6.5。
用20U/g的耐热α-淀粉酶于90℃对淀粉浆液进行液化,人工搅拌至碘色为棕色。
A组对照组中在淀粉液化液中只添加300U/g的淀粉糖化酶(水解淀粉中的α-1,4糖苷键,对α-1,6糖苷键水解效率低);B组对照组同时添加300U/g的淀粉糖化酶和发酵表达的普鲁兰酶。
将上述A、B组糖化6h样品稀释10000倍,取1mL上样色谱柱,使用Dionex600离子色谱分析系统检测糖化后的产物情况。
三、研究结果
3.1产普鲁兰酶菌株的分离和筛选
普鲁兰降解酶广泛存在于多种微生物中,而土壤是微生物群落结构最为丰富的生境之一,因此本研究从稻田土壤、菜地土壤中取样,进行普鲁兰降解酶的筛选。
根据前期的文献报道,产普鲁兰酶菌株多为厚壁菌门、γ-变形菌门,这些门的细菌多分布在氮源丰富的土壤中,我们的采样地具有丰富的氮源,具有一定的代表性。
采样后,对处理后的土壤样品通过唯一碳源的方法进行筛选,筛选到若干株能在普鲁兰富集平板上能够生长的菌株。
其中一株产酶菌株Ps-1通过发酵条件的优化(培养基pH、培养温度、培养时间),在培养基pH值7.5,培养温度30℃,培养48h条件下,其摇瓶发酵产生的普鲁兰酶的酶活达到15U/mL。
图1.唯一碳源法富集产普鲁兰降解酶菌株
3.2产普鲁兰降解酶菌株的鉴定与分类
根据细菌16SrDNA分类标准,16SrDNA序列相似度大于等于99%可初步认为是同一种细菌。
通过PCR扩增Ps-1菌株基因组16SrDNA序列,获得的序列与GenBank数据库中已知的微生物16SrDNA序列进行同源性比对,结果表明其与Pseudomonasmendocina菌种相似度为99%。
使用显微镜观察该菌株的显微形态和菌落形态(如图2)。
该菌株显微形态为短杆菌;在LB平板上菌落粘稠容易长成菌苔,菌落圆形,微白色透明,边缘光滑,菌落中间凸起。
该菌落形态与显微形态的特征与假单胞菌属细菌形态特征相符合。
图2.Ps-1菌株的菌落形体及显微形态图
3.3普鲁兰酶催化分类分析
不同种类普鲁兰降解酶能够水解不同的糖苷键,并生成不同的产物,因此在各个行业中的应用也不尽相同,鉴定标准[7]如表1。
为了更好得了解Ps-1菌株所产普鲁兰酶的催化分类,我们通过薄层层析(TLC)和离子色谱(HPAEC)方法鉴定普鲁兰酶降解普鲁兰多糖的水解方式和最终产物。
TLC的结果如图3所示:
在水解最初5min三糖产物较少,随着时间的延长三糖产物逐渐增多,多聚合度的糖链逐渐缩短,该图表明该酶水解普鲁兰多糖的作用方式为内切,得到的终产物为三糖。
普鲁兰降解酶分类
降解普鲁兰多糖产物
I型、II型普鲁兰酶
麦芽三糖
新普鲁兰酶
潘糖(三糖)
异普鲁兰酶
异葡糖基麦芽糖(三糖)
γ-淀粉酶
单糖
表1.普鲁兰降解酶酶学分类鉴定标准
图3.薄层层析分析普鲁兰酶水解普鲁兰多糖的产物
1.单糖、双糖、三糖标准品;2.未水解的普鲁兰多糖(对照);
3~6.分别使用Ps-1水解普鲁兰多糖不同时间的水解产物
(泳道3:
5min;4:
10min;5:
15min;6:
20min;)。
由于异普鲁兰酶一般存在于真菌中,TLC的结果表明表达的普鲁兰酶可能为I型、II型普鲁兰酶或者新普鲁兰酶。
为了进一步鉴定该普鲁兰降解酶的催化分类,本研究采取HPAEC的方法对其水解普鲁兰多糖的所得的三糖产物进行了鉴定。
通过标准加入法分析,结果表明该酶水解普鲁兰糖三糖产物的色谱峰与麦芽三糖标准品的峰发生重叠,形成单一峰(如图4箭头所示),这一结果说明Ps-1所产普鲁兰酶水解普鲁兰多糖的产物是麦芽三糖,因此该酶的催化分类属于I型或II型普鲁兰酶。
图4.Ps-1所产普鲁兰酶水解普鲁兰多糖产物的离子色谱分析
t/min
I、II型普鲁兰酶都能够水解普鲁兰多糖中的α-1,6糖苷键,产生麦芽三糖。
两者的区别在于:
当使用淀粉为底物时,I型普鲁兰酶只能水解淀粉的分支连接处的α-1,6糖苷键;而II型普鲁兰酶能够同时水解淀粉中的α-1,6糖苷键和α-1,4糖苷键,使用II型普鲁兰酶水解淀粉2h便可得到单糖、二糖、三糖等产物[8]。
如图5所示,使用该酶水解淀粉12h的水解产物仍为多糖,并未获得聚合度小于4的寡糖,此结果表明本文中的普鲁兰酶为I型普鲁兰酶。
图5.薄层层析分析普鲁兰酶水解淀粉的产物
1.单糖、双糖、三糖标准品;2.未水解的普鲁兰多糖(对照);3.未水解的淀粉(对照)
4~8.使用Ps-1所产普鲁兰酶水解淀粉12h的水解产物
3.4普鲁兰酶的酶学特性分析
3.4.1最适反应温度
图6为不同反应温度条件下测定的普鲁兰酶的酶活力。
结果表明普鲁兰酶的最适反应温度均为60℃。
反应温度在50℃~60℃时,相对酶活保持在90%左右。
以60℃时的酶活性为100%,当温度高于65℃时,酶活力下降较快。
图6.普鲁兰降解酶最适反应温度
3.4.2最适pH值
在不同pH缓冲液(pH3.0~10.0)条件下测定的普鲁兰酶酶活力,以最适pH酶活力值为100%,计算各个反应pH时相对酶活。
结果表明:
普鲁兰酶在pH6.0~10.0的范围内酶活均在80%左右;在pH5.0时,普鲁兰酶均保留60%左右的酶活。
图7.普鲁兰降解酶最适反应pH
3.4.3热稳定性分析
为了评估普鲁兰酶的热稳定性,首先将适量的酶液放置在55℃和60℃下恒温水浴中,每隔15min取样测定剩余酶活力,以保温0min时的酶活力计为100%。
图8的结果表明:
在55℃条件下处理1h,普鲁兰酶的酶活均基本保持不变;由于淀粉加工时通常采取50~55℃的反应温度,该酶的在这一温度下的物理化学的稳定性符合工业发展的需求。
图8.普鲁兰酶的热稳定性分析
3.4.4底物特异性分析
随后,我们测定了普鲁兰酶水解不同底物的能力。
结果表明普鲁兰酶水解淀粉的能力约为水解普鲁兰多糖的14%~16%,不能水解直链淀粉等底物。
3.5.普鲁兰酶对马铃薯淀粉的糖化作用
通过Ps-1菌株所产普鲁兰酶与淀粉糖化酶协同作用检测其对淀粉的糖化程度。
配置5%的马铃薯淀粉浆液,使用α-淀粉酶对淀粉浆液进行液化。
A组对照组中在淀粉液化液中只添加淀粉糖化酶(水解淀粉中的α-1,4糖苷键,对α-1,6糖苷键水解效率低);B组对照组同时添加淀粉糖化酶和普鲁兰酶。
随后,我们通过HPAEC检测普鲁兰酶与淀粉糖化酶对淀粉协同糖化后的水解产物。
图10为同时添加糖化酶和普鲁兰酶对淀粉液化液协同水解6h后产物分析图谱;结果表明同时使用两种酶具有很好的效果,所得糖产物都为葡萄糖,并未检测到多余的三糖组分。
因此,在工业应用中同时使用两种酶将对葡萄糖浆等产物的制备具有更高效的作用。
图10.HPAEC分析普鲁兰酶水解淀粉产物
四、讨论与展望
淀粉是绿色植物光合作用的产物,由直链淀粉和支链淀粉构成。
其中直链淀粉主要通过α-1,4葡萄糖糖苷键连接而成,而支链淀粉还含有分支链,连接分支处的是α-1,6葡萄糖糖苷键。
淀粉是目前最为广泛应用的工业原料之一,比如制备葡萄糖浆、高麦芽糖浆等等。
然而由于淀粉中含有约4%~5%的α-1,6糖苷键,使用α-淀粉酶(水解α-1,4糖苷键)无法彻底水解淀粉,影响了淀粉水解度的提高。
I型普鲁兰酶(EC3.2.1.41)以内切方式水解普鲁兰糖或淀粉的α-1,6葡萄糖糖苷键[7],因此I型普鲁兰酶具有很重要的工业应用价值。
工业上利用α-淀粉酶和普鲁兰酶协同作用能够彻底水解淀粉,制备高葡萄糖浆、超高麦芽糖浆、提高啤酒发酵度等;另外,将普鲁兰酶直接作用于淀粉能够生产高直链淀粉、缓慢消化淀粉,这些产物在食品、环保、医疗行业中都具有重要的作用。
本研究从稻田来源的土壤中筛选到产酶酶活较高的菌株Ps-1,通过对其发酵条件优化,该原始菌株摇瓶发酵上清液中普鲁兰酶酶活约15U/mL,酶活较国内筛选到的普鲁兰酶高出数倍[21-23]。
在各类普鲁兰降解酶中,I型普鲁兰酶作用最直接,能够专一切断淀粉中α-1,6糖苷键,具有广阔的工业应用价值。
通过TLC和HPAEC方法鉴定Ps-1所产的普鲁兰酶为I型普鲁兰酶,能够水解淀粉和普鲁兰多糖中的α-1,6糖苷键,该酶可应用于以淀粉质为原料的加工业中。
五、结论
1.从稻田、菜地土壤和污泥样品中筛选到1株能够降解普鲁兰多糖的菌株Ps-1,通过对该菌株发酵条件优化,在发酵温度30℃,pH7.5,发酵48h条件下,器产酶量达最高,分泌表达的普鲁兰酶达到15U/mL。
2.通过形态观察及16SrDNA序列分析,鉴定Ps-1菌株来源于假单胞菌属。
3.用TLC和HPAEC方法鉴定了Ps-1所产普鲁兰酶为I型普鲁兰酶(EC3.2.1.41),能够水解淀粉和普鲁兰多糖中的α-1,6葡萄糖糖苷键,不能水解只含有α-1,4葡萄糖糖苷键的直链淀粉。
4.利用普鲁兰酶和淀粉糖化酶协同作用水解淀粉,能够制备具有更高的葡萄糖含量的产物。
6、收获与体会
产普鲁兰降解酶菌株的分离筛选及酶学特性的研究这一课题项目的完成,对我最大的影响便是让我学会了以严谨的科学态度和全新的视角去看待问题,同时它很好地培养了我擅问的习惯。
一年多前,微生物学领域对我来说还是一个完全陌生的领域。
但在一次次的不理解、上网搜索新名词的定义、弄懂;一次次地产生新想法、询问辅导老师、对课题进行改进、积累经验的过程中,我一步一步前进着,渐渐熟悉了菌株分类筛选的相关实验技能与知识。
古人曰:
“擅思者擅问。
”在思考中产生疑问,在问题里引发思考,生活的每个细节就变得有价值。
最后我还想感谢很多人。
感谢我的辅导老师给予的帮助,感谢一路走来评审老师们给予的建议,感谢学校提供给我开阔眼界的机会,感谢一直支持我的父母和朋友。
是你们的鼓励帮助和支持,才能让我一直坚持到完成项目。
谢谢你们!
七、参考文献
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