应力负荷对成人关节软骨组织代谢的调控分析.docx
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应力负荷对成人关节软骨组织代谢的调控分析
应力负荷对成人关节软骨组织代谢的调控分析
上海第二匿科走学博士学位论文
庶力负荷对成人关节软骨组织代谢的调控研究中文摘要
【目的】骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是导致成人,尤其是老年人局部或全身性美节功能受限的最常见原因,它发生缓慢,且症状不明显,并随着年龄的增加甬逐渐加重。
成人较曹楚于错综复杂的理化因素相互作用的环境之中,关节款学是承重荧节载祷的器面,机体活动时将承受各种不同的负荷,并产生相应的形变。
以往人们较为注重化学因素对其正常新陈代谢的影响,但是近期的动物试验研究表明应力繇境改变对于软骨代谢的影响是#}常明显妁。
本单位叁行设计了一套较专科学的加栽系统跨体玲妖学缎织块进行加载处理,通过其细胞外基质中胶原分子形态与代谢的不同反应,以及各种相关基因mRNA表达的检测来诠释不同性质应力对于软骨组织代谢过程的影响。
为穗床骨与关节痰病,特别是OA的发病机理的阕述提供理论/g-N。
【方法】本单位设计了一套较为科学的加载系统,在体外对6例平均年龄为65.6岁的因股骨颈骨折而行全髋关节置换术患者的股骨头关节软骨进行分析;实验中将荧节软骨组织块加工成一定死何形状,筹砖英进行芩同频率(OHz,O+OIHz,0。
lHz及lI-Iz)、不同载荷/i&.(OMpa,0.5Mpa,1Mpa以及1.5Mpa)的压应力处理,我们通过与参照实验(螺旋测微仪定量施压法)进行比较,并通过线槛回归加以分析,对两稀加裁方法的测量结果加双比较。
上海第二医科大学博士学位论文
另取6例同样经过筛选的成人股骨头荚节软骨标本,平均年龄66岁,给予与上述一致的力学楚壤分数。
通过原位杂交、免疫组侣、天狼鼗虹染色以及撩搓、透射电镜来观察Il、飘l型I;l曼原的表达在动、静力组不同程度应力作用下的变化情况。
通过反转录.聚合酶链反应法来观察不同应力条件下蛋白多糖、整合索受俸、细胞骨架蛋白汉及凋亡耨关基因的mRNA表达斡影响。
【结果】通过鑫行设计姆加载系统在加栽意对关节软骨造成的彩变率与传统的螺旋测微仪加载法结果基本相同,且前者反应数据稳定性的指标要明显优于后者。
在应力作簿下至I黧胶愿的合成佼裔与照力负荷的竣率、栽赞砖大小均贲联系;申低频度力对其表达有一定的正畦调节作用,而静止力与高频应力负荷将对其合成代谢有一定的抑制作用;而就械荷值本身而言,其对II烈胶原的表迭起到正性调节谗褥,但是由手其对组织酌耪理破环,在高旖组时祷显示两种效应绽合詹始奏蛙结果。
对于III型胶原,发现在正常对照组也有一定的表达。
在中、低频组,乃至静止力及高频组的低、中荷组,其仍表现为低水平表透,秀纂本低于对照缎水乎;而在静盘应力酌高荷纽以及高频高祷纽则表现出瀑著砖对Ⅱl挺胶熙mRNA表达转正桂谡节作用。
在电镜下,我们发现在对照组与中、低频,中、低荷处理组,
软骨细藏形态基本正常,但是细跑器没有表达丰富的现象盎现
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(这是由于本文材料来源于老年人的缘敌)。
而在其他缝理纽中渐次出现一些不良变化:
胞核出现变性,染色质分布不均,并出现固缩豌象;胞浆电子密度增加,疵琬大簧的脂滴样空泡;胞膜出现不连续,细胞周围有大赞的致密颗粒沉着;点至细胞崩解消失。
天狼猩红染色结果中发现,在这种定性的特殊染色法中,处理对于软骨基蒴的损伤作用在程度上要低于电镜观察结果。
对Aggrecan核心蛋白mRNA的检测结果显示各处理组均有表述,与对慧鳃相比,中、低频组各载荷谯组均有不同程度的表达增加;高频纽中、低荷组也表现为正性调节,但在高频高待鲤表达量辞落剐对照纽水平。
盍静正蕊应力纽,在低荷组尚能维持与对照组的捆似表达,但是随着频率的上升,其表达量有着显著的下降。
在61.Integrin与Ij-actin的mRNA的表达上,两者砖应力负荷的反应情况较为一致。
静血力离荷组未显示口1一IntegrinmRNA的表述;静力组的表达量宥明显的下降,高频组仅在低荷时表现为与对照组相彷;在申、低频纽总体而言楚一种正性调节作用,并以低频组促进作用更为明虽;但是到高黄组时都有回落趋势。
静力高荷组未显示13-Actin的mRNA表这,中、低频组表现为促进作用,但在巍荷组有下调现象;在高频纽低、中荷组袭达基本与对照组持平,蓟了离荷组则出现了负性调节作用;静止力组基本表现为抑制作用。
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各组均有不同程度的Caspase一3mRNA的表达。
对照组标本显示低水平表达,而中频各组表达与对照组无明显差别;在静止应力组,以及高、低频组则有较强的表达,就其表达强度而言,各载荷值的组间差异不大。
【结论】我们自行设计的加载系统对于体外软骨组织块的力学研究而言,可以说是一种升级改良产品。
对于软骨组织的合成代谢,诸如Ⅱ型胶原、聚集素、整合素以及细胞骨架蛋白等,静止力基本表现为负性调节作用,而载荷值对其的综合效应为负相关关系,单纯的循环压力对合成代谢有正性调节作用。
对于软骨的非特异的或是反应分解代谢的指标,诸如III型胶原与凋亡相关基因,则是在静止力组表现得较为敏感,负荷对其表逸表现为正性调节,在其他处理组则基本无显著改变。
【关键词】应力负荷成人关节软骨原位杂交表型
电镜天狼猩红凋亡加载系统
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ThemodulationeffectofbiomechanicalloadstothemetabolismofadukarticularcartilageexplantsAbstract
objective:
Osteoarthritis(0A)isthemostc01331110ncauseoflocalorsystemicarticulardysfunctioninadult,especiallyinsenior.Itischaracterizedbyrelativeslowonset,lessobvioussign,andmoreseriousalongwithincreasingage.Theadultarticularcartilagesurvivesinthecomplexphysicochemicalcircumstances,anditistheinterfaceofthediarthrodialjoints.Ityieldsdeformationwhenitsuffersloadduringexercises.Anciently,peoplealwayspayattentiontothechemicalfactorswitchinfluencethenormalmetabolismof
cartilage,andinthemostup-to-datedatashowsthatinanimaltheinfluencetothemetabolismofcartilageduetothebiomechanicalstimuliisSOobvious.Wehaveusedanavailabledevice,whichis
designedindependently,totestthebiomechanicalpropertiesofadultarticularcartilageexplantsinvitro.Andviathedifferenceresultsofthemetabolismandconfigurationofcollagen,andseveralrelativegenemRNAexpression,weCallannotationdifferentloadshavevariousmetabolicresultstothecartilage.Andalloftheoutcomes
offertheacademicreasontoexplainthepathogenesisofmusculoskeletonsystemdisease,especiallythatofOA.Method:
Wehaddesignedallavailabledeviceindependently,and
pressedthecartilageexplants,whichhadbeenprocessedtoaregularsizeandwhose6providershadnoanyrelativeboneandskeletondiseases,whosuffertotalhipreplacementduotointracapsular
fractureoffemoralneck,andtheaverageagewas65.6yrs.Theconfinedcompressionwasclassifiedtoseveralgroupsaccordingtothefrequency(0Hz,O.01Hz,0.1Hzand1Hz)andmagnitude(0Mpa,O.5Mpa.1Mpaand1.5Mpa).Weanalyzeditsresultvialineal
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土海第=压融太学博士擘桩论文
regressioncontrasttothecontroltest,whichwasprocessedbymicrometer.
Selectanother6patients,whoseaverageagewere66yrs,andgivethesamegroupingtotheformertest.ViaInSituHybridizationOSH)test,Immunohistochemicalmethod,SiriusredstainandTransmission,ScanningElectronMicroscope,WewanttoobservetheexpressionshiftofcollagenofthetissueunderthestimulationofcyclicVS.static10ads.AndviatheRT-PCRwewanttoseethe
differentresultoftheexpressionofprotroglycan,integrin,cytoskeletonandtheapoptosisrelatedgenemRNAundersuchbiomechanicatstimuli+
Result:
Wefoundthatthedevicewhichisdesignedbyourselveswasabletoreachthedemandsweneed,andtheresultwassimilartothetraditionalmethodwitchisprocessedbythernicrometcr.
Furthermore,wefoundthedatayieldedbyourdeviceismore
stabilitythanthelatter.
Theanabolicmetabolismofcollagen11wasrelatedwithbo也thefrequencyandmagnitudepropertiesofthesqueezedloads.髓omid-frequencygroupshowedup-regulatemodulation,whilestatic
andhigh-frequencyloadsmightyieldinhibitioninfluence.Toloadmagnitudeitself,ithadthepositiveregulationtothecollagenIIexpression,butwhenintegratedwithitsphysicalinjury,thefinalresultoftheloadwouldbedown-regulate。
WecouldfindtheexpressionofcollagenIIIincontrolgroup,andmaintainlowlevelinallgroupsofmid—andlow-frequency,eveninthelow--andmid--magnitudegroupsofstaticandhigh—frequencyloadstimuli.Butinthehighmagnitudegroupsofstaticloadandhi.曲frequencyloadstimuli,wefoundanotableup-regulationincollagenIIIexpression.
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Underelectronmicroscope,wefoundtheconfigurationofchondrocytesmaintainnormalinthecontrolgroupandlow一,mid—frequencylow一,mid—magnitudeloadstimuli.Butcouldnotfindanyincreasingexpressionoftheorganelle(forthereasonofthematerialresourceisfromseniorarticularcartilage).Andinothergroupsgraduallyshowsomeunwantedresults:
nucleusdegeneration;
condensesandoddsdistributionofchromatin;cytosolicelectron
densityenhancing,andfoundlotsoffatty-likevesicles;discontinuesofcytoplasmaticmembrane,existabundantdensegranulearoundthecontrocytes;andfinalthecellscollapse,evendisappear.
WithstainingbySiriusred,wecouldfindtheshowedresult
waslessprominentthanelectronmicroscope.
TothemRNAexpressionofaggrecancoreprotein,theRT-PCRresultsshowedincreasedexpressioninthegroupsofmid—andlow-frequency,andthesameresultsinthemid-andlow-magnitudeloadinhi曲一frequencygroups;butinthehigh—magnitudehigh-frequencygroup,theexpressiondecreasedandreachedtheleveltothecontrol
group,Instaticgrouptheresultshowedgraduallyandlaterobviouslydecreasecontrasttothecontrolgroup.
For131一Integrinand13-actin,氇eyhavetherdmivecoincidence
results.Neitherofthemexpressedinthehi荫一magnitudeofstaticloadgroup,andbothofthemobviouslydecreasedintheothergroupsofstaticloads;showedup--regulationinthemid--andlow-frenquencyloads。
buthadthetendencyofdecreasewhentheloadmagnitudereachedhi曲level+
Therewerevariousexpressionsofcaspase一3mRNAalterdifferencekindofloadstreating.Thecontrolandthemid—frenquencygroupshowedlowlevelresults,andhavemore
strongexpressioninstatic,high—andlow-frenqucygroups.Butto
彳
圭塑堑三墨翌垄兰堡主鲎兰竺墨
theexpressionintensity,therewereaslightshiftamongdifference
magnitudesofloads.
Conclusion:
ThedevicethatWaSdesignedindependentlybyUSWaSameliorateproductiontothebiomechanicalresearchofcartilageexplants.
Fortheanabolicmetabolismofcartilagetissue,e,g+collagenII,integrin,aggrecanandcytoskeletonprotein,thestaticloadsshoweddown。
regulationeffect,andthemagnitudeoftheloadalsohadanegative-relationship.Andtothecyclicloaditself,ithadthe
up-regulativeeffectthen.
Totheunspecificorthecatabolicmetabolicphenotype,e.g。
collagenIIIandtheapoptoticrelativegene,showedsensitivetothestaticloadsandactedastheup—regulator,andonthewholehadnoobviouslyshiftinothergroups.
Keywords:
MechanicalloadadultarticularcartilagephenotypeinsituhybfidizafioncompressiondeviceelectronmicroscopeapoptosisSiriusred
上海第二压抖大掣博士学位论走
实验一应力加载装置妁研制与可行挫研究
关节软骨是负重关节承裁的界面,在人体潦动对将承受应力负荷的作用,仅就关节负重方面而言,软骨首先将承受重力对其所产生的压应力作用。
关节解割结构复杂,并且软骨在受荷状态下的代谢反应受到生物化学与物理因子的镑昆作用,因此要在体内对软骨细胞在负荷刺激下的代谢变化进行监控将变得十分困难。
俸外单因素对关节软骨作用机剑瞧研究既是基于此而开展的,也就是将软骨组织琰自机体中游离,在体外拟生垮情况下(培养介质、温度、湿度及环境气体欢度等与体内拥似),单纯给予一种压应力,以观察在这稀情况下软骨细胞的反应蛀及其细胞外基质代谢指标的变化。
适今为止,已经有许多学者在动物姆平就应力对于关节软骨的代谢,生存等方面的影响散了研究,但是就软骨组织块的加载,还是没宥一个娩一的赫准可言,所使用的加我装置也就无从统一规范。
由于本课题也将涉及软骨在应力作用下代谢活性的研究,故此针对我们的试验要求,通过与同洚大学现代制造技术研究所合作,独立设计了一套压力囊精加载装置,以供在体外研究力学因素对软骨组织代谢调控。
髓羲每秀法一、美节软骨标本取辑
欺骨标本来源于上海第二医科欠学隧属瑞金医院骨科,选取
,蓐床因股骨颈骨折而行髋关节假体置换术的惠者,取材蓠收集惑者的病历资料,摒秀有长期关节酸痛史,激素运用史、肿瘤史、
上海第二医科失学博士擘位论支
代谢性疾病史(糖尿嫡等)及长期非甾体类药物运用史;另外,术蔺x片需证实患者两镧髋关节关节闻跨相同且无狭窄。
经筛选露螅病倒中随机抽取女性患毒6名,65。
6血2。
3岁,其中男、女各3例,左侧2例,右侧4例。
术中股骨头离体后卵用无菌生理盐水冲洗,并用生理盐水浸润麓无菌珍布包裹,双簇无菌手套包乳,并转移至无菌细胞涪养室,行组织块取材加工(括本薅体慰六小盼建完成,期阅置于4。
C冰箱保存)。
于无菌条件下,用定制4mm内径环形环钻于股骨头外上象限承囊区及周围区域钻取4mm赢径之软骨组织块,再J}{l元舂手术刀小心蒋软骨至葭织瑛与其深部之软骨下骨分离;并选取厚度在1.5圭0,5mm范固考备甩。
Hank’s液冲洗至无啶显血性成分,并置于特定培莽液培芥。
培养液成分:
含20%胎牛血清的DMEM培养液250ml,加F12,O。
1%藐环叔酸,8万单位庆天霉素。
二、对照测试方法:
试剂:
培养液成分同上
器材:
精度为1岬的50—75mm螺旋测微仪(千分尺)
上海华东仪器厂定镧翡BHR。
4荷蚤传惑仪(精度),GWC.6压力显示仪(精度为0.1MPa)
培养疵,镊子,2mlEpendorf管步骤:
每例股骨头标本均取20块组织块置于盛有培养液的培养
皿,臻螺旋测微议分别测量各缎织块厚度;每倒股骨头标
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本组织块按照其厚度分成8组,每组每例2块,即每例16块纽织,其纽内厚度差不越过501.tm;弃丽厚度编离较大的。
各纽孛随机选驭一块放入装窍培秦液的Ependorf管中,编号(对照测试锻姐号为I,各标本为Il-1~k8)。
将螺旋测微仪与压力传感器以及压力显示仪连接好,蒋褥奉放八裁耪密,旋动测徽仅酶测量抒,密其与组织块接触的瞬阀,赢殛力传感器读数开始囊0改雯时砖测微仪
读数为所测厚度。
实验时,继续缓隧旋紧测微仪测量杆,直到压力议
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- 应力 负荷 成人 关节 软骨 组织 代谢 调控 分析