人血清章鱼胺含量测定方法的研究与天然章鱼胺补充剂的开发图文精.docx
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人血清章鱼胺含量测定方法的研究与天然章鱼胺补充剂的开发图文精
上海海洋大学
硕士学位论文
人血清章鱼胺含量测定方法的研究与天然章鱼胺补充剂的开发
姓名:
邱伟强
申请学位级别:
硕士
专业:
食品科学与工程
指导教师:
陈舜胜
20100304
上海海洋大学硕士学位论文人血清章鱼胺含量测定方法的研究与天然章鱼胺补充剂的开发摘要章鱼胺是一种重要的生物胺,作为内源性的神经介质与B3.。
肾上腺素能受体激动剂,章鱼胺在能量的平衡与能量代谢的调节上有重要的作用,但其生物学意义与生理学作用尚未被充分认识。
人体各种器官特别是肝脏中的细胞色素P450酶系单加氧酶是体内生物合成章鱼胺的限速酶,有关糖尿病、肝病对细胞色素P450酶系单加氧酶活性的影响已有详尽讨论。
章鱼胺在人体内也可以因单胺氧化酶作用而被降解,而单胺氧化酶活性过强与抑郁症等精神疾患有关。
因此,人血清章鱼胺含量有可能作为一项血液临床生化检验项目,在病理学和药理学的研究中有潜在的价值。
本论文分为两个部分,第一部分建立了人血清中肾上腺素能受体激动剂章鱼胺检测方法,为准确快速测定人血清中章鱼胺含量研究提供可靠的分析手段。
第二部分是天然章鱼胺补充剂的开发,主要是水产品可食部章鱼胺含量的研究,以及通过营养性小鼠的减肥试验研究章鱼胺对小鼠的减肥降脂作用。
本论文目的之一是建立人血清中肾上腺素能受体激动剂章鱼胺检测方法,据大多文献介绍,章鱼胺的HPLC分析多为衍生化方法,但衍生化方法实验操作过程繁琐,且成本高。
本试验想建立一种快速不需要衍生处理的HPLC检测方法,先将人血清用流动相稀释5倍,经微孔滤膜(0.45“m)滤过;在色谱条件的选择中,我们用色谱柱:
phenomenexlunaC18(150x4.60mm,51.tin),流动相:
0.02mol・L.1柠檬酸一0.02mol・L-1磷酸二氢钠(7:
3),pH调为3,流速:
0.8mL・min"1,紫外检测波长:
220nm,进样体积:
20止。
实验结果表明,此方法章鱼胺在0.006~50甥・mLd范围内,浓度与峰面积线性关系良好(r=0.9999),平均加样回收率为104.4%,RSD为1.53%。
最低检出浓度为6.0ng・mL一。
此HPLC检测方法不需要衍生处理,样品用量少,可直接上机测定,具有良好的专一性,精密度和回收实验结果表明,测定结果稳定,具有微量、简便、快捷、灵敏等特点,能符合测定的要求。
为证明上述方法的可靠性,我们使用THPLC柱前衍生方法与其进行比较,通过使用HPLC柱前衍生方法测定人血清中章鱼胺的含量。
方法是先用高氯酸溶液提I
上海海洋大学硕士学位论文
取,并用丹酰氯衍生;色谱条件的选择中,我们用ODS反相柱,柱温40。
C,检测波长为254nm,用0.1mol/L醋酸铵和乙腈做流动相,梯度洗脱,流速为1.0ml/ml。
章鱼胺标准品用流动相稀释成0.001~20mg/L的梯度溶液,按照色谱条件检测,以峰面积为纵坐标,浓度为横坐标绘制标准曲线。
经回归分析,章鱼胺在0.001~20mg/L范围内有良好的线性关系,相关系数大于0.999。
最低检测限为6.0ng・mL一。
加低、中、高浓度标准品的回收率是90.0~110.O%。
本实验方法灵敏、可靠,适合临床诊断以及药物研发中分析多种生物胺含量的研究。
测出健康成年人血清章鱼胺的含量是成年人为4.87-4-1.701.tg・mL~。
与之前不用衍生的方法测出的结果健康成年人血清章鱼胺含量为4.50-j:
1.1099・mL-几乎吻合。
本论文目的之二是对天然章鱼胺的开发,首先是对水产品可食部章鱼胺含量的研究,我们测定了各种淡水和海水水产品可食部中133.肾上腺素能受体激动剂章鱼胺的含量,为水产品中章鱼胺的开发利用提供依据。
取鱼、甲壳类、头足类可食部位匀浆后超声处理,用HPLC测定离心后上清液的章鱼胺含量。
结果表明8种淡水鱼肉章鱼胺含量在30"-"130gg・g-1之间,其中,背肉普遍比腹肉中含量高。
海水鱼以及淡水甲壳类的章鱼胺含量与淡水鱼大致相似。
海水甲壳类中章鱼胺含量特别高,是淡水、海水鱼和淡水甲壳类的几十倍,甚至千百倍。
头足类的章鱼胺含量也比较高,在海洋藻类中未检测出章鱼胺。
海洋贝类等是水产品中章鱼胺最丰富的来源,是减肥者与糖尿病人的理想食物。
其次我们研究了章鱼胺对营养性肥胖小鼠的减肥作用。
首先采用高脂饲料建立小鼠肥胖模型,以小鼠体重、Lee’S指数、脂肪湿重、脂肪系数、血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)及高密度脂蛋白(HDL—C)等指标的变化,研究章鱼胺对小鼠的减肥作用。
4周以后,肥胖对照组小鼠较普通对照组小鼠体重、脂肪湿重、脂肪系数、血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)及高密度脂蛋白(HDL.C)含量均显著增加(P<O.05),表明营养肥胖模型构建成功。
建模成功后,对章鱼胺高、中、低3个剂量组分别以60、30、15mg/kg・d剂量的章鱼胺灌胃,阳性药对照组给予8mg/kg・d的祛脂瘦身胶囊,模型对照组及正常对照组给以等体积溶媒。
灌胃4周后,本试验发现,章鱼胺各剂量组及阳性对照组中小鼠体重、脂肪湿重、脂肪系数、血清总胆固醇(TC)与模型组存在显著性差异(P<0.05),其中Lee’S指数和甘油三酯(TG)的中、高剂量组与模型组存在显著性差异(P<0.05)。
结论:
章鱼胺对营养性肥胖小鼠有一定的减肥降脂作用。
关键词:
高效液相色谱法,章鱼胺,人血清,减肥功能,营养性肥胖小鼠Ⅱ
。
一一一————————————————————,————————_————_————————一上海海洋大学硕士学位论文AnalysisofOctopamineinHumanSerumbyHPLCandDevelopmentofNaturalOetopamineSupplementationABSTRACTOctopamineisanimportantbiogenicamine,asendogenousneurotransmittersandp3.adrenergicreceptoragonist,itplaysallimportantroleintheenergybalanceandregulationofenergymetabolism,butitsbiologicalsignificanceandphysiologicalrolehasnotyetbeenfullyacknowledged.CytochromeP450monooxygenaseIStherate-limitingenzymeofoctopaminebiosynthesisinvariousorgansofthebodyespeciallyinliver,theeffectofthediabetesandliverillnessonactivityofcytochromeP450mono—oxygenasehasbeendiscussed.octopamineinthehumanboaycanbedegradedbymonoamineoxidase,andthemonoamineoxidaseactivityisveryhighwhichmayrelatetothementaldisordersdepression.Thus,thecontentofoctopaminemhumanserummaybeusedasabloodclinicalbiochemistryprojects,andithasagoodpotentialvalueinthepathologyandpharmacologystudy.Thisstudycontainstwoparts.ThefirstpartisaboutestablishingaHPLCmethodformedeterminationofoctopamineinhumanserBin.WeprovideareliableanalyticalmethodwhichCandeterminetheoctopaminecontentaccuratelyandrapidly.T11esecondpartisabouttheexploitationofnaturaloctopamine’Sextender,westudyontheeffectofoctopamineontheanti—obesityinnutritiveobesitymice・Firstofall,thestudyestablishedaHPLCmethodforthedeterminationofadrenoceptoragonistoctopamineinhumanSerum.Accordingtodescriptionsofmostdocuments,thederivatizationreagentsolutionWasusedtodetermineoctopammembiologicalsamples,though,thismethodWascumbersomeandcostly.Inthisexperiment,wewillbuildafastHPLCmethodwhichdonotneedtoderived,thehumanserumwasdilutedfivetimeswiththemobilephase,AphenomeneslunaClscolumnWaSused.111emobilephaseWasconsistedof0.02Ixg・mLlcitricacidand0.02鹏。
mLqsodiumdihydrogenphosphate(7:
3,v/v),theflowratewas0.8mL’min"1,thecolumntemperatureWas40"C,一and-thedetectionwavelengthwas22011m.Results:
Thestandard111
上海海洋大学硕十学位论文
calveofoctopaminewaslinearwithinarangeof0.006.50l-tg・mL~,andthecorrelationcoefficientWasO.9999.Theaveragerecoveryofspikedsamplewas105.6%(RSD=O.93%).The
convenient,rapidand
humanserum.detectionlimitWaS6.0ng’mL~.Conclusion:
thismethodisreliable.Itcouldbeusedforthedeterminationofoctopaminein
Toprovethereliabilityoftheabovemethod,we
HPLCmethodforusedapre—columnderivatizationacomparison.Inthisstudy,weestablishedmethodfordeterminingoctopamineinserumbyusingreversedphaSehighperformanceliquidchromatography
first(RP-HPLC).Theoctopaminewereextractedfromhumanserum
columnwasbyperchloricacidassolutionandderivatizedbydansylchloride.AnODS
columnatselectedseparationnlTl40。
C.UVdetectorisusedtodeterminethebiogenicamineat254wavelength,themobilephasesolutionswere
acetateandB,acetonitrile.AconsistedofA,O.1mol/Lammoniumoutwithaflowrateat1.0gradientelutionwascarriedml/m1.TheresultsshowedthatthedetectionlimitforoctopaminerangedWaS6.0ng・mL~.AllthecorrelationcoefficientswereaboveO.999.TheaverageanalyticalrecoveryinserumwaSfrom92.O%to110.O%.Moreover,theserumconcentrationsofoctopamineinhealthyadultwere4.87
octopamine4-1.70岭。
mL一,comparedtotheabovecontent4.504-1.10lxg’mL~inadultserum,theywerealmost
andanaStomosis.Themethodissensitive
Secondly,inthe
investigationof
contentofreliable,andsuitableforsimultaneousanalysisofmultiplediscovery.biogenicaminesintheclinicaldiagnosisexploitationofanddrugnaturaloctopamine’Sextenderpart,firstly,thisstudy,theediblepartofoctopaminecontentinediblepartoffisheryproductinoctopamine,akindofp3・adrenergicreceptoragonistsin
waterandseawateraquaticproductWaSvarious舭shdetermined,toprovidedatafor
exploitationandutilizationofoctopamineinaquaticproducts.AfterhomogenateandultraSoundtreatment,ediblepartsoffish,shellfishandcephalopodiumwere
detectedwithcentdfugalizated,thenoctopaminecontentinsupematantliquidWaS
HPLC.Theresultsshowedthatineightkindsoffreshwaterfis;htheoctopaminecontentsofdorsalmeataregenerallyhigherthanabdominalmea_t,whichareintherangeof30-130I.tg‘91androughlysimilartoseawaterfishandfreshwater
areshellfish.Theoctopaminecontentsofseawatershellfish
thousandstimesofthatinfish
contentparticularlyhigh,almostdozensevenalsohaSaandfreshwaternotshellfish.Cephalopodiuminoceanhi.ghofoctopaminewhileitisdetected
Ⅳalgae.Seawatermollusksarethe
mostaffluentresourceofoctopamineinaquaticproductsandidealfoodofweight。
watchersanddiabetics.Secondly,westudyOileffectofoctopamineon也eanti。
obesityinnutritiveobesitymice.Thealimentaryobesitymodelwasestablishedbvhyperalimentation.Theweight,Lee’sindex,thewetweightoffat,fattycoefficiem(FC),totalserumcholesterin(TC),triglyceride(TG)andhighdensitylipoprotein(HDL-C)wereselectedtoobservetheanti.obesityeffectofoctoparnine.Foufweeksweight,Lee’sindex,thewetweight&fat,fattycoefficient(FC),theconterltofsa'umcholesterin(TC),triglyceride(TG)andhighdensitylipoprotein(HDL.C)infeedingincreasedapparentlycomparedtothenormalfeeding(P<0.05),itthatthenutritiveobesitymodelwassetupsuccessfully.Theweight.wetoffat,FCandthecontentofTCintheoctopaminefeedingofobesitynlodelreducedapparentlycomparedtothenormalfeeding(P<O.05);thecontentofandLee’Sindexinthemediumandhighdosageofoctopaminefeedingofmodelwerereducedapparentlycomparedwiththenormalfeeding(P<0.05):
hadfunctionaleffectsonreducingobesityandbloodlipidsofmice.WORDS:
HPLC,octopamine,humanserum,reducingobesity,nutritiveobesitymiceVlater,thetotalnutritiveindicatedweightwereHDL_CobesityConclusion:
octopaminetheKEY
上海海洋大学学位论文原创性声明
本人郑重声明:
我恪守学术道德,崇尚严谨学风。
所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究工作所取得的成果。
除文中已经明确注明和引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。
论文为本人亲自撰写,我对所写的内容负责,并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。
学位论文作者签名:
加畅多
日期:
知f拜;月r日
上海海洋大学学位论文版权使用授权书
学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅或借阅。
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保密
本学位论文属于口。
,在年解密后适用本版权书。
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WD年;月f‘日耄嚣篓.c孵忆日期:
乒爿p年5月f日。
上海海洋人学硕士学位论文引言章鱼胺(Octopamine,OA),又名章鱼涎胺或真硝胺,化学名为:
1.(4羟基苯基)一2一氨基乙醇,章鱼胺首先被发现存在于软体动物章鱼的唾液腺中,故称为章鱼胺,图1为章鱼胺分子结构:
0,HIIHn疋产一扎H图1章鱼胺分子结构Fig.1moleculestructureofoctopamine章鱼胺生理学意义的研究首先开展在脊椎动物和节肢动物体内。
在脊椎动物明章鱼胺是调节去甲肾上腺素突触传导的神经递质,但是至今在哺乳动物的中央作为内源性的神经介质与1332肾上腺素能受体激动剂,章鱼胺在能量的平衡与1神经系统中,被认为是“痕量生物胺”或是“虚假的”神经递质Ⅲ。
虽然有迹象表神经系统中没有发现特异性的章鱼胺受体。
在无脊椎动物如节肢动物体内广泛、大量地存在章鱼胺瞳1,其主要功能为:
(1)神经递质,可控制内分泌或光器官;(2)神经激素,可诱导脂类和碳水化合物的移动;(3)神经修饰物质,可影响运动类型、栖息甚至记亿,还可作用于各种肌肉、脂肪体和感觉器官的末梢口1。
能量代谢的调节上有重要的作用H吲,但其生物学意义与生理学作用尚未被充分认识。
人体各种器官特别是肝脏中的细胞色素P450酶系单加氧酶是体内生物合成章鱼胺的限速酶,有关糖尿病、肝病对细胞色素P450酶系单加氧酶活性的影响已有详尽讨论口棚。
章鱼胺在人体内也可以因单胺氧化酶作用而被降解,而单胺氧化酶活性过强与抑郁症等精神疾患有关。
因此,人血清章鱼胺含量有可能作为一项血液临床生化检验项目,在病理学和药理学的研究中有潜在的价值。
生物样品中章鱼胺含量的测定方法已经有很多种,包括放射酶学测定法、毛细管气相色谱一负化学电离质谱法旧1、柱前衍生.RP.HPLC方法阻们、光纤LED诱导荧光毛细管电泳检测法n11,虽然放射酶学测定法在过去经常用来测定生物样本中章鱼胺含量,但是实验操作过于复杂而且不稳定。
而柱前衍生.RP.HPLC方法则实验操作也复杂且衍生
上海海洋大学硕士学位论文
试剂昂贵。
在本研究中,我们想建立一种快速有效的不需衍生物处理的人血清中章鱼胺HPLC分析方法。
样品用量少,可直接上机测定,要求具有良好的专一性,精密度和回收率,测定结果稳定,具有微量、简便、快捷、灵敏等特点,能符合测定的要求,且能准确人血清中章鱼胺的含量,为与章鱼胺相关的病理学和药理学研究提供了有效手段。
章鱼胺是一种重要的生物胺,近年来研究发现它是一种天然的p3.肾上腺素能受体激动剂,在肥胖症的治疗和I工型糖尿病的防治上有潜在的价值n2’13J。
13一肾上腺素能受体是细胞膜内外与肾上腺素结合的一种受体,而t3一肾上腺素能受体激动剂(13-Adrenoceptoragonists)往往引起人体内各种器官和组织的不同反应,有重要的生理作用n4“5|。
虽然p3一肾上腺素能受体直至t]1989年才被克隆,但已被关注了多年。
人体的B3一肾上腺素能受体在白色脂肪组织,棕色脂肪组织以及人的骨骼肌的表达同样有效,并且在能量平衡和体内葡萄糖平衡的调节上起作用,一些研究指出。
一些研究指出,B3一肾上腺素能受体激动剂在肥胖症的治疗和II型糖尿病的治疗上有潜在的价值。
最引人注目的是133一肾上腺素能受体激动剂对胰岛素的致敏作用,它能促进脂肪氧化从而迅速降低细胞内代谢产物的浓度,如脂肪酰基CoA和二酰基甘油口朝,由此调节了胰岛素信息,是临床应用研究的关注点。
传统的中药枳实的提取物,在欧美普遍用作减肥产品原料。
其功效成分之一即为章鱼胺(O.01%~O.1%)n引。
在美国,含章鱼胺的减肥产品已在市场销售。
随着人民生活水平的不断提高,现代化膳食结构发生改变和体力活动的日渐减少,超重和肥胖已经成为一个世界范围内引起普遍关注的问题,肥胖与多种疾病的发生及死亡密切相关,如糖尿病、心血管疾病、中风、高血压等,并且是导致某些癌症的危险因素。
所以,肥胖症被认为是一个导致早死、致残、影响生命质量和增加全社会财政负担的重要公共卫生问题n71。
就我国而言,成年人中超重人群也在不断扩大。
以20世纪90年代与80年代比,超重者的比例己增加了近一倍,达到了20%'-'30%,大城市则己达到了35%"-'40%。
目前肥胖病人日益增加,其重要原因是热能摄入过多和饮食结构不合理。
肥胖病人热能、脂肪和碳水化合物摄入量过高,且三大营养素比例失调n81。
由于肥胖给人们带来诸多的危害,很多人为了减肥吃各种各样的减肥药,而市面上出现的各种减肥药都有一定的不良反应n91。
可见,开发一种效果显著且无副作用的天然减肥、降脂功能性食品具有重要的现实意义。
章鱼胺作为重要的生物胺在生物体内起了神经介质的作用,近年的研究发现它是一种天然的D3.肾上腺素能受体激动剂,也是目前唯一商品化的133.ARA,在肥胖症的治疗和II型糖尿病的防治上有重要的作用。
在市面上大
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