分子遗传学要点整理.docx
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分子遗传学要点整理
Chapter1:
Genomes,TranscriptomesandProteomes
1.概述
基因组(Genome):
指生物的整套染色体所含有的全部DNA或RNA序列。
基因组是地球上每一物种具有的生物学信息的存储库。
基因组学(Genomics):
指研究生物的整个基因组,涉及基因组作图、测序和功能分析的一门学科。
基因组所包含的生物信息的利用需要酶及其他参与基因组表达过程中一系列复杂生化反应的蛋白质的协同活性。
基因组表达的最初产物是转录组,即那些含有细胞在特定时间所需生物信息、编码蛋白质的基因衍生而来的RNA分子的集合。
转录组由转录过程来维持。
基因组表达的第二个产物是蛋白质组,即细胞中那些决定细胞能够进行生化反应的所有蛋白质组分。
这是通过翻译过程来完成的。
2.1GenesaremadeofDNA
奥地利神父孟德尔1865年根据7个碗豆性状的实验提出了遗传因子假说,认为每个性状由遗传因子控制,并提出了遗传因子的分离与自由组合两大遗传规律。
证明基因由核酸(DNA或RNA)组成的3个著名实验:
1肺炎双球菌的转化试验;DNA是遗传物质
②噬菌体感染实验;只有DNA是联系亲代和子代的物质
③烟草花叶病毒的感染实验。
RNA也是遗传物质
2.2ThestructureofDNA
A.Nucleotidesandpolynucleotides
B.ThemodelofdoublehelixDNA晶体X射线衍射图谱 为揭示DNA分子的二级结构提供了重要实验证据
a.WatsonandCrick(1953)提出的
DNA双螺旋结构模型:
" DNA分子通常以右手双螺旋形式存在,两条核苷酸链反向平行,且互为互补链。
" 戊糖-磷酸骨架在分子的外铡,在分子表面形成大沟和小沟,碱基堆积于螺旋内部。
" 碱基间通过氢键相互连接,A和T以2个氢键配对,G和C以3个氢键配对。
" 螺旋中相邻碱基间相隔0.34nm,每10个碱基对螺旋上升一圈,螺距为3.4nm,直径为2.37nm。
b.DNA双螺旋结构的稳定力:
• 碱基间形成的氢键/• 相邻碱基间的疏水堆积力/• 碱基相互作用的范德华力尽管氢键使得双链中的碱基间的配对具有特异性(只有互补的两条链之间才能形成DNA双链),但其对于双螺旋的总体上的稳定性并无太大贡献。
核酸分子的稳定性的根源在于碱基对之间的疏水堆积力。
作为芳香族化合物,碱基的平面使其不能在自由溶液中与水分子形成氢键,即它们是疏水的。
疏水效应使双链DNA成为能量上最为稳定的结构。
尽管这种堆积作用在RNA中也存在,但其在双链DNA中达到了最大化。
c.DNA双螺旋结构的类型:
三种形态的DNA:
A-DNA,B-DNA,Z-DNA两类:
右手螺旋和左手螺旋
3.RNAandtheTranscriptome
• 基因组表达的最初产物是转录组,即那些含有细胞在特定时间所需生物信息、编码蛋白质的基因衍生而来的RNA分子的集合。
• 转录组中的RNA分子以及其他来自非编码基因的RNA都由转录过程产生。
1. 稳定性差2. 主要以单链形式存在
3.2细胞内的RNA组分(mRNA/rRNA/tRNA)
核小RNA(SnRNA):
发现于真核生物细胞核中,与前体mRNA剪接成成熟mRNA的过程相关。
核仁小RNA(snoRNA):
发现于真核细胞核的核仁区,在rRNA分子的加工过程中起到核心作用(比如在某个核苷酸位点上加上一个甲基)。
微小RNA(miRNA)和短干扰RNA(siRNA):
是调控个别基因表达的小RNA。
3.3ProcessingofprecursorRNA
末端修饰/剪接/剪切/化学修饰化学修饰在rRNA、tRNA和mRNA中都存在;其中,mRNA的化学修饰称作RNA编辑。
3.4Thetranscriptome转录组虽然不到细胞总RNA的4%,却是细胞中最重要的组分,因为它包含了基因组表达的下一个阶段中所要使用的编码RNA。
转录组从不从头合成(denovo),一个细胞通过细胞分裂诞生时就接收了其上一代的部分转录组,并维持一生。
各蛋白质编码基因的转录过程并不是导致转录组的合成,而是通过替换被降解的mRNA来维持转录组,并通过开闭不同的基因的表达来改变转录组的组成。
3.5转录组研究的方法
A.通过序列分析研究转录组
1)RNA-seq
研究转录组最直接的方法是将其中的mRNA为cDNA,并对所有cDNA克隆进行测序,再与基因组序列进行比较分析。
这可以借助第二、三代测序技术进行。
2)基因表达系列分析(Serialanalysisofgeneexpression,SAGE)SAGE技术不是研究完整的cDNA,它产生长度12bp的短序列,每一条都代表了转录组中存在的一种mRNA。
技术基础:
412=16,777,216bp,真核mRNA平均1500bp,412相当于11,000个转录物,这比最复杂的转录组中存在转录物数目还多,因此12bp序列能够代表某一种mRNA。
SAGE
切下来的片段被收集起来,头尾相连以产生一个串联体,进行测序分析。
串联体中的各个标签序列信息被读取并与基因组中的基因序列比对,从而可以分析哪些基因被转录,表达水平如何。
B.通过微阵列或芯片分析来研究转录组
构成转录组的mRNA总体被反转录成一个cDNA的混合物,然后被标记,用于和芯片或微阵列杂交。
优点:
可用于快速评估两个或多个转录组间的差异。
用不同的荧光来标记cDNA样品,微阵列与两个样品同时杂交,可以减少由于试验误差引起的差异。
4.ProteinsandtheProteome
基因组表达的第二个产物是蛋白质组,即细胞中那些决定细胞能够进行生化反应的所有蛋白质组分。
这些蛋白质是通过翻译那些组成转录组的mRNA分子而合成的。
4.1Proteinstructure
蛋白质和DNA分子一样,是一个线性的无分支的多聚体。
蛋白质中的单体亚单位称为氨基酸。
氨基酸形成的多聚体或多肽在长度上很少超过2000个单位。
a.primarystructure氨基酸通过肽键连接成一条多肽链。
b.secondarystructure指多肽采取的不同构象,由不同氨基酸之间形成的氢键所稳定。
α螺旋;β片层c.tertiarystructure是将多肽链的二级结构组分折叠成为三维构型而形成的。
它被各种化学力所稳定:
氨基酸残基间的氢键;带电荷的氨基酸R基团间的静电相互作用;疏水相互作用;半胱氨酸残基间的二硫键
d.quaternarystructure两条或更多已形成三级结构的多肽链组合在一起形成一个多亚基蛋白质。
不是所有蛋白质都有四级结构;
稳定力包括:
二硫键(稳定);氢键,疏水作用(松散)X射线晶体学;核磁共振波谱学;三维电镜重构
B.蛋白质的多样性取决于氨基酸的多样性
组成蛋白质的氨基酸在化学性质上有多样性,因此蛋白质的功能也是多种多样的。
氨基酸的多样性源于R基团。
非极性(疏水)极性(亲水)带负电荷带正电荷
4.2Theproteome
蛋白质组包括了在特定时间存在于细胞中的所有蛋白质。
A.Thelinkbetweenthetranscriptomeandtheproteome
B.蛋白质组和细胞生化功能之间的联系
基因组编码的生物学信息最终由蛋白质表现。
蛋白质能够执行各种生物学功能:
生物催化作用(酶);
结构(细胞骨架由蛋白质决定);
运动(收缩蛋白);
运输(血红蛋白运输血液中的氧);
调节细胞进程(信号蛋白、活化调节因子);
保护细胞个体(抗体);
储藏功能(麦醇溶蛋白)。
4.3蛋白质组研究的方法
A.蛋白谱(表达蛋白质组学)
用来研究一个蛋白质组组成的特定技术。
蛋白谱基于两项技术:
蛋白电泳和质谱a.双向电泳:
等电点等电点:
蛋白质的净电荷为零时溶液的PH值。
b.MALDI-TOF(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)• 用于鉴定蛋白组中的蛋白质,最多可以分析出50个氨基酸长度的多肽,因此一个蛋白质可以通过胰酶将其消化后进行测定。
• 一旦多肽片段被离子化,多肽的质量/电荷比就可以通过它在质谱仪中从电离源到检测器的“飞行时间”来确定。
通过质荷比能够确认多肽片段的分子质量。
• 计算机中含有一个由所研究的物种基因组编码的每一个蛋白质经胰酶消化后各个片段的预计相对分子质量的数据库,计算机通过比较数据库与检测到的多肽片段的分子质量来确认最可能的初始蛋白质。
B.蛋白质印迹法(Western杂交)
Western杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。
其原理是:
生物中含有一定量的目标蛋白。
先从生物细胞中提取总蛋白或目标蛋白,将蛋白质样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中,经SDS-PAGE电泳将蛋白质按分子量大小分离,再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜(硝酸纤维素膜或尼龙膜)上。
然后加入特异性抗体(一抗),膜上的目的蛋白(抗原)与一抗结合后,再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗(通常一抗用兔来源的抗体时,二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗体),最后通过二抗上带标记化合物(一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶,或用同位素或生物素标记)的特异性反应进行检测。
根据检测结果,从而可得知被检生物细胞内目的蛋白的表达与否、表达量及分子量等情况。
C.鉴定与某一蛋白质相互作用的蛋白质通过鉴定有相互作用的成对或成组的蛋白质能够获得基因组活性相关的重要数据。
构建蛋白质相互作用图谱被视为是连接蛋白质组学与细胞生物化学过程的一个重要步骤。
a.噬菌体展示该技术采用了一种基于λ噬菌体或某种丝状噬菌体的独特的克隆载体。
待测基因被插入载体后,它的蛋白质产物能与噬菌体外壳蛋白以融合形式表达。
使用噬菌体展示库来寻找与待测蛋白质相互作用的蛋白质的噬菌体。
b.酵母双杂交激活因子(转录因子):
一类控制基因表达的蛋白质,包含DNA结合结构域和转录激活结构域。
双杂交系统使用缺乏某一报告基因相应激活因子的酿酒酵母菌株,此时报告基因是不表达的。
D.蛋白质相互作用图谱
也叫蛋白质相互作用网络,能展现一个蛋白质组中各成员间发生的相互作用。
Chapter2StudyingDNA
1.概述
DNA重组技术:
借助工具酶按预定的方式操作DNA分子,将DNA分子切成小片段,并重新将它们连接在一起,形成自然界不存在的组合体。
聚合酶链式反应(PCR)
2.1DNA聚合酶/核酸酶、连接酶、末端修饰酶
以现有DNA或RNA分子为模板合成DNA的酶,称为(依赖模板的)DNA聚合酶。
A.依赖模板的DNA聚合酶的工作模式
按照碱基互补配对的原则,从5’→3’方向合成,需要寡聚核苷酸作为引物。
DNA聚合酶I(Kornberg聚合酶)聚合酶功能、3’-5’外切核酸酶活性、5’-3’外切核酸酶活性
Klenow聚合酶
用枯草杆菌蛋白酶处理DNA聚合酶I,可获得两个片段,大片段的分子质量约76kDa,保留聚合酶活性和3’-5’外切核酸酶活性,又叫Klenow片段。
小片段的分子质量约34kDa,具有5’-3’外切核酸酶活性。
DNA体外标记的方法
A.缺口平移法(Nicktranslation)(DNA聚合酶I)
利用PolyI在双链DNA的缺口处进行离体合成。
断裂双链内部的一个磷酸二酯键,PolyI从缺口处的3’-OH开始新链合成。
同时原有的同源链被排开,被5’-3’外切酶作用降解,缺口的位置沿双链移动。
缺口转移是DNA体外放射性标记的重要技术。
B.末端标记法(Klenow片段)
C.随机引物法(Klenow片段)2.2核酸酶:
外切核酸酶和内切核酸酶
A.限制性内切核酸酶在特定的位置切割DNA分子按限制性内切酶的组成、是否具有修饰酶活性以及切断核酸的情况不同,限制酶可分为三类:
I型,II型和III型。
a.I和III型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化,又催化非甲基化的DNA的降解,但切割位置不固定。
b.II型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的降解(无修饰酶活性),且具有识别位点的专一性和切割位点的专一性,一般在识别序列内切割,不需要ATP提供能量,是重组DNA技术中常用的限制性内切酶。
细菌中三种不同类型的限制-修饰酶
B.检查限制性消化的结果
在指明pH与温度下,在50µL反应体系中,1小时消化1µg的λDNA的酶量为1单位(1U)。
Southern杂交
2.3DNA连接酶
通过DNA连接酶可以将限制性内切核酸酶消化产生的DNA片段重新连接起来,或者连接到一个新的分子上。
T4DNA连接酶:
从T4噬菌体感染后的大肠杆菌细胞中提取。
•粘性末端连接的高效率推动了将钝末端转变成粘性末端方法的发展。
•一种方法是将称为连接子(linker)或接头(adaptor)的小双链分子连接到钝末端。
•另一种方法是利用末端脱氧核糖核苷酸转移酶进行同聚物加尾,即在钝末端的3’末尾一个接一个地添加核苷酸。
2.4末端修饰酶末端修饰酶:
改变DNA分子末端,为连接实验的设计增加可操作空间。
A.末端脱氧核糖核苷酸转移酶:
属于模板非依赖的DNA聚合酶。
B.碱性磷酸酶:
去掉DNA分子5’端磷酸基团,从而阻止这些分子连接到其他分子上。
C.T4多聚核苷酸激酶:
向DNA分子5’端添加磷酸基团,主要用于DNA分子的末端标记。
3.DNACloning3.1克隆载体及其使用方式质粒,噬菌体,人工染色体等它们都含有复制起始位点。
A.以大肠杆菌质粒为基础的载体pUC系列(蓝白斑挑白色的)pUC8,2.7kb,除了起始位点外,还携带氨苄青霉素抗性基因(pUC8的选择性标记)和lacZ’基因(编码β-半乳糖苷酶的一部分)。
某些大肠杆菌菌株具有一个修饰的lacZ基因,该基因中缺失lacZ’部分。
B.建立在大肠杆菌噬菌体基因组基础上的克隆载体最初尝试着发展能操作大片段DNA分子的载体集在λ噬菌体上。
λ噬菌体存在两种感染周期:
裂解性感染周期/溶源性感染周期
λ噬菌体基因组大小为48.5kb,其中有15kb为随意区域,可以被删除而不影响噬菌体感染细菌的能力。
据此,目前发明了两种类型的载体:
插入型载体:
该载体中部分或全部随意DNA被删除,并在删切后的基因组内部的某些位点引入一个单一的限制性酶切位点。
替代型载体:
该载体中随意DNA位于一填充片段内,两侧有一对限制性酶切位点,当要克隆的DNA连接到该载体时,这个区段就被取代。
λ噬菌体基因组是一个线性分子,但其两个末端具有12个核苷酸的单链突出,称为串联体
cos位点。
cos位点序列与λ噬菌体的体外包装密切相关。
C.用于更长DNA片段的载体a).考斯质粒(cosmid)、黏粒具有λcos位点的质粒,与λ噬菌体一样具有感染性。
插入片段可高达44kb
b).酵母人工染色体(YAC)在YAC中,构成这些染色体组件的DNA序列与一个或多个选择性标记物,至少一个限制性酶切位点连接起来,酶切位点是为了插入新的DNA,可用来克隆600-1400kb的片段。
一些类型的YAC载体有插入不稳定的问题,即克隆的DNA重排形成新的序列组合
c).细菌人工染色体(BAC)是基于天然的大肠杆菌F质粒构建的;能够克隆300kb及更长的片段,并且插入的片段很稳定;可以通过Lac筛选来鉴定重组体,是目前克隆大片段DNA最常用的载体。
d).P1噬菌体载体与λ载体相似,以天然噬菌体基因组的缺失形式为基础;P1基因组比λ基因组大,因此能克隆的DNA片段比λ载体大;运用目前的技术可以克隆长达125kb的片段。
e).P1衍生的人工染色体(PAC)综合了P1载体和BAC的特点,具有克隆长达300kb片段的容量。
f).Fosmids包含F质粒的复制起始位点和λ载体的cos位点,有出现不稳定问题的倾向。
4.ThePolymeraseChainReaction(PCR)
PCR是一种在体外借助于DNA聚合酶实现特定基因或DNA序列扩增的方法。
4.1PCR基本原理
4.2参与PCR反应体系的因素
•模板核酸:
基因组DNA(genomicDNA,gDNA),互补DNA(complementaryDNA,cDNA)。
•引物:
16-30bp,四种碱基随机发布,G+C%=40-60%,引物3’端不能错配。
•TaqDNA聚合酶:
来自嗜热水生古细菌,耐高温,不具3’-5’外切酶活性。
•缓冲液
•Mg2+:
与Taq酶的活性有关。
•dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)•PCR仪:
自动升降温,程序化。
•30个循环后能将目标序列扩增10亿倍以上。
4.3PCR的局限性和应用
•局限性:
a.必需知道被扩增DNA的边界序列才能PCR,因此不能用来纯化从未被研究过的基因片段。
b.扩增片段的长度。
一般扩增长达5kb的片段不会有太大困难,但要扩增更长片段存在麻烦。
c.存在非特异性扩增的问题。
主要是由于Taq酶缺少3’-5’外切酶的功能。
•应用:
基于PCR的分子标记;临床诊断;考古研究;基因表达分析(RT-PCR、实时定量PCR)等。
4.4RT-PCR
•反转录PCR(RT-PCR)是一种从RNA扩增cDNA拷贝的方法。
•RT-PCR对于克隆mRNA的5’、3’端序列和从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库以及测定基因表达的强度等方面都是极为灵敏和通用的方法。
•常用的逆转录酶有两种:
AMV逆转录酶和MMLV逆转录酶。
两步法适用于mRNA表达分析、效率高、使用Random和Oligo-dt引物制备cDNA库、cDNA可以长期保存
一部法适用于病毒、病原菌检测,操作简单、污染率低
4.5实时荧光定量PCR(FQ-PCR)
实时荧光定量PCR技术(real-timefluorescentquantitativePCR,FQ-PCR)
是一种在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法,实现了PCR从定性到定量的飞跃。
简单的说,就是在PCR体系中加入荧光,以便对反应体系和反应进程进行监测,记录,分析。
而PCR仪无非是在普通PCR的基础上加上个荧光探头和相应的数据处理软件而已。
在实时荧光定量PCR反应中,随着PCR反应的进行,PCR产物不断累加,荧光信号的强度也等比例增加,这样我们就可以通过荧光强度的变化来监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线图。
一般而言,荧光扩增曲线可以分成三个阶段:
荧光背景信号阶段,荧光信号指数扩增阶段和平台期。
在荧光背景信号阶段,扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖,我们无法判断产物量的变化。
而在平台期,扩增产物已不再呈指数级的增加,PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系,所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。
只有在荧光信号指数扩增阶段,PCR产物量与起始模板量的对数值之间存在线性关系,我们可以选择在这个阶段进行定量分析。
为了定量和比较的方便,在实时荧光定量PCR技术中引入了两个非常重要的概念:
荧光阈值和CT值。
荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值,它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上,但一般荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差(sd)的10倍。
CT值:
每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值(荧光阈值)时所经历的循环数被称为CT值(thresholdvalue)。
CT值与起始模板的关系研究表明,每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,CT值越小。
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线。
•因此,只要获得未知样品的CT值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
FQ-PCR的化学原理•实时荧光定量PCR的化学原理包括探针类和非探针类两种。
•探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加;非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增产物的增加。
•前者由于增加了探针的识别步骤,特异性更高,但后者则简便易行。
分子信标SYBRGreenI是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料。
由于SYBRGreenI能与所有的双链DNA相结合,不必因为模板不同而特别定制,因此设计的程序通用性好,且价格相对较低。
TaqMan探针是一种寡核苷酸探针,它的荧光与目标序列的扩增相关。
•分子信标是一种在靶DNA不存在时会形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。
•在此发夹结构中,位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。
在此结构中,荧光基团被激发后不是产生光子,而是将能量传递给淬灭剂,这一过程称为荧光谐振能量传递(FRET)。
由于淬灭剂的存在,由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。
•分子信标的茎环结构中,环一般为15-30个核苷酸长,并与目标序列互补;茎一般5-7个核苷酸长,并相互配对形成茎的结构。
荧光基团连接在茎臂的一端,而淬灭剂则连接于另一端。
•分子信标必须非常仔细的设计,以致于在复性温度下,模板不存在时形成茎环结构,模板存在时则与模板配对。
•与模板配对后,分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。
此时荧光基团被激发,发出自身波长的光子。
4.6反向PCR(inversePCR)反向PCR是对已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增和研究的一种简捷方法。
其原理是:
用限制性内切酶A消化DNA片段,然后用连接酶将酶切产物连接成环状,再用已知序列上两端相反方向的引物进行PCR扩增。
A和B分别为限制性内切酶及其酶切位点;P1和P2分别为引物;黑色区域为已知序列;空白区域为未知序列
Chapter3MappingGenomes1.概述
•测序工作中有一个局限性:
在一个测序反应中一般只能测出1kb左右的准确序列。
这就意味着长的DNA分子必须由一系列短的序列拼接而成,即需将大分子分解为片段,测出每一段的序列,再用计算机寻找重叠的部分,从而拼接成长的序列-鸟枪法(shotgun)。
•这种鸟枪法是小的原核生物测序的标准方法,但是对于较大的真核生物基因组来说是相当困难的,特别是当分析基因组的重复区域时会发生错误。
鸟枪法中遇到的问题-1、串联重复DNA,丢失2、基因组范围内的重复,错误拼接
•因此,必须首先建立一个基因组的图谱,通过标明基因或其他显著特征的位置,为测序提供指导。
•一旦得到了基因组图谱,基因组计划中的测序阶段可以采用下面两种方法之一进行:
(1)全基因组鸟枪法(whole
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