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PCR扩增反应的基本操作及理论知识
PCR扩增反应的基本操作及理论知识
第1节移液器的使用
一、移液器的工作原理
移液器的工作原理是活塞通过弹簧的伸缩运动来实现吸液和放液。
在活塞推动下,排出部分空气,利用大气压吸入液体,再由活塞推动空气排出液体。
使用移液器时,配合弹簧的伸缩性特点来操作,可以很好地控制移液的速度和力度。
二、移液器的操作使用
1.移液器规范操作步骤
第一步设定移液体积
从大体积调节至小体积时,为正常调节方法,逆时针旋转刻度即可,从小体积调节至大体积时,可先顺时针调至超过设定体积的刻度,再回调至设定体积,可保证最佳的精确度。
(见图1)
第二步装配移液器吸头:
将移液器端垂直插入吸头,向右微微转动(视具体移液器而定,eppendorf可以左右微微转动),上紧即可;
特别提示:
用移液器反复撞击吸头来上紧的方法是非常不可取的,长期这样操作,会导致移液器中的零部件因强烈撞击而松散,甚至会导致调节刻度的旋钮卡住。
(见图2)
第三步吸液和放液
吸液
↓
吸头尖端需浸入液面3mm以下
↓
慢吸慢放,控制好弹簧的伸缩速度
↓
放液时吸头尖端靠在容器内壁
2.移液小技巧
●预润湿吸液
粘稠液体可以通过吸头预润湿的方式来达到精确移液,先吸入样液,打出,吸头内壁会吸附一层液体,使表面吸附达到饱和,然后再吸入样液,最后打出液体的体积会很精确。
●正向吸液与反向吸液
正向吸液是指正常的吸液方式(见图4),操作时吸液可将按钮按到第一档吸液,释放按钮。
放液时先按下第一档,打出大部分液体,再按下第二档,将余液排出。
反向吸液(见图5)是指吸液时将按钮直接按到第二档再释放,这样会多吸入一些液体,打出液体时只要按到第一档即可。
多吸入的液体可以补偿吸头内部的表面吸附,反向吸液一般与预润湿吸液方式结合使用,适用于粘稠液体和易挥发液体。
3.错误的操作方式
错误:
装配吸头时用移液器反复撞击吸头,以上紧
正确:
插入吸头,左右轻转旋转上紧吸头
错误:
吸头与移液器不匹配,影响气密性
正确:
选用与移液器匹配的,有质量保证的吸头
错误:
吸液时,移液器倾斜吸液
正确:
垂直吸液
错误:
吸头内含有未打出的液体时,移液器平置于桌面
正确:
将移液器垂直挂在移液器支架上
错误:
用大量程的移液器移取小体积的液体
正确:
移液体积需保证在移液器所提供的量程范围之内才符合不准确度和不精确度的要求
错误:
吸取具有强挥发性的液体
正确:
如果一定要移取强挥发性的液体,应该在移液结束后立刻拆开移液器,让蒸汽挥发,同时,建议使用外置活塞式移液器。
错误:
吸液速度和放液速度过快
正确:
慢吸慢放
三、实验室内移液器的自行快速检测
移液器在使用过程中,如果怀疑其精确度,可根据以下提示自行检测:
怀疑一:
移液器是否有漏气?
1. 自行检测:
目视法检测:
将吸取液体后的移液器垂直静置15秒,观察是否有液滴缓慢的流出。
若有流出,说明有漏气现象。
2. 可能的原因:
- 吸头是否匹配?
——使用原装匹配的吸头
- 装配吸头时有无上紧?
- 移液器内部气密性不好?
怀疑二:
液体、移液器、吸头以及环境的温度差异是否会影响移液器的准确度?
移取液体的温度与吸头和移液器的温度不一致的情况下,液体温度高于吸头的,移取的液体体积会偏大,液体温度低于吸头的,移取的液体体积会偏小。
怀疑三:
液体样品的密度和水是否有非常明显的区别?
移液器出厂前的校准是用水作为标准液进行测试的,如果所操作的液体与水的比重有很大差异,所给出的不精确度和不准确度就不能满足,从而产生误差。
怀疑四:
吸液速度太快,是否会导致移液体积不准确?
吸液速度太快会产生反冲和气泡,导致移液体积不准确。
ps:
移液器长时间不用时建议将刻度调至最大量程,让弹簧恢复原形,延长移液器的使用寿命。
第2节PCR扩增反应的基本原理
一、聚合酶链式反应(PCR)的基本构成
PCR是聚合酶链式反应的简称,指在引物指导下由酶催化的对特定模板(克隆或基因组DNA)的扩增反应,是模拟体内DNA复制过程,在体外特异性扩增DNA片段的一种技术,在分子生物学中有广泛的应用,包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。
PCR基本原理:
是以基因组DNA为模板,4种dNTP为底物,在模板3’末端有引物存在的情况下,用酶进行互补链的延伸,多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。
在微量离心管中,加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、DNA聚合酶、Mg2+等。
因此参与PCR反应的物质主要为五种:
引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。
1.引物
引物是PCR特异性反应的关键,PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
引物设计有3条基本原则:
首先引物与模板的序列要紧密互补,其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构,再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。
引物的选择将决定PCR产物的大小、位置、以及扩增区域的Tm值这个和扩增物产量有关的重要物理参数。
好的引物设计可以避免背景和非特异产物的产生,甚至在RNA-PCR中也能识别cDNA或基因组模板。
引物设计也极大的影响扩增产量:
若使用设计粗糙的引物,产物将很少甚至没有;而使用正确设计的引物得到的产物量可接近于反应指数期的产量理论值。
当然,即使有了好的引物,依然需要进行反应条件的优化,比如调整Mg2+浓度,使用特殊的共溶剂如二甲基亚砜、甲酰胺和甘油。
对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功,但遵循某些原则,则有助于引物的设计。
(1)引物长度
PCR特异性一般通过引物长度和退火温度来控制。
引物的长度一般为15-30bp,常用的是18~27bp,但不应大于38bp。
引物过短时会造成Tm值过低,在酶反应温度时不能与模板很好的配对;引物过长时又会造成Tm值过高,超过酶反应的最适温度,还会导致其延伸温度大于74℃,不适于TaqDNA聚合酶进行反应,而且合成长引物还会大大增加合成费用。
(2)引物碱基构成
引物的G+C含量以40~60%为宜,过高或过低都不利于引发反应,上下游引物的GC含量不能相差太大。
其Tm值是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度,有效启动温度,一般高于Tm值5~10℃。
若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为55~80℃,其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
引物中四种碱基的分布最好是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
尤其3′端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。
(3)引物二级结构
引物二级结构包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等。
这些因素会影响引物和模板的结合从而影响引物效率。
对于引物的3’末端形成的二聚体,应控制其ΔG大于-5.0kcal/mol或少于三个连续的碱基互补,因为此种情形的引物二聚体有进一步形成更稳定结构的可能性,引物中间或5’端的要求可适当放宽。
引物自身形成的发卡结构,也以3’端或近3’端对引物-模板结合影响更大;影响发卡结构的稳定性的因素除了碱基互补配对的键能之外,与茎环结构形式亦有很大的关系。
应尽量避免3’末端有发卡结构的引物。
(4)引物3’端序列
引物3’末端和模板的碱基完全配对对于获得好的结果是非常重要的,而引物3’末端最后5到6个核苷酸的错配应尽可能的少。
如果3’末端的错配过多,通过降低反应的退火温度来补偿这种错配不会有什么效果,反应几乎注定要失败。
引物3’末端的另一个问题是防止一对引物内的同源性。
应特别注意引物不能互补,尤其是在3’末端。
引物间的互补将导致不想要的引物双链体的出现,这样获得的PCR产物其实是引物自身的扩增。
这将会在引物双链体产物和天然模板之间产生竞争PCR状态,从而影响扩增成功。
引物3’末端的稳定性由引物3’末端的碱基组成决定,一般考虑末端5个碱基的ΔG。
∆G值是指DNA双链形成所需的自由能,该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性,此值的大小对扩增有较大的影响。
应当选用3’端∆G值较低(绝对值不超过9),负值大,则3’末端稳定性高,扩增效率更高。
引物的3’端的∆G值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。
需要注意的是,如扩增编码区域,引物3′端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增特异性与效率。
另外末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基,因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。
(5)引物的5′端
引物的5′端限定着PCR产物的长度,它对扩增特异性影响不大。
因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性。
引物5′端修饰包括:
加酶切位点;标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等;引入蛋白质结合DNA序列;引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。
对于引入一至两个酶切位点,应在后续方案设计完毕后确定,便于后期的克隆实验,特别是在用于表达研究的目的基因的克隆工作中。
(6)引物的特异性
引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源,特别是与待扩增的模板DNA之间要没有明显的相似序列。
(7)引物稀释
通常引物稀释会稀释成10~20μM,也不排除做其他的用途使用,如Oligo(dT)、RandomPrimer均稀释为50μM。
2.酶及其浓度
TaqDNA多聚酶是耐热DNA聚合酶,是从水生栖热菌(Thermusaquaticus)中分离的。
TaqDNA聚合酶是一个单亚基,分子量为94000Da。
具有5’-->3的聚合酶活力,5’-->3’的外切核酸酶活力,无3’-->5’的外切核酸酶活力,会在3’末端不依赖模板加入1个脱氧核苷酸(通常为A,故PCR产物克隆中有与之匹配的T载体),在体外实验中,TaqDNA聚合酶的出错率为10-4~10-5。
此酶的发现使PCR广泛的被应用。
此酶具有以下特点:
(1)耐高温,在70℃下反应2小时后其残留活性在90%以上,在93℃下反应2小时后其残留活性是仍能保持60%,而在95℃下反应2小时后为原来的40%。
(2)在热变性时不会被钝化,故不必在扩增反应的每轮循环完成后再加新酶。
(3)一般扩增的PCR产物长度可达2.0kb,且特异性也较高。
PCR的广泛应用得益于此酶,目前各试剂公司中开发了多种类型的Taq酶,有用于长片段扩增的酶,扩增长度极端可达40kb;有在常温条件下即可应用的常温PCR聚合酶;还有针对不同实验对象的酶等。
一典型的PCR反应约需的酶量为2.5u(总反应体积为50μl时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。
3.dNTP的质量与浓度
dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。
dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1MNaOH或1MTris。
HCl的缓冲液将其pH调节到7.0~7.5,小量分装,-20℃冰冻保存。
多次冻融会使dNTP降解。
dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低。
4.模板(靶基因)核酸
模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一,传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。
SDS的主要功能是:
溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,SDS还能与蛋白质结合而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白质,特别是与DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂(酚与氯仿抽)抽提除去蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸,该核酸即可作为模板用于PCR反应。
一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于PCR扩增。
模板DNA投入量对于细菌基因组DNA一般在1~10ng/μl,实验中模板浓度常常需要优化,一般可选择几个浓度梯度(浓度差以10倍为一个梯度)。
在PCR反应中,过高的模板投入量往往会导致PCR实验的失败。
5.Mg2+浓度
Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的PCR反应中,各种dNTP浓度为200μmol/l时,Mg2+浓度为1.5~2.0mmol/l为宜。
Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性,使反应产物减少。
一般厂商提供的TaqDNA聚合酶均有相应的缓冲液,而Mg2+也已添加,如果特殊实验应采用无Mg2+的缓冲液,在PCR反应体系中添加一定量的Mg2+。
常用的反应体系如下:
试剂
使用量
TaKaRaTaq(5units/μl)
0.25μl
10×PCRBuffer(Mg2+free)
5μl
MgCl2(25mM)
3μl
dNTPMixture(各2.5mM)
4μl
引物F
0.2-1.0μM(finalconc.)
引物R
0.2-1.0μM(finalconc.)
模板
<500ng
ddH2O
Upto50
反应时先将上述溶液加热,使模板DNA在高温下变性,双链解开为单链状态;然后降低溶液温度,使合成引物在低温下与其靶序列配对,形成部分双链,称为退火;再将温度升至合适温度,在TaqDNA聚合酶的催化下,以dNTP为原料,引物沿5’→3’方向延伸,形成新的DNA片段,该片段又可作为下一轮反应的模板,如此重复改变温度,由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期,反复循环,使目的基因得以迅速扩增。
因此PCR循环过程为三部分构成:
模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成(见下图)。
图PCR的反应过程
1.模板DNA的变性
模板DNA加热到90~95℃时,常用94℃,双螺旋结构的氢键断裂,双链解开成为单链,称为DNA的变性,以便它与引物结合,为下轮反应作准备。
变性温度与DNA中G-C含量有关,G-C间由三个氢键连接,而A-T间只有两个氢键相连,所以G-C含量较高的模板,其解链温度相对要高些。
故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。
对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜(DMSO),并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃,时间适当延长,即所谓的热启动。
2.模板DNA与引物的退火
将反应混合物温度降低至37~65℃时,寡核苷酸引物与单链模板杂交,形成DNA模板-引物复合物。
退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。
一般要求引物的浓度大大高于模板DNA的浓度,并由于引物的长度显著短于模板的长度,因此在退火时,引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多,退火时间一般为30sec~2min。
3.引物的延伸
DNA模板-引物复合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条与模板DNA链互补的新链。
重复循环变性-退火-延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。
延伸所需要的时间取决于所扩增模板DNA的长度。
在72℃条件下,TaqDNA聚合酶催化的合成速度大约为40~60个碱基/秒。
经过一轮“变性-退火-延伸”循环,模板拷贝数增加了一倍。
在以后的循环中,新合成的DNA都可以起模板作用,因此每一轮循环以后,DNA拷贝数就2的指数倍增加。
每完成一个循环需2~4min,一次PCR经过30~40次循环,约2~3h。
扩增初期,扩增的量呈直线上升,但是当引物、模板、聚合酶达到一定比值时,酶的催化反应趋于饱和,便出现所谓的“平台效应”,即靶DNA产物的浓度不再增加。
PCR的三个反应步骤反复进行,使DNA扩增量呈指数上升。
反应最终的DNA扩增量可用Y=(1+X)n计算。
Y代表DNA片段扩增后的拷贝数,X表示平(Y)均每次的扩增效率,n代表循环次数。
平均扩增效率的理论值为100%,但在实际反应中平均效率达不到理论值。
反应初期,靶序列DNA片段的增加呈指数形式,随着PCR产物的逐渐积累,被扩增的DNA片段不再呈指数增加,而进入线性增长期或静止期,即出现“停滞效应”,这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。
大多数情况下,平台期的到来是不可避免的。
PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。
短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间,是需要扩增的特定片段。
短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的,以一个原始模板为例,在第一个反应周期中,以两条互补的DNA为模板,引物是从3'端开始延伸,其5'端是固定的,3'端则没有固定的止点,长短不一,这就是“长产物片段”。
进入第二周期后,引物除与原始模板结合外,还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。
引物在与新链结合时,由于新链模板的5'端序列是固定的,这就等于这次延伸的片段3'端被固定了止点,保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。
不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加,而“长产物片段”则以算术倍数增加,几乎可以忽略不计,这使得PCR的反应产物不需要再纯化,就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。
二、PCR反应特点
PCR反应具有以下特点:
1.强特异性
PCR反应的特异性决定因素为:
(1)引物与模板DNA特异性的结合;
(2)碱基配对原则;(3)TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性;(4)靶基因的特异性与保守性。
其中引物与模板的正确结合是关键,引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。
聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性,使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行,结合的特异性大大增加,被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。
再通过选择特异性和保守性高的靶基因区,其特异性程度就更高。
2.高灵敏度
PCR产物的生成量是以指数方式增加的,能将皮克(pg=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克(μg=10-6g)水平。
能从100万个细胞中检出一个靶细胞;在病毒的检测中,PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位);在细菌学中最小检出率为3个细菌。
3.快速简便
PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶,一次性地将反应液加好后,即在PCR仪上进行变性-退火-延伸反应,反应一般在2~4小时完成。
扩增产物常用电泳分析,操作简单易推广,如采用特殊PCR仪(荧光时时定量PCR仪)则可全程监测PCR反应的结果,故耗时将更短。
4.低纯度模板
不需要分离病毒或细菌及培养细胞,DNA粗制品及总RNA等均可作为扩增模板。
可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。
第三节PCR扩增反应的实施
一、PCR反应的条件
PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
1.温度与时间的设置
基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。
在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90~95℃变性,再迅速冷却至40~60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70~75℃,在TaqDNA聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸。
对于较短靶基因(长度为100~300bp时)可采用二温度点法,除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸(此温度TaqDNA酶仍有较高的催化活性)。
另外,当扩增片段较长,引物退火温度较高,一般高于65℃,也通常使用二温度点法,能够提供扩增片段的特异性。
(1)变性温度与时间:
变性温度低,解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。
一般情况下,93℃~94℃lmin足以使模板DNA变性,若低于93℃则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响。
此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性,就会导致PCR失败。
(2)退火(复性)温度与时间:
退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。
变性后温度快速冷却至40℃~60℃,可使引物和模板发生结合。
由于模板DNA比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。
退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度。
对于20个核苷酸,G+C含量约50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。
另外,引物的退火温度,一般在合成引物的时候,引物合成报告单中,都有已经计算好的退火温度。
常用的引物退火温度计算公式【Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T)复性温度=Tm值-(5~10℃)】,依本人经验,不是很准确。
在Takara公司合成的引物,退火温度需另算,要是在生工合成引物的引物报告单的退火温度是比较准确的。
如果遇到上游引物和下游引物的退火温度有几个温度梯度之差时,5摄氏度以内的,通常使用两个引物退火温度数值的平均数;5摄氏度以外时,首先要考虑的是使用touchdown法,忽略引物退火温度差,二次循环时,采用两个引物退火温度平均值。
在Tm值允许范围内,选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合,提高PCR反应的特异性。
复性时间一般为30~60sec,足以使引物与模板之间完全结合。
(3)延伸温度与时间:
TaqDNA聚合酶的生物学活性:
70~80℃,150核苷酸/S/酶分子;70℃,60核苷酸/S/酶分子;55℃,24核苷酸/S/酶分子;高于90℃时,DNA合成几乎不能进行。
(4)PCR反应的延伸温度一般选择在70~75℃之间,常用温度为72℃,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
PCR延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长度而定,一般1kb以内的DNA片段,延伸时间1min是足够的。
3~4kb的靶序列需3~4min;扩增10kb需延伸至15min。
延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。
对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些。
2.循环次数
循环次数决定PCR扩增程度。
PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度,一般的循环次数选在30~40次之间,循环次数越多,非特异性产物的量亦随之增多。
二、PCR扩增产物分析
PCR产物是否为特异性扩增,其结果是否准确可靠,必须对其进行严格的分析与鉴定,才能得出正确的结论。
PCR产物的分析,可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。
1.凝胶电泳分析:
PCR产物电泳,EB溴乙锭染色(EB替代物)紫外仪下观察,初步判断产物的特异性。
PCR产物片段的大小应与预计的一致。
(1)琼脂糖凝胶电泳:
通常应用1~2%的琼脂糖凝胶,供检测用。
电泳具体方法如下:
①1%的琼脂糖凝胶配制:
称取1g琼脂糖于锥形瓶中,用量筒量取100mL1×TAEbuffer,加热至融化,稍微冷却加入6μl的EB替代物,然后将胶导入插入梳子的模具中,冷却。
②拔去梳子,将胶移至电泳槽中,让电泳液没过凝胶孔;
③向凝胶孔中,加入PCR产物(小胶十一孔和大胶二十五孔均需要加入5μl样品)以及DNAMarker;
④盖上电泳槽盖,接通电源,130V,25min(或者120V,27min);
⑤电泳结束后,将胶去除,放置于紫外仪下,进行观察。
(2)聚丙烯酰胺凝胶电泳:
6~10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好,条带比较集中,可用于科研及检测分析。
2.核酸序列分析:
是检测PCR产物特异性的最可靠方法。
三、注意事项
①注意移液器
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