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对心血管起保护作用的天然药物白藜芦醇的研究概述
对心血管起保护的天然药物白藜芦醇的研究概述
摘要:
白藜芦醇是一种具有重要生理活性的多酚类化合物。
本文就天然药物白藜芦醇的理化性质、主要资源来源、生物活性、提取、分析检测及其在心血管保护方面的作用机制等进行了全方面阐述,并对白藜芦醇的发展前景进行了展望。
关键词:
白藜芦醇;心血管保护;生物活性;提取检测
引言
白藜芦醇(resveratrol,Res)具有芪类结构的一种非黄酮类多酚化合物,它是植物受到应激时自身合成的一种抗毒素[1]。
分子式为C14H12O3,分子量为228.25,白藜芦醇的纯品外观为无色针状结晶,无味,难溶于水,易溶于有机溶剂,溶解性顺序大致为:
丙酮>乙醇>甲醇>乙酸乙酯>乙醚>氯仿;在366nm的紫外光照射下产生紫色荧光,遇氨水等碱性溶液显红色,遇镁的甲醇溶液显粉红色,并能和三氯化铁一氰化钾起显色反应;利用此性质可以鉴定白藜芦醇。
在低温、避光条件下较为稳定,碱性环境中不稳定。
熔点256~258℃,升华温度261℃。
天然的白藜芦醇有顺反两种结构,自然界中主要以反式构象存在,两种结构可以分别与葡萄糖结合,形成顺式和反式白藜芦醇糖苷,而顺式和反式的白藜芦醇糖苷在肠道中糖苷酶的作用下可以释放出白藜芦醇。
在紫外光线照射下,反式白藜芦醇能够转化为顺式异构体[2]白藜芦醇及其糖苷分子式见图1。
图1白藜芦醇及其糖苷分子式
1白藜芦醇来源的主要资源植物
白藜芦醇(Resveratrol)及其衍生物主要存在于葡萄属、蓼属、花生属、藜芦属21个科、31个属的至少72种植物中,其中包括虎杖、决明、桑树等常见的药用植物,以及葡萄、花生等农作物。
目前天然白藜芦醇的主要来源植物是葡萄Vitis、虎杖Polygonumcuspidatum和花生peanut。
葡萄是葡萄科葡萄属落叶藤本植物,我国长江流域以北各地均有种植。
湖南、贵州等地野生及人工栽培的刺葡萄VitisdavidiiFoex中的白藜芦醇的含量比较高。
白藜芦醇在葡萄中的含量因品种的不同而有差异,含量差异也与土壤环境,栽培方法及病虫害等因素有关,另外不同的部位含量也不同。
葡萄中的白藜芦醇主要存在于葡萄藤、果皮与种子中,果肉中白藜芦醇含量很少或几乎没有。
白葡萄酒不含白藜芦醇,这是因为白葡萄酒在加工过程中没有使用葡萄皮。
一升红葡萄酒大约包含0.2-5.5毫克白藜芦醇。
红葡萄汁和西班牙玫瑰酒是其他的白藜芦醇来源,含量从0.06-1.30毫克之间(150毫升)。
虎杖Polygonumcuspidatum属蓼科蓼属植物,是多年生灌木状草本植物,主要分布于我国长江以南各省和湖北、四川等地。
虎杖的根和根茎是提取天然白藜芦醇的主要部位,天然白藜芦醇主要以虎杖苷的形式存在于虎杖植物中,白藜芦醇在植物中的含量很少,通过生物酵解的方法可以得到高含量的白藜芦醇。
其中,虎杖鲜根中的白藜芦醇含量高于鲜茎,鲜叶中几乎不含白藜芦醇。
花生又名落花生,属蝶形花科落花生属一年生草本植物。
原产于南美洲一带,世界上栽培花生的国家有100多个,亚洲最为普遍,次为非洲,据中国有关花生的文献记载栽培史约早于欧洲100多年。
花生红衣与仁中也含有相当多的白藜芦醇。
研究证实煮熟的花生和红葡萄的白藜芦醇含量很相似。
例如,一杯红葡萄可以提供大约0.25-1.25毫克白藜芦醇。
而一杯煮熟的花生也能够提供相同的数量。
2白藜芦醇的生物活性
心血管保护作用
白藜芦醇(resveratrol,RES)具有抗氧化、抗炎、抗增殖及抗衰老的作用。
动脉粥样硬化是冠心病的主要病理基础,“内皮损伤反应学说”认为氧化应激等因素损伤动脉内膜,诱导慢性炎症-纤维增生反应,导致动脉壁脂纹、粥样斑块及复合病变的形成。
近年研究发现,白藜芦醇可以通过多条信号通路对心血管系统产生保护效应,达到抗动脉粥样硬化的作用。
那么其心血管保护机制就包含以下几个方面。
2.1.1抗炎作用
目前认为,动脉粥样硬化是一种慢性炎症反应性疾病。
白藜芦醇的抗炎效应已经在多项动物和人体研究中证实。
白藜芦醇可以干扰血小板内皮细胞粘附分子等炎性介质的释放,调节多形核细胞的功能,抑制T细胞和巨噬细胞的活性。
2.1.2内皮保护功能
内皮功能紊乱是动脉粥样硬化的早期病变。
白藜芦醇可以增加内皮一氧化氮合成,改善内皮功能,这一作用与促进内皮型一氧化氮合成酶的表达或者提高其活性有关。
2.1.3抗氧化应激损伤
白藜芦醇是羟基过氧化物、金属离子诱导的自由基和过氧化氢的清除剂。
白藜芦醇通过抑制烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶和髓过氧化物酶等促氧化基因的表达而减少氧自由基的产生。
2.1.4抗血小板聚集作用
血小板聚集在粥样硬化病变血栓形成中具有关键作用,抗血小板治疗是降低心肌梗死和中风风险的重要措施。
白藜芦醇可抑制健康人的血小板聚集。
对于阿司匹林抵抗的患者,上述抑制作用仍然存在。
白藜芦醇的抗血小板作用可能与内皮源性的一氧化氮相关。
2.1.5调节血脂作用
活体研究显示白藜芦醇降低甘油三酯、极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白水平,减少低密度脂蛋白的氧化[3]。
白藜芦醇通过激活去乙酰化酶SIRT1,阻止前脂肪细胞的分化增殖,促进白色脂肪动员以及已分化脂肪细胞的分解。
抗衰老
03年哈佛大学教授及其团队研究发现白藜芦醇可激活乙酰化酶,增加酵母菌的寿命,激发了人们对白藜芦醇抗衰老研究的热潮。
Howitz等[4]发现白藜芦醇可以作为最强的沉默信息因子(SIRT1)的激活剂,可模拟热量限制(calorierestriction,CR)抗衰老反应,参与有机生物平均生命期的调控[5]CR是SIRT1的强诱导剂,能增加SIRT1在脑心肠肾肌肉和脂肪等器官组织中的表达,CR能够引起延缓衰老和延长寿命的生理变化,最显著可延长50%[6]到目前为止,有研究已经证实白藜芦醇具有能延长酵母线虫果蝇及低等鱼类寿命的功效。
2.3抗肿瘤、抗癌
白藜芦醇对鼠肝细胞癌[7]、乳腺癌[8-8]、结肠癌[10]、胃癌[11]、白血病[12]等多种肿瘤细胞均有显著抑制作用。
孟德平等[13]通过MTT法及流式细胞术证实了白藜芦醇对黑色素瘤细胞有明显的抑制作用报道显示,白藜芦醇可以提升癌症放射性治疗,发挥1+1>2的效果,有效抑制癌症干细胞的作用[14]但迄今为止,由于白藜芦醇抗肿瘤机制的复杂性,研究者们尚未对其作用机制达成共识。
2.4其他作用
白藜芦醇还具有抗菌、抗氧化、免疫调节、抗喘等一些其他生物活性。
由于白藜芦醇所具有的各种生物活性,使得白藜芦醇备受人们的追捧。
3白藜芦醇的提取
目前,白藜芦醇的制备方法主要有植物提取、化学合成和植物组织细胞培养等,植物提取的天然白藜芦醇食用安全,这正符合人们对“绿色消费”的要求,因此,越来越多的学者主张从天然植物中提取。
白藜芦醇传统的提取方法是有机溶剂提取法,但这种方法存在着对有效成分损失大,周期长,工序多,提取率不高等缺点,因此近10年来,在植物有效
成分的提取方面出现了许多新技术、新方法,如超临界CO2萃取技术、超声波提取技术、微波萃取技术以及酶解技术等。
3.1有机溶剂提取法
传统的有机溶剂提取法有回流、渗漉及恒温水浴等方法,提取的溶剂主要有甲醇、95%乙醇、无水乙醇和乙酸乙酯等。
虎杖白藜芦醇含量的分析测定中样品的处理多采用此方法,姚宝书等[15]利用浸提法对葡萄皮渣进行浸提,确定了乙酸乙酯提取多羟基芪类物质的条件。
俸灵林等[16]研究发现甲醇提取效果最好,提取率最高,且用HPLC测定时,杂质峰干扰少。
但由于有机溶剂提取时间长,对热不稳定成分易被破坏,杂质含量高,不易纯化,萃取溶剂消耗量大以及污染环境等缺点,许多学者都在研究开发新型提取方法。
3.2酶法提取
目前用于提取白藜芦醇的酶主要有纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶等。
李婷等[17]酶法提取白藜芦醇,葡萄皮渣/纤维素酶为1000︰1,在60℃下酶解90min,在乙酸乙酯中30℃浸提0.5h,浸提2次,白藜芦醇得率达到0.93mg/g。
钱时权等[18]用纤维素酶提取白藜芦醇,其含量最高为0.680mg/g。
酶法提取产品安全性高,生产条件温和,但由于细胞壁成分复杂,选用单一的酶往往不能达到很高的提取效率,因此根据不同细胞壁成分选用合适的酶对提取率非常关键,但酶制剂价格昂贵,要实现工业化生产,还有待研究。
研究者在探究酶的固定化及培育高产酶的菌株的同时,也在探索微波、红外等技术辅助酶解,提高酶解的效率。
3.3超临界流体萃取
超临界流体具有选择性高、快速、自动化程度高和不污染环境等优点。
通常采用不易燃、性质稳定、无毒、不污染环境的CO2作为超临界流体。
但是白藜芦醇在超临界CO2中的溶解度不高。
Berna等[19]研究了用于提取白藜芦醇的超临界流体的组成,即用乙醇—CO2共溶剂提取白藜芦醇,并得出最优的混合比例是共溶剂中含7.5%乙醇。
张青松等[20]以葡萄皮渣为原料,7.5%乙醇为夹带剂,38℃、13MPa下萃取17min白藜芦醇的收率为0.087%。
此外,Casas等[21]用含5%乙醇的乙醇—CO2共溶剂超临界萃取葡萄果渣中的白藜芦醇。
该法具有萃取和分离的双重作用,无相变过程因而节能,工艺流程简单,萃取效率高,产品质量好,但需要高压设备,设备投资大,流体中表面活性剂及夹带剂的加入量及添加方式等理论指导缺乏,夹带剂的回收及所导致的环境问题等有待进一步研究。
3.4超声波辅助提取
超声波辅助技术提取植物有效成分具有保持有效成分性质、高效、省时等优点。
Cho等[22]从葡萄径中提取白藜芦醇,乙醇/水80:
20作为提取试剂,超声频率48kHz,与传统提取相比,白藜芦醇含量与回收率均有很大提高。
林轶等[23]用40%的乙醇,超声104W处理30min,白藜芦醇的提取率3.50mg/g。
钱时权等[24]用纤维素酶与超声波结合法,从山葡萄渣中提取白藜芦醇,效果均很好。
此外,有研究者在超声波和环糊精的辅助下,使纯水成为提取溶剂,即找到了一种绿色提取方法。
超声波辅助技术在生物活性物质的提取上得到了广泛应用,但该方法仅适合实验室操作,工业生产上提取罐容积过大,易形成超声空白区,且超声功率难以和大的容积相匹配。
超声与微波、复合酶及表面活性剂的联用提取是将来很好的研究方向。
4白藜芦醇的分析检测
白藜芦醇的分析检测方法主要为高效液相色谱法、色谱—质谱法、毛细管电泳法、薄层扫描色谱法及一些其它方法等。
4.1高效液相色谱法(Highperformanceliquidchromatography,HPLC)
由于白藜芦醇的极性较小,分析检测上普遍采用反相高效液相色谱进行分析,色谱柱常用LichrospherC18、HypersilC18、EclipseXDBC18等,流动相常用乙睛-水、乙睛-冰乙酸和乙睛-磷酸等,检测器常用紫外、二级管阵列、电化学和荧光扫描检测器等。
由于白藜芦醇的顺、反异构体具有不同的线性,所以在用高效液相色谱进行定量时,需要顺、反异构体的两个标准样品。
王琴飞等[25]采用超声处理辅助提取HPLC直接进样梯度洗脱的方式,建立了一种快速提取检测葡萄叶片中白藜芦醇(Resveratrol)云杉苷(piceide)-葡萄素(-viniferin)-葡萄素(-viniferin)紫檀芪(pterostilbene)5种芪化物同时检测的液相方法,获得了满意的结果。
应用高效液相色谱荧光检测法建立了一种快速灵敏适用于分离和测定水果中顺,反白藜芦醇及白藜芦醇苷定量分析的方法,此法已得到较好的应用。
4.2色谱—质谱法
白藜芦醇是二苯乙烯类化合物,与其衍生物结构非常近,对其分析鉴定,一种测定方法难以满足精度和灵敏度特殊要求,因此色质联用技术成为分析该类化合物的一种重要的方法。
Philippe等[26]发现GC/MS法可以同时测定样品中顺式和反式结构的白藜芦醇,但是在进样前需用N,O-双三甲基硅烷基-三氟乙酞胺(BSTFA)试剂对样品进行衍生化处理。
Dominguez等[27]比较了紫外吸收与质谱在测定白藜芦醇含量时的不同条件,反式和顺式白藜芦醇在紫外吸收法测定时波
长分别为280nm和305nm,而质谱测定时分别为m/z228和m/z238。
Montes等[28]用气质联用法测定白藜芦醇,检出限低至0.8ng/mL。
Huang等采用HPLC—MS测定了24种水果的顺、反式白藜芦醇及其糖苷,证明了该方法能快速准确的测定。
该方法简化了试验的预处理步骤,可以对顺、反式两种白藜芦醇同步测定,且样品用量少,所用时间短,检测限很低。
但用该法测定的反式白藜芦醇偏低,顺式白藜芦醇偏高,色谱分离时产生的基质效应会导致测定结果的稳定性和重现性比较差,且设备较昂贵。
4.3毛细管电泳
与高效液相色谱法比,毛细管电泳分离柱效更高,速度更快,消耗更低,样品用量更少。
毛细管电泳能同时分离和检测白藜芦醇顺、反异构体。
刘芳华等[29]采用毛细管电泳—电化学检测法测定了白藜芦醇,在优化条件下,被测物浓度与峰电流在3个数量级范围内呈良好线性,检出限为1×10-7g/mL。
陈宪等[30]采用毛细管电泳—安培检测法同时测定白藜芦醇及其糖苷,两待测物在最佳分离条件时12min以内能够完全分离,检出限分别为1.6×10-7,2.3×10-7mol/L。
李利军等[31]用电堆积—非水毛细管电泳法同时测定虎杖中的大黄素、白藜芦醇及其糖苷,在最佳条件下,证明了该法重现性和准确度均较好。
毛细管电泳法分离能力比高效液相色谱差。
将其与电化学法、安培检测法等方法联合使用,是检测中的一个发展趋势。
因此开发高准确性、高灵敏度的检测器仍是该技术的研究热点。
4.4薄层扫描色谱法(Thinlayerscanningchromatography,TLC)
周国海等[32]以硅胶G为薄层吸附剂,三氯甲烷-丙酮-醋酸-水(4∶4∶0.5∶0.2)为展开剂,对虎杖各部位白藜芦醇的含量测定进行了方法学考察。
舒友琴等[33]首次采用聚酰胺薄膜作固定相,苯-甲醇-甲酸(10∶5∶1)为展开剂,利用荧光扫描法定量分析测定了虎杖白藜芦醇4种异构体,且与硅胶作固定相的薄层扫描色谱法相比,测定灵敏度提高了近100倍,此法也可应用于其他样品中的白藜芦醇及其异构体测定。
4.5其他方法
白藜芦醇的顺反异构体由于具有不同的吸收光谱,对火焰离子检测器或电子捕获检测器的响应不同,因此具有不同的线性特征,但白藜芦醇顺反异构体的示波特性相同,因此利用二次微分简易示波伏安法对白藜芦醇进行测定时只需反式白藜芦醇标准样品便可测其总量,且无需考虑样品保存条件等问题。
张寒俊等[34]探讨了干红葡萄酒中白藜芦醇荧光光谱检测的最佳条件,其激发波长和发射波长分别为346nm和384nm,检出限为8.14×10-10molL-1。
5展望
随着人们生活水平的不断提高,对保健品的需求日益增加,人们对白藜芦醇的研究还需进一步深入。
白藜芦醇的天然野生资源匮乏与市场的需求仍然存在着较大的差距,可通过对白藜芦醇资源植物进行人工栽培、育种或寻求新的富含白藜芦醇的天然来源的手段,得到更满意的高含量白藜芦醇新品种。
但植物提取技术面临成本高、得率低和植物资源有限等问题,故寻找反应条件温和、原料成本低操作相对简单的白藜芦醇人工转化与合成方法有着十分重要的意义。
采用物理法(微波和超声等)与有机溶剂的结合及复合酶与有机溶剂的结合等方法来提取白藜芦醇,以HPLC—MS法或HPLC—荧光法等检测法的联合使用来检测白藜芦醇,可以获得更多更高纯度的白藜芦醇产品。
如今,很多保健品生产企业都非常看好白藜芦醇的功能性,它作为终端产品的应用面有望不断拓宽,并且白藜芦醇被加入从低度酒向功能性的膳食补充剂的机会也越来越多。
随着白藜芦醇药理作用逐渐被认识,白藜芦醇的开发将形成各种相关产业链,以实现人们对保健品的新要求,白藜芦醇将会更加广泛更安全地应用到各个领域当中。
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