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核定位信号及其分析策略优秀doc资料
ISSN 100727626CN 1123870ΠQ
中国生物化学与分子生物学报
ChineseJournalofBiochemistryandMolecularBiology
2021年8月
25(8:
683~689
・综述・
核定位信号及其分析策略
赵元茵1, 王元忠1, 曹 念2, 周度金1, 李渝萍13
(1第三军医大学生物化学与分子生物学教研室,重庆 400038;2第三军医大学学员旅三队,重庆 400038
摘要 真核细胞核膜上的核孔复合体(nuclearporecomplex,NPC是细胞核内外进行物质交换的主要通道,分子量较小的化合物可自由通过NPC或采取被动扩散的方式进入细胞核,而分子量为50kD以上的蛋白质则只能通过主动转运进入细胞核.以这种方式进入细胞核的蛋白质必须在其氨基酸序列上拥有特殊的核定位信号(nuclearlocalizationsignal,NLS,以被相应的核转运蛋白(karyopherins识别.核定位信号具有多样性,包括经典核定位信号(classicalNLS,cNLS,内输蛋白β2识别的核定位信号(又称PY模体2NLS和其它类型的NLS.每一类NLS具有相似的特征,但并不具有完全保守的氨基酸组成.不同的NLS,往往对应着各不相同的核输入机制.而对同一蛋白质来说,也可能同时拥有几个功能性的NLS.研究核定位信号一方面可以帮助揭示新的大分子物质核转运机制,另一方面也有助于发现一些蛋白质的新功能.本文对常见NLS的分类进行了总
结,并介绍了两种常用的NLS预测软件及鉴定NLS的一般策略.
关键词 核转运机制;核定位信号;内输蛋白
中图分类号 Q291
CategoriesandResearchStrategiesofNuclearLocalizationSignal
ZHAOYuan2Yin1,WANGYuan2Zhong1,CAONian2,ZHOUDu2Jin1,LIYu2Ping13
(1DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing 400038,China;
2Squadron3ofCadetBrigade,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing 400038,China
Abstract Thenuclearporecomplex(NPCisinchargeoftheexchangeofmacromoleculesbetweenthenucleiandthecytoplasmofeucaryoticcells.ThesmallcompoundscangetintothenucleithroughtheNPCfreelyorbypassivediffusion.However,thoseproteinswhosemolecularweightsarelargerthan50kDcanonlygetintonucleibyactivetransport.Theremustbeoneormorespecialsignalsintheaminoacidsequences,so2callednuclearlocalizationsignals,whichcanberecognizedbyrespectivekaryopherins,inthoseproteins.
TherearediversesequencesinNLSs,includingclassicalNLS(cNLS,PY2NLS,whichcanberecognizedbyimportinβ2,andsomeotherNLSs.ThoughtherearesimilarpropertiesamongthesamefamilymembersofNLSs,thereisnofullyconservedaminoacidsequence.DifferentNLSsoftencorrespondtodifferentmechanismsofnucleartransport,andalso,coupleoffunctionalNLSsmayexistinonecertainprotein.ThestudiesonNLShelpusnotonlyrevealnewnucleartransportmechanismofmacromolecules,butalsodiscovernewfunctionsofproteins.CategoriesofNLSsweresummarizedbytheauthors.Twocommon2usedsoftwareemployedinNLSpredictionandthestrategiesusedtoidentifyNLSarealsointroducedinthisreview.
Keywords nucleartransportmechanism;nuclearlocalizationsignal;importin
收稿日期:
2021202217;接受日期:
2021204213
Received:
February17,2021;Accepted:
April13,2021
真核细胞的细胞核有核膜包被,核膜上的核孔复合体(nuclearporecomplex,NPC是细胞核内外进行物质交换的主要通道,化合物自由通过NPC的能力取决于它们的大小[1]:
分子量小于5kD的小分子(通常是离子、核苷酸和其它小分子可以自由通过NPC;分子量5~50kD蛋白质,扩散方式因其大小而异,小的蛋白一般通过被动扩散进入细胞核,但也不排除主动转运的情况.分子量越大,被动扩散的能力越弱;分子量大于50kD蛋白质只能通过主动转运进入细胞核.通过主动运输进入细胞核的蛋白质必须在其序列上拥有特殊的信号,即核定位信号(nuclearlocalizationsignal,NLS.NLS被相应的核转运蛋白(karyopherins识别,后者与核孔蛋白相互作用,帮助含NLS的货物蛋白通过核孔到达细胞核,此后货物蛋白与核转运蛋白解聚,前者定位于核内,后者回到细胞质循环使用.目前研究发现,大多数通过主动转运进出细胞核的蛋白质,其转运过程依赖于单体G蛋白Ran[2].核膜两侧Ran的存在形式决定了蛋白质转运的方向(详细机制见111[3,4].
不同类型的NLS对应着不同的核转运机制,对NLS的研究能够帮助人们更好的认识核转运这一生物学过程,也为发现某些蛋白质的新功能提供线索.
1 核定位信号的分类
111 经典核定位信号(classicalNLS,cNLS及其转运机制
cNLS是指其序列组成和转运机制研究得最为清楚,存在最为广泛的一类NLS.cNLS一般分为2种:
①单分型的NLS(monopartiteNLS,最初发现于SV40病毒大T抗原中,是一段4~8个氨基酸组成的富含碱性氨基酸的短肽(126PKKKRKV132.其中部一般包含4个或4个以上精氨酸(R和Π或赖氨酸(K,两端是酸性氨基酸或脯氨酸或甘氨酸[5].脯氨酸的存在可能是以其阻断碱性氨基酸残基上游的α2螺旋的形成.单分型NLS的核心序列可表示为K(KΠRX(KΠR[6];②双分型的NLS(bipartiteNLS,这类核定位信号以核质蛋白的核定位序列(155KRPAATKKAGQAKKKK170为典型,其特征是由两簇碱性氨基酸残基组成,两簇碱性序列之间被10~12个非保守氨基酸残基间隔,其序列通式可以表示为RΠK(X10212RRKK[7].
cNLS在核蛋白中的存在十分广泛,目前鉴定
研究发现有许多核蛋白并不是通过经典途径进入细胞核,它们往往不与内输蛋白α结合而直接与核转运蛋白β(kapβ相互作用从而完成主动转运[12].核转运蛋白β家族包括众多成员,其中有10余种可以作为入核载体.找到能被该家族识别的共有NLS序列是发现新型核定位信号和新型核转运机制的重要途径.但是由于kapβ家族各成员识别的NLS互不相同,同源分析也很难发现它们的共同特征,所以这一领域的研究进展并不显著.近期,Lee等[13]以内输蛋白β2(又称为转运蛋白,transportin为研究对象,在这一领域率先取得了突破.转运蛋白的底物通常是一类与mRNA编辑有关的核蛋白,尤其是核内不均一核糖核蛋白家族(heterogeneousnuclearribonucleoproteins,hnRNPs.其家族成员hnRNPA1含有一段长度为38个氨基酸残基名为M9的序列,该序列是最早确定的被转运蛋白识别的NLS[14].Lee等通过研究M9与转运蛋白结合面的蛋白质空间结构及氨基酸残基理化性质,发现了转运蛋白2NLS的一些基本特征,随后将此方法推广到其他6个已知转运蛋白底物的研究中,并总结出了转运蛋白2NLS的一般特征:
①该NLS属于线性表位;②通常是由30个以上氨基酸组成的肽段;③富含碱性氨基酸残基;④可以用序列通式表示其结构特征:
转运蛋白2NLS主要分成3个部分,它们分别是:
其羧基端的PY模体,距PY模体上游2~5个氨
486中国生物化学与分子生物学报25卷
Fig.1 Theclassicalnuclearimportcycle Inthecytoplasm,cargocontainingacNLSisboundbytheheterodimericimportreceptor,importinαΠimportinβ.ImportinαrecognizesthecNLS,andimportinβmediatesinteractionswiththenuclearporeduringtranslocation.Onceinsidethenucleus,RanGTPbindingcausesaconformationalchangeinimportinβ,whichreleasestheIBBregionofimportinα.Thisautoinhibitorydomain,togetherwithNup2andCse1,facilitatescNLSdissociationanddeliveryofthecNLScargointhenucleus.Finally,importinαisrecycledbacktothecytoplasmbytheexportreceptor,Cse1,incomplexwithRanGTP.ThefigureareadaptedfromLangeetal[22]
基酸的碱性氨基酸,和位于其中部的保守肽段(Fig.
2.PY模体是指转运蛋白2NLS羧基末端的两个保守氨基酸残基2脯氨酸和酪氨酸.突变试验发现,这2个氨基酸是转运蛋白2NLS发挥功能所必需的结构,因此转运蛋白2NLS被称为PY2NLS.与PY模体同样保守的是与其间隔2~5个氨基酸残基的1至2个碱性氨基酸(通常是精氨酸或赖氨酸,因此PY2NLS的羧基端序列通式用RΠKΠH2X(2252P2Y表示.位于PY2NLS的中部的保守肽段,一般由4~6个氨基酸残基组成.这一区域的氨基酸组成形式分为两类,一类为Φ2GΠAΠS2Φ2Φ(Φ为疏水性氨基酸,其特征是核心序列1、3、4位是疏水性氨基酸,2位为1个无侧链或短侧链氨基酸.这种结构模式可能与该NLS与转运蛋白结合面的疏水环境有关,因此也把这种NLS命名为疏水性PY2NLS即hPY2NLS,前面提到的M9NLS就属于这一类.另一类PY2NLS的中心区域并不是由疏水性氨基酸组成,而是由一串碱性氨基酸组成,被称为碱性PY2NLS,即bPY2NLS,这一类NLS存在于以核内不均一核糖核蛋白hnRNPM和转录共调节因子多谷氨酰胺结合蛋白1(polyglutaminebindingprotein1,PQBP21为例的转运蛋白底物中.bPY2NLS中碱性氨基酸的作用还不十分清楚,但是两种不同的NLS提示转运蛋白可能有不同底物结合位点,这与以往的研究相符[12].将总结出的PY2NLS通式用于预测已经取得了初步进展,有81个新的转运蛋白底物被发现,这些蛋白的功能并不仅仅局限于mRNA加工,而是涉及到细胞信号转导、细胞周期调控和细胞骨架等广泛领域.对其中5种蛋白的核转运机制进行深入研究发现,G蛋白Ran在转运蛋白与货物蛋白解聚中都发挥了重要作用.
PY2NLS的发现为寻找除cNLS以外的其它核定位序列开辟了新的途径,随着新的模式NLS用于NLS的预测,将有助于发现更多的核蛋白和核转运机制.
113 其它类型的NLS
11311 空间表位型核定位信号 前面提到的cNLS和PY2NLS都属于线性的NLS,自然界还存在空间表位的NLS.例如STAT1(signaltransducersandactivatorsoftranscription1,在它的一级结构中,并不存在被任何核转运蛋白识别的目标序列,但当其亚基聚合时,每个亚基的几个碱性氨基酸彼此靠近形成一个被内输蛋白α识别的空间表位,发挥NLS的功能[15].
11312 假核定位信号 目前,用NLS预测软件得到的相当数量的NLS并不一定具有核定位的能力,这种具有某类NLS的序列特征,但并不发挥功能的NLS称为假NLS(pseudoNLS.
11313 隐秘性核定位信号 另外还有很多预测出的NLS可能是隐秘性NLS(crypticNLS[16].这类NLS由于整个蛋白构象的原因或其两侧氨基酸序列的影响不能与核孔复合物上的受体结合,因此,平时不一定发挥核定位的功能.但在某些刺激信号存在下,蛋白发生构象的变化,则变为显性NLS即功能性NLS.很多I型核受体就是由于与胞浆蛋白如HSP等结合遮蔽了NLS,但在配体的结合下,构象发生变化,胞浆蛋白解离下来暴露NLS,核受体在NLS的介导下进入细胞核从而发挥功能.
11314 多核定位信号 更多的研究发现,在一个核蛋白中,往往存在不止一个有功能的核定位序
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第8期赵元茵等:
核定位信号及其分析策略
Fig.2 ConsensussequenceofNLSsrecognizedbyKapβ2 Alignmentofallknown(topandpredicted(bottomNLSsrecognizedbyKapβ2atconservedPYresidues.NLSsinknownKapb2substratesarepredictedbythepresenceoftheRΠKΠH2X(2252P2YC2terminalmotifswithinstructurallydisorderedandpositivelychargedregionsof30aminoacids.CentralhydrophobicmotifsΦGΠAΠSΦΦ(Φisahydrophobicsidechainandcentralbasicmotifsareshadedgrey.ThedataareadaptedfromLeeetal[13]
2 鉴定功能性核定位信号的步骤
211 蛋白质分子中核定位信号的确定
鉴定NLS的第一步通常是确定目的蛋白能否定位到细胞核内,最常用的方法是将目的蛋白与示踪分子融合,以明确全长蛋白的定位情况.再根据预测的情况,将全长分子”切割”为若干截断突变体,通过观察这些截断突变体的定位情况明确NLS的具体位置.目前,在观察蛋白质定位时常使用绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP或者加强型的绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP作为示踪分子.但在核定位信号鉴定时需要注意:
由于GFPΠEGFP的分子量(27kD较小,可以通过被动运输均匀分布于整个细胞,如果与小分子量的短肽融合,分子量依然较小(<50kD,理论上仍能自由通过NPC,这时可能出现以下情况:
用GFP示踪一小分子蛋白或短肽,发现绿色荧光的分布呈现核内多,胞浆少的特点,但该蛋白或短肽可能并不含有NLS,只是由于融合蛋白通过被动运输自由进入细胞核,在核内与其它分子发生相互作用而被滞留核中.针对这一现象,许多研究者都选择融合谷胱甘肽硫基转移酶(glutathioneS2transferase,GST的EGFP作为示踪分子[19,20].GST与EGFP融合蛋白的分子量53kD大于NPC准入上限,而且在生理条件下,GST会发生二聚化,从而使得GST2GFP融合蛋白复合物(分子量106kD只限定在细胞质分布.一旦有功能性NLS插入该分子,绿色荧光会从细胞质全部转入细胞核,对比十分明显[21].
686中国生物化学与分子生物学报25卷
212 核定位信号转运功能的鉴定
NLS是蛋白质通过主动运输进入核孔的充分必要条件[22].证明NLS必要性的常用策略是突变试验,即通过观察NLS突变前后,蛋白的核定位情况是否出现差别,明确NLS的功能.突变实验分为缺失突变和定点突变,缺失突变是指删除全部NLS,而保留蛋白的所有剩余序列,而定点突变则主要集中在NLS的碱性氨基酸,通常是将碱性氨基酸突变成为无侧链的非极性中性氨基酸—丙氨酸.此外,保持NLS的氨基酸组成不变,仅改变氨基酸残基的排列顺序也是一种很好的突变策略.
对于线性的NLS来说,将其连接到任何一个大分子蛋白质中都应该能够被相应的转运蛋白识别,因此在验证了NLS的必要性之后,还需要把这段序列移植到其它已知的胞浆蛋白中,如果该NLS的插入能够使胞浆蛋白定位到胞核,则说明此NLS是蛋白入核的充分条件.
213 核定位信号与核转运蛋白的结合
GST2捕获、免疫共沉淀之类的蛋白质体外相互作用的经典研究方法,都可用于寻找NLS的结合蛋白.但跟一般的蛋白质体外相互作用研究所不同的是,对于转运复合物的稳定性很可能依赖Ran存在形式的核蛋白,在进行该实验时可以考虑加入Ran2GTP的干扰实验[22].
214 影响核蛋白转运的因素分析
体外核输入系统是研究核蛋白转运机制的有力工具[23,24].该系统由几个部分组成:
①通透化细胞.无论悬浮细胞还是贴壁细胞都可进行通透化处理,最常用的是HeLa细胞.使用最广泛的通透剂是洋地黄苷(digitonin.洋地黄苷的作用靶点是胆固醇,由于细胞膜的胆固醇含量高于核膜,用适当剂量的洋地黄苷处理细胞后,会形成胞膜受损但核膜保持完整的半通透化细胞,细胞质经受损的胞膜流到胞外,故在这个系统中标记蛋白质能否进入细胞核完全依赖于细胞质成分的人为供给;②人造细胞质.早年,非洲蟾蜍的子宫胞质溶胶由于制作成本低廉,组织相容性好受到许多实验室的亲睐,但目前商品化的网织红细胞裂解物使用更加广泛.此外,HeLa细胞胞质溶胶也是比较常见的一类人造细胞质.人造细胞质的新鲜程度是影响整个体外核输入系统工作效率的关键因素,自制非洲蟾蜍子宫胞质溶胶的全部过程要在115d内完成,制好的胞质溶胶中还需加入DTT和Mg+以维持转运蛋白α、β以及Ran的活性.通过人为改变通透化细胞的人造胞浆成分就能够分析蛋白质核转运需要哪些辅助因素;
③系统转运底物.一个体外转运系统是否建立成功,还需要系统对照的检验,常用的系统转运底物有两类:
一是用化学交联的方法合成的TRITC(四乙基罗丹明2BSA(牛血清白蛋白2NLS,二是前面提到的GST2GFP2NLS融合蛋白.由于经化学交联制备的转运底物纯化过程比较繁琐,交联剂的用量难于把握,而且过量的四乙基罗丹明有可能结合到构成核定位序列的关键氨基酸残基———赖氨酸上,导致核定位序列丧失功能,所以更倾向使用人工合成的融合蛋白作为系统转运底物.利用体外核转运系统,不仅能够直观模拟核蛋白的入核过程,还能定性分析温度、能量、离子和转运蛋白类型等因素对转运过程的影响.目前,体外核输入系统的组分大多商品化,这将极大地促进核蛋白和转运机制的研究.
3 常用核定位信号预测软件
NLS研究的第一步,是对蛋白质的序列进行分析,以发现潜在的NLS.NLS预测软件为这一工作提供极大便利,使用这些软件有必要对它们的预测原理和特点有一个初步了解,在此介绍2种常用的NLS分析预测软件.
311 PSORTⅡ
PSORTⅡ通常用于发现cNLS,其工作原理主要是用下表的4个序列作为模版,利用K2最近邻算法对分析序列进行评分.另外,蛋白质碱性氨基酸的含量也是PSORTⅡ评价一个蛋白是否是核蛋白的重要因素,凡是碱性氨基酸含量超过20%的蛋白质,PSORTⅡ都认为是核蛋白[25].
Table1 ThepredictionpatternsemployedbyPSORTⅡPatternConsensusNLStype
4(KΠR4SV402like
(HΠP(KΠR3SV402like
7P(KΠR3SV402likeBipartite(KΠR2X10(KΠR325Bipartie
这样的工作原理,使PSORTⅡ对核蛋白的“准入门槛”较低,用该软件进行序列分析往往可以得到多个潜在NLS,这将给日后的鉴定工作增加一定的工作量.而且PSORTⅡ的比对版式仅限于cNLS,因此对于含有像PY2NLS这一类的核蛋白PSORTⅡ可能漏检.
312 PredictNLS
PredictNLS由哥伦比亚大学生物信息学中心研
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第8期赵元茵等:
核定位信号及其分析策略
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2 系统软件设计
本系统软件在MicrosoftVisualC++6.0环境下编写,包括用户操作界面、实时显示检测模块,数据通信模块,数据管理模块。
用户操作界面主要是为技术人员提供友好的人机接口,将经过处理的数据以直观的人性化的方式实时显示在屏幕上,并在重要数据进行监控,当其超过安全限值时在屏幕上显示报警状态;数据通信模块负责本地机与前端设备及后台机之间的通信任务;数据管理模块负责为技术人员提供数据,其中数据通信模块是整个系统的核心,软件流程图如图2
所示。
图2 软件流程图
3 网络传输与多线程机制
本系统采用TCP/IP参考模型,通信的两个进程间相互作
用的主要模式为C/S模式。
在通信过程中前台机不但要对采集到的数据做实
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