细胞实验步骤.docx
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细胞实验步骤.docx
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细胞实验步骤
玻璃器械洗消:
一、新的玻璃器皿的洗消:
1.自来水刷洗,除去灰尘。
2.烘干、泡盐酸:
烤箱中烘干,然后再浸入5%稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。
3.刷洗、烘干:
12小时后立即用自来水冲洗,再用洗涤剂刷洗,自来水冲干净后用烤箱烘干。
4.泡酸、清洗:
用清洁液(重铬酸钾120g:
浓硫酸200ml:
蒸馏水1000ml)浸泡12小时,然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次,最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。
5.烘干、包装:
洗干净后先烘干,然后用牛皮纸(油光纸)包装。
6.高压消毒:
包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子,打开开关和安全阀,当蒸气成直线上升时,关闭安全阀,当指针指向15磅时,维持20-30分钟。
7.高压消毒后烘干
二、旧的玻璃器皿的洗消:
1.刷洗、烘干:
使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中,泡过来苏尔溶液(洗涤剂)的器皿要用清水刷洗干净,然后烘干。
2.泡酸、清洗:
烘干后泡入清洁液(酸液),12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗(避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗),再用蒸馏水冲洗3次。
3.烘干、包装:
洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸(油光纸)等包装,以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。
4.高压消毒:
包装好的器皿装入高压锅内,盖好盖子,打开开关和安全阀,随着温度的上升安全阀冒出蒸气,当蒸气成直线冒出3-5分钟后,关闭安全阀,气压表指数随之上升,当指针指向15磅时,调节电开关维持20-30分钟即可。
(玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上)
5.烘干备用:
因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿,所以要放入烤箱内烘干备用。
金属器械洗消:
金属器皿不能泡酸,洗消时可先用洗涤剂刷洗,后用自来水冲干净,然后用75%酒精擦拭,再用自来水,然后用蒸馏水冲洗,再烘干或空气中晾干。
放入铝制盒内包装好在高压锅内15磅高压(30分钟)消毒,再烘干备用。
橡胶和塑料:
橡胶和制品通常处理方法是:
先用洗涤剂洗刷干净,再分别用自来水和蒸馏水冲干净,再用烤箱烘干,然后根据不同品质进行如下的处理程序:
1.针式滤器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小时,或者煮沸20分钟,在包装之前要装好滤膜两张,安装滤膜时注意光面朝上(凹向上),然后将螺旋稍微拧松一些,放入铝盒中在高压锅内15磅30分钟消毒,再烘干备用。
注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。
2.胶塞烘干后用2%氢氧化钠溶液煮沸30分钟(用过的胶塞只要用沸水处理30分钟),自来水洗净,烘干。
然后再泡入盐酸液30分钟,再用自来水,蒸馏水,三蒸水洗净,烘干。
最后装入铝盒内高压消毒,烘干备用。
3.胶帽,离心管帽烘干后只能在2%氢氧化钠溶液中浸泡6-12小时(切记时间不能过长),自来水洗净,烘干。
然后再泡入盐酸液30分钟,再用自来水,蒸馏水,三蒸水洗净,烘干。
最后装入铝盒内高压消毒,烘干备用。
4.胶头可用75%酒精浸泡5分钟,然后紫外照射后使用即可。
5.塑料培养瓶,培养板,冻存管:
6.其他消毒方法:
有的物品既不能干燥消毒,又不能蒸气消毒,可用70%酒精浸泡消毒。
塑料培养皿打开盖子,放在超净台台面上,直接暴露在紫外线下消毒。
也可用氧化乙烯消毒塑料制品,消毒后需要用2—3周时间洗除残留的氧化乙烯。
用20000—100000rad的r射线消毒塑料制品效果最好。
为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆,可在纸包装后,用密写墨水作好标记。
其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水,在包装纸上作一记号,平时这种墨水不带痕迹,一经高温,即出现字迹,从而可以判定它们是否消毒。
密写墨水的配制:
氯化钻(CoC12?
6H2o)2g,30%盐酸10m1,蒸馏水88m1。
注意事项:
1.严格执行高压锅的操作规程:
高压消毒时,先检查锅内是否有蒸馏水,以防高压时烧干,水不能过多因为其将使空气流畅受阻,会降低高压消毒效果。
检查安全阀是否通畅,以防高压时爆炸。
2.安装滤膜时注意光面朝上:
注意滤膜光滑一面是正面,要朝上,否则起不到过滤的作用。
3.注意人体的防护和器皿的完全浸泡:
A.泡酸时要戴耐酸手套,防止酸液溅起伤害人体。
B.从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面,会腐蚀地面。
C.器皿浸入酸液中要完全,不能留有气泡,以防止泡酸不彻底。
PCR实验操作程序
1.在无菌的0.5ml或0.2ml离心管中按下列操作程序加样:
反应物加样顺序体积(μl)终浓度
去离子水129.4
10×BufferB251×
4×dNTP混合物35各200μmol/L
MgCl2431.5mmol/L
有义引物52.60.25μmol/L
反义引物62.60.25μmol/L
模板720.1μg
TaqDNA聚合酶80.41unit
2.用微量可调加样器和一次性Tip向每一管中加50μl矿物油。
每加一管换一次Tip。
3.振荡每只管,然后短暂离心。
4.将管放到预热的热循环中,按下列程序开始循环:
预变性94℃4分钟1次
变性94℃1分钟
退火37-65℃1分钟
延伸72℃1分钟
循环30次
终延伸72℃7分钟1次
保存4℃
5.将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,分析结果。
电泳条件:
60-80V,15-20分钟。
6.紫外分析仪检查电泳结果。
四、讨论
1.假阴性,不出现扩增条带
PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量,④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板:
①模板中含有Taq酶抑制剂,②在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。
③模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时,不出现扩增带,有可能是模板核酸提取过程出了毛病,可使用阳性对照的DNA模板配合检查模板质量。
酶失活:
需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
引物:
引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为:
①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏,导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度:
Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变:
通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul、或100ul,应用多大体积进行PCR扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定,在做小体积如20ul后,再做大体积时,一定要模索条件,否则容易失败。
物理原因:
变性对PCR扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性;退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率,退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。
有时还有必要用标准的温度计,检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度,这也是PCR失败的原因之一。
靶序列变异:
如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR扩增是不会成功的。
2.假阳性
出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高。
引物设计不合适:
选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行PCR扩增时,扩增出的PCR产物为非目的性的序列。
靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性。
需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染:
这种污染有两种原因:
一是整个基因组或大片段的交叉污染,导致假阳性。
这种假阳性可用以下方法解决:
①操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
②除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。
③必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸。
二是空气中的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。
可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCR产物,而导致假阳性的产生,可用巢式PCR方法来减轻或消除。
3.出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
非特异性条带的出现,其原因:
一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。
二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数过多有关。
其次是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
其对策有:
①必要时重新设计引物。
②减低酶量或调换另一来源的酶。
③降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数。
④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性,65℃左右退火与延伸)。
4.出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。
其原因往往由于酶量过多或酶的质量差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起。
其对策有:
①减少酶量,或调换另一来源的酶。
②减少dNTP的浓度。
③适当降低Mg2+浓度。
④增加模板量,减少循环次数。
PCR及RT-PCR之基础问题解答
1.问题:
RT-PCR灵敏度:
在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。
可能原因:
1)RNA被降解
建议解决方法:
在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA;
在将组织从动物体取出后立刻处理在100%甲酰胺中储存RNA;
如果使用胎盘RNase抑制剂,不要加热超过45℃或pH超过8.0,否则抑制剂或释放所有结合的RNase。
而且,在≥0.8mMDTT时加入RNase抑制剂,一定要存在DTT。
2)RNA中包含逆转录抑制剂
建议解决方法:
通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。
用70%(v/v)乙醇对RNA沉淀进行清洗。
可以加入糖元(0.25μg到0.4μg/μl)以帮助小量样品RNA的恢复。
逆转录抑制剂包括:
SDS,EDTA,甘油,焦磷酸钠,spermidine,甲酰胺和胍盐。
将对照RNA同样品混合,同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。
3)多糖同RNA共沉淀
建议解决方法:
使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。
4)用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火
建议解决方法:
确定退火温度适合您的引物。
对于随机六聚体,建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。
对于基因特异性引物(GSP),可以试一下其他GSP,或换用oligo(dT)或随机六聚体.
确定GSP是反义序列。
5)起始RNA量不够
建议解决方法:
增加RNA量。
对于<50ng的RNA样品,可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。
6)RNA模板二级结构太多
建议解决方法:
将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火.
提高逆转录反应温度,对SuperScriptⅡ可以到50℃,对ThermoScript可以到65℃。
注意:
不要在>60℃时使用oligo(dT)引物,选择一个在反应温度可以退火的GSP。
对于>1kb的RT-PCR产物,保持反应温度≤65℃。
注意:
不要在高于37℃时使用M-MLV。
如果不需要全长cDNA,在第一链反应中使用随机引物。
7)引物或模板对残余的RNA模板敏感
建议解决方法:
在PCR前用RNaseH处理。
8)靶序列在分析的组织中不表达
建议解决方法:
尝试其他靶序列或组织
9)PCR没有起作用
建议解决方法:
对两步法RT-PCR,不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物。
2.问题:
PCR灵敏度:
在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。
可能原因:
1)PCR引物设计较差
建议解决方法:
避免在引物3'端含有互补序列。
避免可以形成内部发卡结构的序列。
设计Tm类似的引物。
2)DNA含有抑制剂
建议解决方法:
诸如DMSO,SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制TaqDNA聚合酶。
如果怀疑污染了抑制剂,可以使用乙醇沉淀DNA。
3)富含GC的模板
建议解决方法:
对于GC含量>50%的模板,使用PCRxEnhancerSolution。
4)模板浓度太低
建议解决方法:
使用104拷贝的靶序列,以在25到30个循环中获得信号。
5)镁离子浓度太低
建议解决方法:
从1mM到3mM,间隔0.5mM进行一系列反应,确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。
注意:
对实时定量PCR,使用3mM到5mM的镁离子浓度。
6=退火温度太高
建议解决方法:
使用表4的公式估算Tm,把退火温度设定为低于Tm5℃。
因为这些公式只是估算Tm值,所有真正的退火温度实际会高些或低些。
7=引物浓度太低
建议解决方法:
最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。
为了精确确定引物浓度,在260nm测量光密度,然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。
3.问题:
RT-PCR特异性:
在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。
可能原因:
1=物和模板非特异性退火
建议解决方法:
在第一链合成中使用GSP,而不是随机引物或oligo(dT)。
试用允许高温cDNA合成的GSP。
2=GSP设计较差
建议解决方法:
遵循用于扩增引物设计的同样原则
3=RNA中沾染了基因组DNA
建议解决方法:
使用扩增级DNaseⅠ处理RNA。
使用没有逆转录的对照反应检测DNA污染。
4.问题:
PCR特异性:
在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。
可能原因:
1=形成引物二聚体
建议解决方法:
设计在3'端没有互补序列的引物。
2=引物和模板非特异性退火
建议解决方法:
以2℃到5℃间隔增加退火温度,减少退火时间。
在开始几个循环使用较高的退火温度,然后使用较低的退火温度。
使用PlatinumTaqDNA进行自动热启动PCR。
避免在引物3'端含有2到3个dG或dC。
3=镁离子浓度太高
建议解决方法:
对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。
4=因为扩增复杂模板导致引物错误起始
建议解决方法:
使用巢式PCR或递减PCR。
5=沾染外源DNA
建议解决方法:
使用抗气雾剂的tip和UDG。
6=因为二级结构导致引物结合位点无法接近
建议解决方法:
对于GC含量>50%的模板,使用(1×-3×)PCRxEnhancerSolution。
5.问题:
PCR忠实性:
PCR在产物序列中引入了错误
可能原因:
1=聚合酶忠实性低
建议解决方法:
使用带有校正活性的热稳定聚合酶,如PlatinumPfxDNA聚合酶。
2=循环数太多
建议解决方法:
降低循环数。
3=四种dNTP的浓度不同
建议解决方法:
制备新的dNTP混合物,保证四种核苷浓度相同。
使用预混合物。
从RNA抽提到电泳鉴定
RNA抽提
一,准备工作
1,实验器具与材料:
(1)移液枪:
1ml、200ul、10ul
(2)吸头:
1ml、200ul、20ul
(3)吸头台:
放置1ml吸头的一个,放置200ul和20ul的吸头一个
(4)EP管1.5ml、100ul
(5)玻璃研磨器
(6)容量瓶:
1000ml
(7)盐水瓶:
100ml
(8)15ml塑料管一个(配75%乙醇用)
2,实验器具的处理与准备
(1)塑料制品:
(包括吸头、EP管等)
将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中(必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水)37℃过夜,然后送至高压3次,后在80℃烘烤箱中烘干(或置于37℃中8小时左右烘干),试验前将枪头放入吸头台。
(2)玻璃制品:
(主要是玻璃研磨器)
先泡酸过夜,冲洗干净后,在1‰DEPC水中泡8小时左右,37℃烘干,用蒙锡纸包裹送至干烤3次。
(3)金属制品:
(镊子等)
先洗干净,再送干烤3次。
(不需要泡DEPC水)
3,试剂配制和准备:
(1)DEPC水:
泡实验器具的DEPC水的配制:
1000ml双蒸水中加1mlDEPC,放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。
配75%乙醇的DEPC水的配制:
100ml盐水瓶内装40ml双蒸水,加40ulDEPC,37℃过夜,送至高压。
(2)75%乙醇(要在抽提时现配):
用无水乙醇和DEPC水配制(DEPC水:
无水乙醇=1:
3),然后放于-20℃备用。
(3)异丙醇:
放入棕色瓶
(4)氯仿:
放入棕色瓶
(5)Trizol:
100ml/瓶存放于4℃
二,抽提时注意事项:
全程佩戴一次性手套和口罩,手套要勤换,避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。
三,抽提步骤
1.匀浆化作用
取约100mg鼠脑组织放于玻璃研磨器内,先加0.2ml的Trizol溶液,研磨组织后,倒入1.5mlEP管中,再在研磨器内加入0.8ml的Trizol溶液洗,后全部再倒入EP管中。
颠倒混匀10下,室温静置5分钟。
2.分离阶段
每1mlTrizol中加0.2ml氯仿。
盖紧样品管盖,用手用力摇晃试管15秒,使其充分混匀,室温静置5分钟。
后12000rmp离心15分钟。
3.RNA的沉淀
将上层水相转入新的1.5mlEP管中(约400-500ul),加入0.5ml异丙醇,混匀后放于-20℃中1小时,后12000rmp离心10分钟。
4.RNA的洗脱
小心倒掉上清,留取沉淀。
加1ml现配的75%的乙醇(预冷)振荡洗涤RNA沉淀一次,后7500rmp离心5分钟。
5.RNA的再溶解
小心倒掉上清,取沉淀置超净工作台开风机吹干(约30分钟,此时RNA沉淀变透明)。
注意不能让RNA沉淀完全干燥(会极大地降低它地可溶性)。
再在管中加20ul的DEPC水溶解,在55-60℃下孵育10分钟助溶。
6,RNA的保存
提取的RNA保存于-70℃超低温冰箱中,或立即用于逆转录。
TRIzol法抽提总RNA细胞
组织100mg1×107
↓
加1mlTRIzol
↓细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块
匀浆(要彻底,后转至EP管)
(组织匀浆量>100mg时分装1ml/每EP管)
↓
颠倒混匀10下,室温5分钟
↓
加氯仿1/5体积(0.2ml)(必须按总体积的1/5)
↓
颠倒混匀15S,室温5分钟
↓
4℃,离心12000rmp,15分钟
↓
转上层水相(约400-500μl)于另一新1.5mlEP管中
↓
加等体积异丙醇(约400-500μl),混匀后-20℃中1小时
↓
4℃,离心12000rmp,10分钟
↓
弃上清
↓
加冰预冷的75%乙醇(用高压后的DEPC水配)1ml
↓
4℃离心7500rmp,5分钟
↓
弃上清,超净工作台开风机干燥约30分钟(不能完全干燥)
↓
溶于DEPC水中至20μl(10μl-20μl)
(可在55-60℃水中,<10分钟助溶)
↓
立即保存于-70℃超低温冰箱中,或立即用于逆转录
逆转录(RT)
一,准备工作
1,实验器具与材料:
(1)移液枪:
200ul、10ul
(2)吸头:
200ul、20ul
(3)EP管1.5ml、100ul
(4)水浴箱
2,实验器具的处理与准备
塑料制品:
(包括吸头、EP管等)
将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中(必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水)37℃过夜,然后送至高压3次,后在80℃烘烤箱中烘干(或置于37℃中8小时左右烘干),试验前将枪头放入吸头台。
3,试剂配制和准备:
(1)DEPC水:
泡实验器具的DEPC水的配制:
1000ml双蒸水中加1mlDEPC,放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。
逆转录中所用的DEPC水的配制:
100ml盐水瓶内装40ml双蒸水,加40ulDEPC,37℃过夜,送至高压,后分装到几个1.5mlEP管中,-20℃中保存备用。
(2)RT中所需要的各种试剂
(3)引物浓度计算方法:
(新合成的引物的稀释)假如终浓度为XuM(pmol/ul)加DEPC水体积(ul)=(OD×33×1000000)/(分子量×X)
二,RT时注意事项:
为避免RNA酶污染,在RT中仍要佩戴一次性手套和口罩。
三,RT步骤
用SSⅢ逆转录酶进行RT(20ul体积)
1,准备0.65ml的EP管
2,冰上操作:
在EP管中加入10ulDEPC水,1ul引物,1ul模板RNA,1uldNTP,短暂离心。
3,65℃水浴5分钟后,立刻0℃冰水浴至少1分钟。
4,短暂离心后,冰上操作:
加入4ul5×First-StrandBuffer,1ul0.1MDTT,1ulRNAseInhibitor,1ulSSⅢ逆转录酶。
5,短暂离心
6,50℃水浴60分钟进行逆转录。
7,70℃水浴15分钟灭活逆转录酶
8,-20℃保存,或立即进行PCR。
用AMV逆转录酶进行RT(10ul体积)
1,准备0.65mlEP管
2,加入4.5ulDEPC水,1ul引物,1ul模板RNA
3,稍离心,100℃沸水裕1min
4,加入0.5uldNTP,2ul5×Buffer,1ulAMV逆转录酶
5,稍离心,封口膜封口,42℃水浴90℃作RT
6,100℃沸水裕3min灭活AMV
7,立即PCR或-20℃保存。
聚合酶链式反应(PCR)
二,准备工作
8,实验器具与材料:
(1)移液枪:
200ul、10ul
(2)吸头:
200ul、20ul
(3)吸头台:
放置200ul和20ul的吸头一个
(4)EP管1.5ml、100ul
2,实验器具的处理与准备
(1)塑料制品:
(包括吸头、EP管等)
送至高压3次,试验前将枪头放入吸头台。
3,试剂配制和准备:
(1)双蒸水:
100ml盐水瓶内装40ml蒸馏水,送至高压,后分装到几个1.5mlEP管中,-20℃中保存备用。
(2)PCR中所需要的各种试剂
三,PCR时注意事项:
佩戴一次性手套,同时避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。
四,PCR步骤
1,准备100ulEP管
2,依次在管中加入:
(50ul反应体系)
ddH2O37.5ul×?
10mMdNTP1ul×?
10×PCRbuffer5ul×?
25mMMgcl2(加之前要摇匀)3ul×?
上游引物1ul×?
下游引物1ul×?
模板cDNA1ul
3,稍离心
4,100℃沸水浴1分钟
5,趁热加入Tag酶0.5ul(冰上操作)
6,再加入50ul液体石蜡封闭
7,10000rmp离心1分钟
8,PCR条件
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