酵母双杂交实验作业流程精.docx
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酵母双杂交实验作业流程精.docx
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酵母双杂交实验作业流程精
模块七蛋白质之间相互作用
1.试验目标
本试验以重组质粒和酵母细胞为材料,学习检测蛋白质相互作用基础原理和技术方法。
关键介绍酵母双杂交基础原理和操作技术;让学生了解和掌握酵母双杂交系统应用;掌握酵母感受态制备基础原理和关键操作步骤。
2.试验原理
1989年Fields和Song等人依据当初大家对真核生物转录起始过程调控认识(即细胞内基因转录起始需要转录激活因子参与,提出并建立了酵母双杂交系统。
该系统作为发觉和研究活细胞体内蛋白质和蛋白质之间相互作用技术平台,近几年得到了广泛利用和发展。
相比于其它蛋白质筛选系统,酵母双杂交系统含有以下优点:
(1检测在真核活细胞内进行,在一定程度上代表细胞内真实情况。
(2作用信号是在融合基因表示后,在细胞内重建转录因子作用而给出,省去了纯化蛋白质繁琐步骤。
(3检测结果是基因表示产物积累效应,所以可检测存在于蛋白质之间微弱或临时相互作用。
(4酵母双杂交系统可采取不一样组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库,能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多个不一样亚细胞部位及功能蛋白。
(5经过mRNA产生多个稳定酶使信号放大。
同时,酵母表型、X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。
酵母双杂交系统也含有一定不足。
首先,经典双杂交系统分析蛋白间相互作用定在细胞核内,所以限制了该系统对一些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白研究。
酵母双杂交系统另一个局限性是“假阳性”。
在酵母双杂交系统建立早期阶段,因为仅仅采取β-半乳糖苷酶这一单一汇报基因体系,这种汇报基因表示往往不能十分严谨地被控制,所以轻易产生假阳性。
因为一些蛋白本身含有激活转录功效或在酵母中表示时发挥转录激活作用,使DNA结合结构域融合蛋白在无特异激活结构域情况下也可被激活转录。
另外一些蛋白表面含有对多个蛋白质低亲和力区域,能和其她蛋白形成稳定复合物,从而引发汇报基因表示,产生“假阳性”结果。
产生“假阴性”结果原因可能有很多蛋白质间相互作用依靠于翻译后加工如糖基化、磷酸化和二硫键形成,还有些蛋白正确折叠和功效有赖于一些非酵母蛋白辅助等。
现在酵母双杂交系统大全部采取多个汇报基因,如AH109酵母株含有三类汇报基因—ADE2、HIS3、MEL1/lacZ,这三类汇报基因受控于三种完全不一样、异源性GAL4-反应元件和三类开启子元件-GAL1、GAL2和MEL1(图6-1-1。
经过这种方法就消除了两类最关键假阳性,一类是融合蛋白能够直接和GAL4结合位点结合或是在结合位点周围结合所带来假阳性;另一类是融合蛋白和某种转录因子结合后再结合到特定TATA盒上所带来假阳性。
ADE2一个汇报基因就已经能够提供较强营养选择压力,这时选择性地使用HIS3汇报基因,一来能够降低假阳性率;二来能够控制筛选严格性(假如需要筛选和诱饵蛋白含有较强结合蛋白,就能够同时使用ADE2、HIS3两种汇报基因;假如只需要筛选和诱饵蛋白含有中等强度或较弱结合蛋白,就能够使用ADE2或HIS3二者中一个。
MEL1和lacZ分别编码α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶,能够作用于对应底物
X-α-Gal和X-β-Gal使酵母变蓝。
其中,α-半乳糖苷酶是外分泌酶,在酵母表面就能直接检测到;β-半乳糖苷酶是内分泌酶,需要将酵母破碎后才能检测到。
用蓝斑显示酵母细胞内两个蛋白相互作用方法不仅含有较高敏感性,而且蓝斑深浅还能够反应两个蛋白相互作用强弱。
伴随酵母双杂交系统广泛应用,这一系统得到了不停完善及改善,除了经典双杂交系统以外,同时也衍生出单杂交系统、三杂交系统、反向酵母双杂交系统、hSos/Ras募集系统(hSos/Rasrecruitmentsystems、泛素分裂系统(Split-ubiquitinsystems、双诱饵系统(Dual-baitsystems等一系列相关系统,依据这些系统不一样特点,能够分别应用于蛋白质和DNA、RNA相互作用、蛋白质复合体之间相互作用、膜蛋白质之间相互作用、筛选阻断蛋白间相互作用药品等一系列领域,对经典酵母双杂交系统起到了很好补充,并有力地推进了酵母双杂交系统发展和应用。
酵母双杂交系统原理是利用转录激活因子在结构上是组件式,即这些因子往往由两个或两个以上相互独立结构域组成,其中有DNA结合结构域(DNAbindingdomain,DB和转录激活结构域(activationdomain,AD,它们是转录激活因子发挥功效所必需。
单独DB即使能和开启子结合,不过不能激活转录。
而不一样转录激活因子DB和AD形成杂合蛋白仍然含有正常激活转录功效。
依据转录因子这一特征,将BD和已知诱饵蛋白质X融合,构建出BD-X质粒载体;将AD基因和cDNA文库,基因片段或基因突变体(以Y表融合,构建AD-Y质粒载体。
两个穿梭质粒载体共转化至酵母体内表示。
蛋白质X和Y相互作用造成了BD和AD在空间上靠近,从而激活UAS下游开启子调整酵母菌株特定汇报基因(如LacZ,HIS3,LEU2等表示(图6-1-2,使转化体因为HIS3或LEU2表示,而可在特定缺点培养基上生长,同时因LacZ表示而在X-α-Gal存在下显蓝色。
酵母双杂交原理示意图
3.试验仪器
微量取液器(2μL;20μL;200μL;1,000μL、低温离心机、台式离心机、琼脂糖凝胶电泳系统、蛋白凝胶电泳系统、凝胶成像系统、半干转移系统、恒温摇床、恒温孵箱、通风橱、制冰机、振荡器、恒温金属浴、无菌接种环、10cm培养皿、15cm培养皿。
4.试验试剂
(1裂解缓冲液(Crackingbuffer:
尿素8mol/L
SDS5%
Tris-HCl(pH6.840mmol/L
EDTA0.1mmol/L
溴酚蓝0.4mg/ml
(2多种基础培养基和营养缺点培养基:
minimalSDbase,minimalSDagarbase,YPDmedium,YPDagarmedium,-LeuDOsupplement,-TrpDOsupplement,-Leu/-TrpDOsupplement,-Leu/-Trp/-HisDOsupplement,-Leu/-Trp/-His/-AdeDOsupplement,腺苷酸(adenine,PEG8000,CarringDNA,二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO,TE/LiACbuffur,PEG/LiAC,X-α-gal或X-β-gal。
(3酵母质粒提取试剂盒,LB培养基,羧苄青霉素和卡那霉素。
(4蛋白标准。
(5Z-buffer(pH7.0:
Na2HPO4⋅7H2O16.1g/L
NaH2PO4⋅H2O5.5g/L
KCI0.75g/L
MgSO4⋅7H2O0.246g/L
(6Z-buffer/X-β-Gal液体:
Z-buffer100ml
β-巯基乙醇0.27ml
X-β-Gal储存液1.67ml
5.试验方法
酵母复苏和表型验证:
(1复苏前1~2天,配制YPDA琼脂并于高压消毒后倒板。
(2用无菌接菌环在酵母冻存管中挑取一小团酵母细胞,接种到YPDA琼脂板上。
(330℃倒置孵育3~5天。
(4待酵母长到直径2~3mm后,将其接种到不一样营养缺点型培养基上进行表型验证。
质粒转化酵母细胞(常规转化:
(1挑取一直径约2~3mm酵母克隆接种到0.5mlYPDA培养基中。
(2猛烈震荡使细胞凝块均匀分散。
(3将细胞转移到含有新鲜YPDA培养基锥形瓶中。
(430℃,250rpm,振荡孵育16~18hr,直到稳定时(OD600>1.5。
(5将过夜培养物转移到含有新鲜YPDA培养基椎形瓶中,深入扩增酵母细胞。
(630℃,230~270rpm,振荡孵育使OD600达成0.5±0.1(通常需要3hr
(7将细胞转移到数个50mL离心管中,转速1000g,室温离心5min。
(8弃去上清,加入25~50mL消毒H2O,振荡重悬、清洗并搜集细胞。
(9转速1000g,室温离心5min,弃上清
(10加入1mL新鲜配置无菌1ХTE/LiAC重悬细胞。
(11准备1.5mL无菌EP管,在每个管中加入需要转染质粒和担体(carrierDNA。
(12加入经1ХTE/LiAC重悬感受态细胞,轻柔混匀。
(13每个管中加入适量体积1⨯PEG/LiAC,高速震荡混匀。
(1430℃,200rpm,振荡孵育0.5hr。
(15加入适量体积DMSO,温和颠倒混匀,不要振荡。
(1642℃水浴热休克15min,对于大量转化,应常常摇动以混匀。
(17置于冰上5~10min,室温12,000⨯g离心细胞5sec。
(18移去上清,依据铺板数加入适量体积1⨯TE重悬细胞。
(19铺板,倒置平板于30℃孵育直到克隆出现。
检测目标蛋白在酵母细胞中表示:
(1挑取一直径约2mm、含有目标蛋白基因片段BD/X新鲜酵母克隆于5mL对应营养缺点液体
培养基中,30℃、230rpm振荡孵育16hr。
(2将过夜培养物在50mLYPDA培养基中扩大培养,30℃,220~250rpm,使OD600值达成0.4~0.6。
(31,000⨯g离心5min,弃上清。
(4加入30mLH2O,重悬细胞。
1,000⨯g,离心5min,弃上清,加入液氮速冻沉淀。
(5待液氮挥发完全以后,根据100μL/7.5OD600百分比加入crackingbuffer重悬细胞并移入到一个
小量转化大量转化质粒DNA
0.1μg20~200μgcarrier
DNA0.1mg2mg质粒
*7每管中加入感受态细胞体积依据酵母细胞数量以及铺板大小而定,通常小量转化每管加入100μL感受态细胞;大量转化每管加入1mL感受态细胞。
假如长出
来以后克隆太密则可适量减少每管中加入感受态细胞体积;反之则可合适增加感受态细胞体积。
转化酵母菌结果
1.5mLEP管。
(6按80μL/7.5OD600百分比向EP管中加入酸性玻璃微珠(glassbeads。
70℃加热10min。
猛烈
震荡1min。
(712,000⨯g,4℃离心5min。
将上清转移到一个新1.5mLEP管中,置于冰上。
(8100℃水浴中3~5min,猛烈震荡1min。
(912,000⨯g,4℃离心5min。
将两次上清合到一个EP管中。
(10取20μL上清,加入上样缓冲液,100℃变性5min。
(11SDS-PAGE电泳后,采取Westernblot技术检测目标蛋白在酵母细胞中表示情况。
小规模酵母杂合(mating:
(1在无菌1.5mLEP管,加入0.5mL2⨯YPDA培养基。
(2挑取直径约2~3mm、新鲜含有表示质粒pGBKT7-XAH109酵母克隆和含有表示质粒
pGADT7-YY187酵母克隆于上述EP管中。
(3猛烈震荡1min,使酵母细胞完全悬浮。
(430℃,200rpm振摇孵育20~24hr。
(5将杂交混合液按1:
100稀释到0.5⨯YPDA培养基中,取100mL铺到SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal板上。
(6倒置平板于30℃孵育直到克隆出现。
滤纸转移法检测β-半乳糖苷酶分泌:
(1待酵母长到直径1.5~3mm大小时,取无菌、大小适宜Whatman滤纸贴在酵母板上。
(2待滤纸被琼脂板上水分基础浸湿后,揭下滤纸,这时酵母克隆被转移到了滤纸上。
(3将附着有酵母克隆滤纸在液氮中速冻10sec以上。
(4将新配制Z-buffer/X-β-Gal液体滴在另一无菌Whatman滤纸上,并完全浸湿滤纸。
酵母杂交操作步骤步骤图
Y187MatingSD/-His/-Leu/X-α-Gal
-GalSD/-Ade/-Leu/-Trp/X-α-GalAH109
(5)将附着有酵母克隆滤纸小心地贴放在浸有Z-buffer/X-b-Gal滤纸上。
(6)室温孵育8~16hr等候蓝斑出现。
滤纸转移法检测b-半乳糖苷酶表示量诱饵蛋白文库筛选:
Y187BD-baitAH109AD-libraryPickoutpositivecloneMatingExtractingplasmidsTDO/x-a-GalDDO/X-a-GalQDO/X-a-GalThransformDH5αLB/Kan+ExtractingplasmidsRetransformintoAH109SD/-LeuMatingwithBD/VectorMatingwithBD/baitMatingwithBD/lamDDOplateDDOplateDDOplateQDO/X-a-GalplateQDO/X-a-GalplateQDO/X-a-Galplate酵母双杂交文库筛选操作步骤图
(1)挑取一新鲜、直径为2~3mmBD-bait酵母AH109于50mlSD/-Trp液体培养基,℃,30250~270
rpm,16~18hr,培养至OD600值>0.8。
(2)1,000´g离心5min,弃上清。
用剩下5mL左右残液重悬细胞。
(3)室温水浴融化冻存文库(约1mL),轻柔震荡,留取10mL文库用于文库滴度测定(文库滴度测定方法见后)。
(4)快速将步骤2和步骤3两种液体混合到2L烧瓶中并加入45mL2ХYPD/KanKan50mg/mL)(轻柔震荡;用1mL2´YPD/Kan冲洗装文库离心管两次,并将冲洗液加入到烧瓶中。
(5)30℃过夜孵育(20~24hr)并轻柔震荡(30~50rpm)。
(6)将杂交混合液转移到一无菌离心瓶中,1,000´g离心10min,弃上清。
再用50mL2×YPD/Kan冲洗杂交瓶两次,将两次冲洗液混合在一起重悬细胞。
(7)1,000´g离心10min,弃上清。
用10mL0.5´YPD/Kan重悬细胞,并估算重悬后总体积,铺板。
(8)倒置平板于30℃孵育8~21天直到克隆出现。
(9)挑取阳性克隆于300mLYPDA和150mL消毒甘油混合液中,冻存于-80℃。
阳性克隆验证:
(1)用接种环挑取单个阳性克隆接种到新SD/-Trp/-Leu/-His/X-Gal平板上,30℃倒置平板孵育。
(2)待阳性克隆长出后,再用接种环挑取单个阳性克隆,接种到新SD/-Trp/-Leu/-His/X-Gal平板或SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-Gal平板上,倒置平板于30℃孵育。
(3)挑取单个阳性克隆于5mLYPDA/Kan培养基中30℃,250~270rpm振摇12~16hr。
(4)使用酵母质粒微量抽提试剂盒提取质粒。
(5)将提取到质粒混合物(BD/bait、AD/cDNA)采取经典转化法转化DH5a大肠杆菌,铺LB抗生素平板。
LB平板中抗生素和AD/cDNA载体所带抗性一致,这么最终得到克隆只含有AD/cDNA。
(6)挑取单个阳性克隆于5mLLB培养基(含对应抗生素)中37℃,250~270rpm振摇12~16hr。
(7)提取质粒,做PCR判定。
(8)将pGADT7-cDNA表示质粒转入AH109酵母株中将pGBKT7-bait表示质粒转入Y187酵母中,待克隆长出对带有AD-文库蛋白AH109酵母克隆进行自激活验证,另外再将带有AD-文库蛋白AH109酵母克隆和带有BD-bait蛋白Y187酵母克隆进行杂交,验证阳性克隆真实性。
—2000bp—500bp—2000bp—500bp—2000bp—2000bp—500bp—500bp文库cDNA片段PCR判定
文库滴度测定:
(1)将预留10mL文库和10mLLB混合均匀。
(2)取1mL混合液到1mLLB培养基中,混合均匀,制成稀释溶液A(1:
103)。
(3)再从溶液A中取1mL到1mLLB培养基中,混合均匀,制成稀释溶液B(1:
106)。
(4)从溶液A中取1mL到50mLLB培养基中,混合均匀,铺板。
(5)从溶液B中分别取50mL和100mL铺板。
(6)将板倒置30~31℃,孵育36~48hr。
(7)克隆计数并计算文库滴度(cfu/mL),计算文库滴度方法以下:
A:
克隆数´103´103´2=cfu/mLB:
(克隆数/铺板体积)´103´103´103´2=cfu/mL6.注意事项
(1)酵母双杂交对照设定常规酵母双杂交操作时通常会设定阳性对照、阴性对照和显色系统对照三种对照,以MATCHMAKERGAL4酵母双杂交筛选系统为例:
阳性对照:
pGADT7-T+pGBKT7-53,其中T蛋白和53蛋白是已经明确在酵母细胞内能够发生结合并开启汇报基因表示两种蛋白。
阴性对照:
pGADT7-T+pGBKT7-lam,其中已经明确T蛋白和lam蛋白在酵母细胞内不能发生结合。
系统显色对照,pGADT7-Pcl1,该表示质粒转入酵母细胞就能引发b-半乳糖苷酶和a-半乳糖苷酶分泌,从而检测显色系统是否有问题。
(2)假阳性现象多个原因可能造成假阳性结果,常见有以下三种:
筛到文库蛋白本身含有转录活性,能够开启汇报基因表示——这种情况需要对筛到候选蛋白进行自激活验证。
酵母细胞内可能同时含有不止一个文库蛋白,其中一个文库蛋白能够和诱饵蛋白相互及结合。
这种情况需要对阳性克隆再次划板2~3次,以确保每一个酵母克隆中只含有一个文库蛋白和诱饵蛋白;另外划板次数也不宜过多,不然会出现蛋白表示质粒丢失情况。
其它部分不明原因造成假阳性—这种情况需要将筛到候选文库质粒和表示诱饵蛋白质粒重新共转入酵母细胞或经过酵母杂交方法重新验证,如有必需能够将pGADT7-cDNA质粒和pGBKT7-bait质粒载体对调构建成pGADT7-bait和pGBKT7-cDNA并重新在酵母细胞中验证,真正阳性结合在对调以后也能在酵母细胞中做出阳性结果。
(3)常见问题及参考方案转化效率过低—尽可能使用新鲜培养基和新鲜、且直径大小在2~3mm左右酵母克隆,以
确保酵母活力;可将用于转化质粒在使用前进行乙醇沉淀,以提升质粒纯度和浓度。
杂交效率偏低—可能因为表示融合蛋白对酵母细胞有毒性,在一些情况下在液体培养基中生长不好酵母换到琼脂糖固体培养板上时,会生长得比很好,这种情况能够采取共转化方法进行试验;或将单转酵母克隆分别铺到5块10mm培养板上,待克隆长出来以后,刮取全部克隆于5mL0.5×YPDA中。
重悬后再根据常规杂交操作步骤进行操作。
背景过高—当使用HIS3作为汇报基因时,因为HIS3基因含有一定程度泄漏表示,可能会出现背景过高情况,这时能够使用适量HIS3蛋白竞争性抑制剂3-AT(3-amino-1,2,4-triazole)以降低背景;或再增加一个愈加严格汇报基因筛选如Ade。
诱饵蛋白含有自激活现象——能够采取克隆突变方法将产生自激活一段氨基酸序列敲除或突变,但这种方法可能会破坏两蛋白之间相互作用。
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