质谱法(Mass-Spectrometry--MS).ppt
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第3章质谱法(MassSpectrometry,MS),原子质量单位:
Amu,u,Da氢原子:
1u=1.6605410-23g12C=12u,在非精确测量中,常直接以原子或分子量大小来表示。
Amu,u,Da,地球的质量为5.976l027克,这是根据万有引力定律测定的。
地球质量的确定提供了测定其他天体质量的依据。
从地球的质量可得出地球的平均密度为552克/厘米3。
3.1概述3.2质谱分析原理及质谱仪3.3质谱图上离子的主要类型3.4各类有机化合物的断裂规律及质谱图3.5质谱法的应用,3.1概述,1方法概述,以某种方式使有机化合物的分子电离、碎裂,然后按照离子的质荷比(m/z)大小把生成的各种离子分离,检测它们的强度,并将其排列成谱,这种研究物质的方法称作质谱法。
2质谱仪的发展史1912年:
世界第一台质谱装置40年代:
质谱仪用于同位素测定50年代:
分析石油60年代:
研究GC-MS联用技术70年代:
计算机引入,90年代:
由于生物分析的需要,一些新的离子化方法得到快速发展,如快原子轰击离子源,基质辅助激光解吸电离源,电喷雾电离源,大气压化学电离源等。
目前:
出现了比较成熟的液相色谱-质谱联用仪,感应耦合等离子体质谱仪,富立叶变换质谱仪等。
质谱分析法已广泛地应用于化学、化工、材料、环境、地质、能源、药物、刑侦、生命科学、运动医学等各个领域。
样品元素组成;物质的相对分子质量;物质的结构信息-结构不同,分子的碎片不同(质荷比不同);复杂混合物的定性定量分析-与色谱方法联用(GC-MS);样品中原子的同位素比。
3、质谱图上提供的信息,3.2质谱分析原理及质谱仪,3.2.1质谱仪的基本结构,质谱仪是通过对样品电离后产生的具有不同的m/z的离子来进行分离分析的。
为了获得离子的良好分离和分析效果,避免离子损失,凡有样品分子及离子存在和通过的地方,必须处于真空状态。
质谱仪包括进样系统、电离系统、质量分析系统和检测系统。
Agilent7500系列ICP-MS,等离子体又叫做电浆,是由部分电子被剥夺后的原子及原子被电离后产生的正负电子组成的离子化气体状物质,它广泛存在于宇宙中,常被视为是除去固、液、气外,物质存在的第四态。
等离子体是一种很好的导电体,利用经过巧妙设计的磁场可以捕捉、移动和加速等离子体。
质谱法分类:
3.2.2质谱仪各部分的工作原理,1、真空系统质谱仪的离子产生及经过系统必须处于高真空状态(离子源真空度应达1.310-41.310-5Pa,质量分析器中应达1.310-6Pa)。
其作用是减少离子碰撞损失。
真空度过低,将会引起:
a)大量氧会烧坏离子源灯丝;b)引起其它分子离子反应,使质谱图复杂化;c)用作加速离子的几千伏高压会引起放电。
分子真空泵它是利用高速旋转的转子把动量传输给气体分子,使之获得定向速度,从而被压缩、被驱向排气口后为前级抽走的一种真空泵。
这种泵具体可分为:
1)牵引分子泵气体分子与高速运动的转子相碰获得动量,被驱送到泵的出口。
2)涡轮分子泵靠高速旋转的动叶片和静止的定叶片相互配合来实现抽气的。
这种泵通常在分子流状态下工作。
3)复合分子泵它是由涡轮式和牵引式两种分子泵串联组合起来的一种复合型的分子真空泵。
扩散泵的原理:
在前级真空泵所造成的低真空条件下,加热泵内硅油,使受热沸腾蒸发,生成蒸气,以极高速度通过该泵的各级喷口的缝隙喷出,使容器内部的气体分子扩散到蒸汽中被带到前级真空泵所能作用的位置,由前级真空泵迅速抽出,使系统达到高真空的要求。
一般质谱仪都采用机械泵预抽空后,再用高效率扩散泵连续地运行以保持真空。
现代质谱仪采用分子泵可获得更高的真空度。
要求:
大气压下的样品要进入高真空的质谱仪,而不影响仪器的真空度。
2、进样系统进样系统的作用是高效重复地将样品引入到离子源中。
进样装置有:
间歇式进样、直接探针进样色谱进样系统(GC-MS、HPLC-MS)高频感藕等离子体进样系统(ICP-MS),如图所示。
注入样品(10-100g)贮样器(1L-3L)抽真空并加热样品蒸汽分子(压力陡度)漏隙高真空离子源。
1)间歇式进样:
适于气体、沸点低且易挥发的液体、中等蒸汽压固体。
(可控漏孔),2)直接探针进样:
高沸点液体及固体探针杆通常是一根规格为25cm6mm,末端有一装样品的黄金杯(坩埚),将探针杆通过真空闭锁系统引入样如图所示。
300-4000c,3)色谱进样:
利用气相和液相色谱的分离能力,与质谱仪联用,进行多组份复杂混合物分析。
优点:
引入样品量小,样品蒸汽压可以很低;,3、电离源电离源的功能是将进样系统引入的气态样品分子转化成离子。
由于离子化所需要的能量随分子不同差异很大,因此,对于不同的分子应选择不同的离解方法。
通常称能给样品较大能量的电离方法为硬电离方法,而给样品较小能量的电离方法为软电离方法,后一种方法适用于易破裂或易电离的样品。
准分子离子,离子源(ionsource),电子电离源(electronionizationEI)化学电离源(chemicalionizationCI)快原子轰击(fastatombombardmentFAB)电喷雾源(electronsprayionizationESI)大气压化学电离(atmosphericpressurechemicalionizationAPCI)基质辅助激光解吸电离(matrixassistedlaserDesorptionionizationMALDI),1)电子电离源电子电离法是通用的电离法,是使用高能电子束从试样分子中撞出一个电子而产生正离子,即,式中M为待测分子,M+。
为分子离子或母体离子。
奇电子离子,偶电子离子,灯丝:
2000,可在平行电子束的方向附加一弱磁场,使电子沿螺旋轨道前进,增加碰撞机会,提高灵敏度。
电加热锑或钨的灯丝产生高速电子束,其能量为107OeV。
当气态试样由分子漏入孔进入电离室时,高速电子与分子发生碰撞,若电子的能量大于试样分子的电离电位,将导致试样分子的电离:
在电子轰击电离中,样品分子M受到一定能量的(如70eV)的电子轰击后,生成分子离子M+。
有机化合物的电离能在10eV左右,所以M+具有很高的过剩能量,还可能进一步碎裂,产生碎片离子F+等。
这些离子在离子源中被加速电压(Vacc)加速后具有一定的动能:
M+eM+2eM+F+NA+B+N.,是1980年以前的主要离子化方式,只能用于远远小于生物有机分子的小分子(400Da以下)的检测。
样品需经过汽化(通常热解吸附)进入电离区,与电子流撞击.电子流传递部分能量(多小于6ev)形成离子及部分碎片.,正癸烷,EI的优缺点,优点1.高的灵敏度2.有达10万个化合物的数据库可快速检索3.可根据碎片方式鉴定未知物4.从碎片离子判定结构,缺点1.质量范围小2.有可能汽化前发生解离3.碎片过多有时看不到分子离子,
(2)化学电离源在质谱中可以获得样品的重要信息之一是其相对分子质量。
但某些物质的分子经电子轰击产生的M+峰往往不存在或其强度很低。
必须采用比较温和的电离方法,其中之一就是化学电离法。
化学电离法是通过离子-分子反应来进行,而不是用强电子束进行电离。
离子与试样分子按一定方式进行反应,转移一个质子给试样或由试样移去一电子,试样则变成带+1电荷的离子。
化学电离源一般在1.31021.3103Pa(现已发展为大气压下化学电离技术)压强下工作,使用时,往离子源中送入反应气和气化的样品,如甲烷,CH4+和CH3+很快与大量存在的CH4分子起反应,即:
CH4+CH4CH5+CH3CH3+CH4C2H5+H2,首先用高能电子,使CH4电离CH4+eCH4+2eCH4+CH3+H,CH5+和C2H5+不与中性甲烷进一步反应,一旦小量样品(试样与甲烷之比为110000)导入离子源,试样分子(M)发生下列反应:
CH5+MMH+CH4C2H5+MM+C2H6MH+和M+然后可能碎裂,产生质谱。
(M+H),(M-H)或(M-C2H5)+离子很容易测得其相对分子质量。
准分子离子,氢负离子转移反应,m/z=M-1,质子转移反应,50,100,150,200,250,300,350,0,100,%,0,100,%,0,100,%,284,282,142,107,71,249,214,177,253,288,284,282,142,107,71,249,214,179,253,288,284,282,249,142,107,71,214,177,253,288,2pg六氯苯,60ng六氯苯,200pg六氯苯,EI谱图,在TRACEMSEI/70获得的结果,CI谱图,50,100,150,200,250,300,350,m/z,0,100,%,0,100,%,0,100,%,200,183,201,217,ScanCI+,183,105,184,211,223,ScanCI+,105,77,51,76,78,182,106,181,152,183,ScanEI+,苯甲酮,EI,苯甲酮,甲烷CI+,苯甲酮,氨CI+,EI和PCI的比较使用甲烷和氨气,特点:
得到一系列准分子离子(M+1)+,(M-1)+,(M+29)+等等;CI源的的碎片离子峰少,图谱简单,易于解释;不适于难挥发成分的分析。
3)电喷雾电离(ESI),结构:
喷嘴,雾化气,干燥气原理:
喷雾蒸发高电压,电喷雾通常要选择合适的溶剂。
除了考虑对样品的溶解能力外,溶剂的极性也须考虑。
一般来说,极性溶剂(如甲醇、乙腈、丙酮等)更适合于电喷雾。
对于水溶液,由于液体表面张力较大,ESI要求的阈电位也较高。
为了避免高压放电,可向喷雾区引入有效的电子清除剂或使离子源加热以降低表面张力。
通常小分子得到M+H+,M+Na+或M-H-单电荷离子,生物大分子产生多电荷离子,由于质谱仪测定质/荷比,因此质量范围只有几千质量数的质谱仪可测定质量数十几万的生物大分子。
电喷雾电离是最软的电离技术,通常只产生分子离子峰,因此可直接测定混合物,并可测定热不稳定的极性化合物;其易形成多电荷离子的特性可分析蛋白质和DNA等生物大分子;通过调节离子源电压控制离子的碎裂(源内CID)测定化合物结构。
ESI优缺点,优点1、质量数可达70,000Da2、灵敏度高达femtomole级。
3、软电离,可观察生物分子非共价反应。
4、易于和LC串联,直接分析流速为1ml/min的LC洗脱液。
5、没有基质干扰。
6、适于联四极杆质量分析器、离子阱质量分析器做结构分析。
7、带多电荷,允许质量范围窄的设备检测高质量数的离子。
8、带多电荷,通过计算平均值给出更精确的质量数。
9、特别适于测多肽的修饰。
10、样品前处理简单可直接分析RP-HPLC脱盐处理的溶液。
缺点1、耐盐能力低。
2、对某些化合物特别敏感,污染难清洗。
3、带多电荷,在分析混合物时,产生混乱。
4、定量时需内校准。
(4)大气压化学电离(atmosphericpressurechemicalionization,APCI):
是由ESI源派生出来的,常压下电晕放电。
喷出的液滴先汽化,随后空气中某些中性分子(H2O,N2,O2等)及溶剂分子被电离,发生化学电离的过程。
适用于弱极性的小分子化合物(M1000)。
大气压化学电离(APCI)特点,大气压化学电离也是软电离技术,只产生单电荷峰,适合测定质量数小于2000Da的弱极性的小分子化合物;适应高流量的梯度洗脱/高低水溶液变化的流动相;通过调节离子源电压控制离子的碎裂。
大气压电离技术中产生的离子为偶电子离子,其主要的碎片应由化学键的诱导断裂和重排反应来产生。
所以在EI质谱解析中总结出的偶电子离子的开裂规则一般可适用于CID质谱的解释。
电喷雾与大气压化学电离的比较,电离机理:
电喷雾采用离子蒸发,而APCI电离是高压放电发生了质子转移而生成MH+或M-H-离子。
样品流速(LG-MS):
APCI源可从0.2到2mlmin;而电喷雾源允许流量相对较小,一般为0.2-1mlmin.,断裂程度;APCI源的探头处于高温,对热不稳定的化合物就足以使其分解.灵敏度:
通常认为电喷雾有利于分析极性大的小分子和生物大分子及其它分子量大的化合物,而APCI更适合于分析极性较小的化合物。
多电荷:
APCI源不能生成一系列多电荷离子,正负离子模式:
一般的商品仪器中,ESI和APCI接口都有正负离子测定模式可供选择。
根据样品的性质选择,也可两种模式同时进行,分子量,非极性,极性,EI/CI,ESI,APCI,100,000,1000,哪种离子化方式?
EI(ElectronImpactIonization):
电子轰击电离硬电离。
CI(ChemicalIonization):
化学电离核心是质子转移。
FD(FieldDesorption):
场解吸目前基本被FAB取代。
FAB(FastAtomBombardment):
快原子轰击或者铯离子(LSIMS,液体二次离子质谱)。
ESI(ElectrosprayIonization):
电喷雾电离属最软的电离方式。
适宜极性分子的分析,能分析小分子及大分子(如蛋白质分子多肽等)APCI(AtmosphericPressureChemicalIonization):
大气压化学电离同上,更适宜做弱极性小分子。
APPI(AtmosphericPressurePhotoSprayIonization):
大气压光喷雾电离同上,更适宜做非极性分子。
MALDI(MatrixAssistedLaserDesorption):
基体辅助激光解吸电离。
通常用于飞行时间质谱和FT-MS,特别适合蛋白质,多肽等大分子,4、质量分析器(massanalyzer)单聚焦分析器(singlefocusingmassanalyzer)双聚焦分析器(doublefocusingmassanalyzer)四极杆分析器(quadrupoleanalyzer)离子阱分析器(Iontrap)飞行时间分析器(timeofflight)富立叶变换离子回旋共振(Fouriertranformioncyclotronresonance),
(1)单聚焦分析器(singlefocusingmassanalyzer),1)结构:
扇形磁场(可以是1800900600等),电场加速后zU=(1/2)m2(z-电荷;V-电压;m-质量;-速度),磁场中Bz=m2/r(B-磁场强度;r-半径)推出m/z=B2r2/2U,离子的m/Z大,偏转半径也大,通过磁场可以把不同离子分开;当r为仪器设置不变时,改变加速电压或磁场强度,则不同m/z的离子依次通过狭缝到达检测器,形成质谱。
(2)双聚焦分析器(Doublefocusingmassanalyzer),为什么要双聚焦:
进入离子源的离子初始能量不为零,且能量各不相同,加速后的离子能量也不相同,运动半径差异,难以完全聚集。
对于动能不同的离子,通过调节电场能,达到聚焦的目的。
双聚焦分析器的特点:
分辨率高,解决办法:
加一静电场E,实现能量分散:
单聚焦(single-focusing)和双聚焦(double-focusing)质量分析器单聚焦质量分析器使用扇型磁场,结构简单,操作方便,但是分辨率低。
双聚焦质量分析器使用扇型电场及扇型磁场,分辨率高,其缺点是价格贵,操作和调整比较困难。
(3)四极杆分析器(quadrupoleanalyzer),四极质量分析器(QuadrupoleMassAnalyzer),由四跟平行的棒状电极组成而得名。
与扇型磁场的质量分析器的原理完全不同。
在一定DC/VC作用下,具有一定m/z的离子能到达收集器,其他离子被滤掉。
结构:
四根棒状电极,形成四极场A,B棒:
(Vdc+Vrf)C,D棒:
-(Vdc+Vrf)原理:
在一定的VdcVrf下,VdcVrf(射频调制,108Hz),只有一定质量的离子可通过四极场,到达检测器。
在一定的(Vdc/Vrf)下,改变Vrf可实现扫描。
由一组平行放置的四根金属棒构成,用陶瓷绝缘,交错地联结成两对;加以方向相反的直流(DC)和射频(RF)电压;加速粒子进入分析器,并按m/z和RF/DC值开始以一种复杂的形式振荡,稳定振荡的离子通过打拿极射到倍增器上被放大记录,不稳定振荡的离子打到四极杆上被中和,从而达到质量分离目的.,当质荷比为m/z的离子沿z轴射入四极场时,其运动方程为:
这是典型的Mathieu方程,a、q值在稳定区内的离子产生稳定振荡,顺利通过四极场到达检测器;a、q值在非稳定区的离子产生不稳定振荡而被电极中和。
当一组质荷比不同的离子进入由DC和RF组成的电场时,只有满足特定条件的离子作稳定振动通过四极杆,到达检测器。
其他离子均作不稳定振动而与四极杆相撞,不能通过四极杆。
对于一台四极质谱仪,其场半径r为固定值,也选为定值。
若以a/q=U/V=常数对V进行扫描,可使一组不同质量的离子先后进入稳定区而被检测。
显然,a/q比值越大(扫描成的斜率越大),扫描线上稳定区内的质量范围越窄,仪器的分辨率越高。
四极分析器可以自身串联,构成串联质谱仪,如Q1,q,Q2其中,q是一个只有射频电压的碰撞室,Q1和Q2是两个分析器。
它还可以与其它质量分析器串联,构成杂化型串联质谱仪,以综合利用各种分析器的特点。
ESIQuadrupoleMS的典型结果,FromEckerskornin“Bioanalytik”,LottspeichandZorbas(Eds),优点:
1)结构简单、容易操作、价格便宜;2)仅用电场而不用磁场,无磁滞现象,扫描速度快,适合与色谱联机;3)操作时的真空度相对较低,特别适合与液相色谱联机。
缺点:
1)分辨率不高(R=103-104);2)对较高质量的离子有质量歧视效应。
(4)离子阱质量分析器,三维的四极杆,RF加在环形电极上。
环形电极,离子阱质谱仪的分析器是由一对环形电极(ringelectrode)和两个呈双曲面形的端电极(endcapelectrode)组成。
在环形电极上加射频电压或再加直流电压,上、下端盖电极接地,如图示。
离子阱中心至上下端电极距离为Z,至环电极内侧为r。
离子被引入阱中后,经RF射频电压扫描,不同质/荷比的离子相继排出得到检测。
由于离子在阱内可存储较长的时间,增加了离子相互碰撞的机会,适用于气相离子反应研究。
突出优点在于高灵敏度(低至1018克分子)、快速扫描(5000道尔顿/秒)以及可在一个离子阱检测器内实现程序扫描多级串联质谱功能。
离子阱中离子的运动,可以由Mathieu方程给出:
式中各物理量的含义分别由下式给出:
Mathieu参数a和q很重要,它们决定了离子运动是否稳定。
可以用az和qz为坐标的稳定性图来表示:
图中,有若干相互交叉的曲线,称为等线。
从左到右的曲线是从01的等z线;从上到下的曲线则是从01的等r线。
处于稳定区的离子,即是r,z=01的区域。
处于此区域的离子,在r方向或z方向的运动振幅均不大,能长期贮存于离子肼中;稳定区周域以外是不稳定区,处在不稳定区的离子,由于在r方向或z方向的运动振幅过大,会与环电极或端电极碰撞而导致消亡。
上图中的m1、m2和m3分别表示三种离子在质量选择喷射时的(az,qz)坐标:
m1表示已经喷射出去并被检测的离子;m2表示正好处在喷射口的离子;m3表示仍然留在肼中的离子。
当U=0,即此时不加直流电压。
由qz的表达公式及上图可知,固定的射频,当逐渐增加V时,qz会随之增加。
一旦到达qz=0.908(即图中m2所在位置所对应的qz值)时,离子进入不稳定区,由端盖电极上的小孔排出。
因此,当V逐渐增高时,质荷比从小到大的离子逐次排出并被记录而获得质谱图。
这就是离子肼进行质量扫描的原理。
除此之外,离子阱还可以贮存离子。
当不加直流电压时,qz0.908的离子均贮于离子阱内。
可根据需要选择感兴趣的某一质荷比的离子贮存于离子阱内,进行时间上的MSn操作。
四极离子肼可直接在肼中使样品电离,也可使用外部离子源。
前者是在一个端电极上置一微孔,灯丝发射的电子由此进入阱中使样品分子电离;后者将在离子源中产生的离子注入肼中进行分析。
采用外部离子源可使四极离子阱在分析上得到更广泛的应用。
例如,采用ESI电离源,离子阱可与HPLC联用,用于生物大分子的结构研究。
离子阱(iontrap)优点:
1)单一的离子阱可实现多极“时间上”的串联质谱;2)结构简单、价格便宜,性能价格比高;3)灵敏度高,较四极质量分析器高达10-10000倍;4)质量范围大,可达6000。
缺点:
质谱与标准谱有差别。
(5)飞行时间质量分析器Time-of-FlightAnalyzer,在离子源中产生的离子经电压Vacc加速后获得的速度为:
经过长度为L的漂移管到达检测器,离子的飞行需要的时间:
可以看出,质荷比大的离子飞行速度越小,到达检测器的时间也越长,质荷比小的离子先到达检测器。
在通常情况下,离子的飞行时间为微秒数量级。
所有离子同时启动小的离子移动速度快测量已知距离下的速度(飞行时间),优点:
1)检测离子的质荷比范围非常宽;2)特别适合于与脉冲产生离子的电离源(MALDI-TOF);3)灵敏度高,适合于作串联质谱的第二级;4)扫描速度快,适合研究极快过程;缺点:
分辨率随质荷比的增加而降低。
飞行时间质谱计(timeofflight,TOF),飞行时间质谱首先要考虑的问题是如何使离子在被注入漂移区后既无空间发散又无能量发散。
如果相同质量的离子在不同时间离开离子源或存在能量发散,分辨率将大为下降。
解决办法之一是采用离子反射技术,使不同动能的离子得到聚焦。
如图示,在经过漂移管后,离子进入减速反射区;动能较大的离子在该区中进入较深(存在运动惯性),反射过来所需的时间也较长,这使动能较小的离子可以赶上。
因此,经过反射,质量相同而动量不同的离子可以同时到达检测器。
反射飞行时间质量分析器(RETOF-MS),Uref,TOF对真空度的要求非常高10TorrMALDI源一般同时联接Time-of-FlightAnalyzer和RETOF,(6)傅立叶回旋共振质量分析器fourierTransform-IonCyclotronResonance,假设在激发电极上加一个高频电信号,其频率与某一个质荷比离子的回旋运动频率一致,则这个离子将吸收高频电信号的能量,因而这个离子的运动速度加快,回旋运动的半径逐渐加大(图1-12)。
停止高频电信号后,该离子将以较大的固定半径作回旋运动,由于该离子离检测电极较近,因而检测电极被感应而产生高频电信号(下页图)。
这个信号被检测,其频率和该离子的回旋运动频率相一致,由公式
(1)就可计算出该离子的质量。
但必须指出,由于FTICR-MS是用特定波形的高频电场,把共振池中某段质量范围的离子同时激发到回旋运动轨道上,并以各自的回旋频率作运动,因此,在检测电极上感应出不只一种频率电信号,而是多种频率电信号的叠加。
必须再用傅立叶变换技术,快速将时域谱变换成频域谱。
按公式
(1),可以由频率换算成质量数,从而获得各个离子的质量及其丰度,即常见的质谱图。
通过同时激发分析时内的所有质荷比的离子,通过对检测信号进行傅立叶变换得到质谱图。
质量精度最高,达0.001,几种质量分析器的比较,3.3质量分析器的串联,串联质谱是通过对选定m/z离子反应产物的分析,对目标化合物进行结构鉴定或断裂机理等方面的研究。
此法不须预先色谱分离,适合复杂混合物体系分析。
若要深入了解离子(包括分子离子和碎片离子)的性质及其反应机理,仅仅取得常规质谱数据是远远不够的,须结合串联质谱技术得到进一步的结构信息。
M+和F+离子的分解反应通常都有许多竞争的反应通道。
因此,常规质谱记录的是所有这
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- 质谱法 Mass Spectrometry MS
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