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BIORAD双向电泳培训资料
双向电泳实验流程
●样品制备(Samplepreparation)
●固相预制胶条的水化(IPGstriprehydration)
●第一向等电聚焦(IEF)
●胶条的平衡(IPGstripequilibration)
●第二向SDS-PAGE电泳(SDS-PAGEelectrophresis)
●凝胶的染色及检测(Detection/Staining)
●PDQuest软件分析(Softwareanalysis)
●质谱鉴定(Proteinidentification)
●我方主要工作人员通讯录
目 录
第一章 实验材料
1.1IPG预制胶条及载体两性电解质
1.2蛋白质定量试剂盒及其试剂
1.3试剂盒及其试剂
1.4化学试剂
1.5蛋白质Marker
1.6染色试剂
1.7注意事项
第二章 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳
2.1溶液的配制
2.2SDS-PAGE凝胶的配制
2.3操作方法
2.4注意事项
第三章 双向电泳
3.1溶液配制
3.2操作步骤
3.3注意事项
附录1双向电泳完整的操作步骤
附录2 聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的配置
附录3 细胞样品的一般处理步骤
附录4 组织样品的一般处理步骤
附录5 我方主要工作人员通讯录
第一章实验材料
1.1IPG预制胶条及载体两性电解质
(一)IPG预制胶条(美国Bio-Rad公司),-20℃冰箱保存
IPG预制胶条pH3-10,7cm163-2000
IPG预制胶条pH3-10,7cm,nonlinear(NL)163-2002
IPG预制胶条pH4-7,7cm163-2001
IPG预制胶条pH3-6,7cm163-2003
IPG预制胶条pH5-8,7cm163-2004
IPG预制胶条pH7-10,7cm163-2005
IPG预制胶条pH3-10,17cm163-2007
IPG预制胶条pH3-10,17cm,nonlinear(NL)163-2009
IPG预制胶条pH4-7,17cm163-2008
IPG预制胶条pH3-6,17cm163-2010
IPG预制胶条pH5-8,17cm163-2011
IPG预制胶条pH7-10,17cm163-2012
IPG预制胶条pH3-10,18cm163-2032
IPG预制胶条pH3-10,18cm,nonlinear(NL)163-2033
IPG预制胶条pH4-7,18cm163-2034
IPG预制胶条pH3-6,18cm163-2035
IPG预制胶条pH5-8,18cm163-2036
IPG预制胶条pH7-10,18cm163-2037
IPG预制胶条pH3-10,11cm163-2014
IPG预制胶条pH3-10,11cm,nonlinear(NL)163-2016
IPG预制胶条pH4-7,11cm163-2015
IPG预制胶条pH3-6,11cm163-2017
IPG预制胶条pH5-8,11cm163-2018
IPG预制胶条pH7-10,11cm163-2019
IPG预制胶条pH3.9-5.1,17cm163-2020
IPG预制胶条pH4.7-5.9,17cm163-2021
IPG预制胶条pH5.5-6.7,17cm163-2022
IPG预制胶条pH6.3-8.3,17cm163-2023
IPG预制胶条pH3.9-5.1,18cm163-2038
IPG预制胶条pH4.7-5.9,18cm163-2039
IPG预制胶条pH5.5-6.7,18cm163-2040
IPG预制胶条pH6.3-8.3,18cm163-2041
IPG预制胶条pH3.9-5.1,11cm163-2024
IPG预制胶条pH4.7-5.9,11cm163-2025
IPG预制胶条pH5.5-6.7,11cm163-2026
IPG预制胶条pH6.3-8.3,11cm163-2027
IPG预制胶条pH3.9-5.1,7cm163-2028
IPG预制胶条pH4.7-5.9,7cm163-2029
IPG预制胶条pH5.5-6.7,7cm163-2030
IPG预制胶条pH6.3-8.3,7cm163-2031
(二)载体两性电解质(美国Bio-Rad公司),4℃冰箱保存
Bio-Lyte3/10Ampholyte,40%,10ml163-1112
Bio-Lyte3/10Ampholyte,40%,25ml163-1113
Bio-Lyte3/5Ampholyte,20%,10ml163-1132
Bio-Lyte4/6Ampholyte,40%,10ml163-1142
Bio-Lyte4/6Ampholyte,40%,25ml163-1143
Bio-Lyte5/7Ampholyte,40%,10ml163-1152
Bio-Lyte5/7Ampholyte,40%,25ml163-1153
Bio-Lyte6/8Ampholyte,40%,10ml163-1162
Bio-Lyte6/8Ampholyte,40%,25ml163-1163
Bio-Lyte7/9Ampholyte,40%,10ml163-1172
Bio-Lyte8/10Ampholyte,20%,10ml163-1182
Bio-Lyte5/8Ampholyte,40%,10ml163-1192
Bio-Lyte5/8Ampholyte,40%,25ml163-1193
(三)等电聚焦上样缓冲液(美国Bio-Rad公司),4℃冰箱保存
100×ReadyStripBuffer,forpH7-10IPGStrips,1ml163-2093
Bio-Lyte3/10Ampholyte,100×,1ml163-2094
100×ReadyStripBuffer,forpH6.8-8.3IPGStrips,1ml163-2095
100×ReadyStripBuffer,forpH5.5-6.7IPGStrips,1ml163-2096
100×ReadyStripBuffer,forpH4.7-5.9IPGStrips,1ml163-2097
100×ReadyStripBuffer,forpH3.5-5.1IPGStrips,1ml163-2098
1.2蛋白质定量试剂盒及其试剂
ProteinAssayKit
,bovineγ-globulinstandard500-0001
ProteinAssayKit
,BSAstandard500-0002
ProteinStandard
,bovineγ-globulin,1bottle500-0005
ProteinAssayDyeReagentConcentrate,450ml500-0006
ProteinStandard
,bovineserumalbumin,1bottle500-0007
RCDCProteinAssayKit
,bovineγ-globulinstandard500-0121
RCDCProteinAssayKit
,BSAstandard500-0122
1.3试剂盒及其试剂
ReadyPrepSequentialExtractionKit163-2100
Tributylphosphine(TBP),200mM,0.6ml163-2101
ReadyPrepSequentialExtractionKitReagent1,1vial163-2102
ReadyPrepSequentialExtractionKitReagent2,1vial163-2103
ReadyPrepSequentialExtractionKitReagent3,1vial163-2104
ReadyPrep2-DStarterKit163-2105
ReadyPrep2-DStarterKitRehydration/SampleBuffer163-2106
ReadyPrepStarterKitEquilibrationBuffer
,withDTT163-2107
ReadyPrepStarterKitEquilibrationBuffer
163-2108
Iodoacetamide,30g163-2109
E.coliProteinSample,lyophilized,2.7mg163-2110
ReadyPrepOverlayAgarose,50ml163-2111
1.4化学试剂
尿素Urea,250g161-0730
尿素Urea,1kg161-0731
AG501-X8(D)MixedBedResin142-6425
CHAPS,1g161-0460
CHAPSO,1g161-0465
TritonX-100,500ml161-0407
DTT(Dithiothreitol),1g161-0610
DTT(Dithiothreitol),5g161-0611
Tributylphosphine(TBP),200mM,0.6ml163-2101
溴酚蓝(BromophenolBlue),10g161-0404
矿物油(MineralOil),500ml163-2129
SDS,25g161-0300
SDS,100g161-0301
SDS,1kg161-0302
Tris,100g161-0715
Tris,500g161-0716
Tris,1kg161-0719
Iodoacetamide,30g163-2109
低熔点琼脂糖,25g161-3111
甘氨酸,250g161-0717
甘氨酸,1kg161-0718
甘氨酸,2kg161-0724
丙烯酰胺(Acrylamide),99.9%,100g161-0100
丙烯酰胺(Acrylamide),99.9%,500g161-0101
丙烯酰胺(Acrylamide),99.9%,2kg161-0103
丙烯酰胺(Acrylamide),99.9%,1kg161-0107
丙烯酰胺(Acrylamide),99.9%,5kg161-0108
甲叉双丙烯酰胺(Bis),5g161-0200
甲叉双丙烯酰胺(Bis),50g161-0201
PDA(PiperazineDiacrylamide),10g161-0202
PDA(PiperazineDiacrylamide),50g161-0203
过硫酸氨(AmmoniumPersulfate),10g161-0700
过硫酸氨(AmmoniumPersulfate),100g161-0754
TEMED,5ml161-0800
TEMED,50ml161-0801
甘油国产或Sigma
硫尿Sigma
1.5蛋白质Marker
2-DSDS-PAGEStandards,500l161-0320
SDS-PAGEStandards,highrange,200l161-0303
SDS-PAGEStandards,lowrange,200l161-0304
SDS-PAGEStandards,broadrange,200l161-0317
PolypeptideSDS-PAGEStandards,200l161-0326
PrecisionProteinStandards,unstained,1500l,150applications161-0362
PrecisionProteinStandards,prestained,500l,50applications161-0372
KaleidoscopePolypeptideStandards,500l161-0325
KaleidoscopePrestainedStandards,broadrange,500l161-0324
PrestainedSDS-PAGEStandards,highrange,500l161-0309
PrestainedSDS-PAGEStandards,lowrange,500l161-0305
PrestainedSDS-PAGEStandards,broadrange,500l161-0318
IEFStandards,pIrange4.45-9.6,250l161-0310
1.6染色试剂
CoomassieBrilliantBlueR-250,10g161-0400
CoomassieBrilliantBlueG-250,10g161-0406
IEFGelStainingSolution,1L161-0434
CoomassieBrilliantBlueR-250StainingSolutionsKit161-0435
CoomassieBrilliantBlueR-250StainingSolutions,1L161-0436
CoomassieBrilliantBlueR-250StainingSolutions,4×1L161-0437
CoomassieBrilliantBlueR-250DestainingSolutions,1L161-0438
CoomassieBrilliantBlueR-250DestainingSolutions,4×1L161-0439
Bio-SafeCoomassieStain,1L161-0786
Bio-SafeCoomassieStain,5L161-0787
SYPRORubyProteinGelStain,200ml170-3126
SYPRORubyProteinGelStain,1L170-3125
SYPRORubyProteinGelStain,5L170-3138
SilverStainKit161-0443
SilverStainPlusKit161-0450
1.7注意事项
1.双向电泳中所用的化学试剂纯度要高,至少为分析级。
尽量选用进口试剂。
2.双向电泳中使用MilliQ水(电导小于1S)。
3.所有包含尿素的溶液加热温度不超过30℃,否则会发生蛋白氨甲酰化。
详细订货信息请参考BIO-RAD中英文目录
第二章SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳
2.1溶液的配制
30%聚丙烯酰胺贮液
丙烯酰胺150g
甲叉双丙烯酰胺4g
MilliQ水500ml
滤纸过滤后,棕色瓶4℃冰箱保存。
1.5mol/LTris碱pH8.8
Tris碱90.75g
MilliQ水400ml
用1mol/LHCl调pH至8.8,加MilliQ水定容至500ml。
4℃冰箱保存。
0.5mol/LTris碱pH6.8
Tris碱12g
MilliQ水120ml
用1mol/LHCl调pH至6.8,加MilliQ水定容至200ml。
4℃冰箱保存。
10%SDS
SDS10g
MilliQ水100ml
混匀后,室温保存。
10%Ap
Ap0.1g
MilliQ水1ml(用时加水溶解)
溶解后,4℃冰箱保存。
10×电泳缓冲液
(1×=25mMTris,192mMglycine,0.1%SDS,pH8.3)
Tris碱30g
甘氨酸144g
SDS10g
MilliQ水1L
混匀后,室温保存。
2×SDS-PAGE上样缓冲液
0.5MpH6.8Tris碱2.0ml
10%SDS4.0ml
甘油2.0ml
1%溴酚蓝0.05ml
MilliQ水定容至10ml
DTT0.154g(用时现加)
2.2SDS-PAGE凝胶的配制
参见附录1。
2.3操作方法
1.将玻璃板洗净、晾干、固定。
2.按照实验要求,配制不同浓度的分离胶。
将分离胶注入玻璃板夹层中,上部用MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇封面,保持胶面平整,待分离胶聚合后,配制浓缩胶。
3.配制好浓缩胶后,倒去分离胶表面的少量水分,然后灌入浓缩胶,插入点样梳。
4.将待分析鉴定的蛋白质样品,加入等体积2×SDS-PAGE上样缓冲液,100℃水浴3-5分钟(插入冰浴冷却后加样)。
5.在电泳槽加入电泳缓冲液后,小心拔去上样梳,然后用注射器洗干净加样孔,检查一下电路连通状况(注意正负级),然后关闭电源。
用微量加样器分别吸取待分析样品,根据蛋白质浓度和加样孔体积决定加样量。
6.加样完毕后,接通电源,起始时用的低电流或低电压,待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后,再加大电流(或电压),待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。
7.电泳结束后,轻轻撬开两层玻璃,取出凝胶,并切角以作记号(戴手套,防止污染胶面)。
8.染色。
2.4注意事项
1.玻璃板一定要清洗干净,否则在染色时会有不必要的凝胶背景。
2.过硫酸铵(Ap)要新鲜配制。
40%的过硫酸铵储存于冰箱中只能使用2-3天,低浓度的过硫酸铵溶液只能当天使用。
3.蛋白质从浓缩胶部分到分离胶部分转移为避免点脱尾和损失高分子量蛋白,应缓慢进行(场强小于10V/cm)。
4.用MiniProtein3电泳槽时,以电流为标准,开始进样的低电流为5mA/gel,待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后,再加大电流到10-15mA/gel;以电压为标准,开始进样的低电压为50-75V/gel,待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后,再加大电压到150-200V/gel。
用Protein
电泳槽时,以电流为标准,开始进样的低电流为10mA/gel,待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后,再加大电流到20-30mA/gel;以电压为标准,开始进样的低电压为75-100V/gel,待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后,再加大电压到300-400mA/gel。
第三章双向电泳
3.1溶液配制
水化上样缓冲液(
)
尿素8M4.805g
CHAPS4%0.4g
DTT65mM0.098g(现加)
Bio-Lyte0.2%(w/v)50l(40%)(现加)
溴酚蓝0.001%10l(1%溴酚蓝)
MilliQ水定容至10ml
分装成10小管,每小管1ml,-20℃冰箱保存。
水化上样缓冲液(
)
尿素7M4.2g
硫脲2M1.52g
CHAPS4%0.4g
DTT65mM0.098g(现加)
Bio-Lyte0.2%(w/v)50l(40%)(现加)
溴酚蓝0.001%10l(1%溴酚蓝)
MilliQ水定容至10ml
分装成10小管,每小管1ml,-20℃冰箱保存。
水化上样缓冲液(
)
尿素5M3.0g
硫脲2M1.52g
CHAPS2%0.2g
SB3-102%0.2g
DTT65mM0.098g(现加)
Bio-Lyte0.2%(w/v)50l(40%)(现加)
溴酚蓝0.001%10l(1%溴酚蓝)
MilliQ水定容至10ml
分装成10小管,每小管1ml,-20℃冰箱保存。
胶条平衡缓冲液母液
尿素6M36g
SDS2%2g
Tris-HCl0.375MpH8.825ml(1.5MpH8.8Tris-HCl)
甘油20%20ml
MilliQ水定容至100ml
分装成10管,每管10ml,-20℃冰箱保存。
胶
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