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细胞工程
绪论
细胞工程:
应用细胞生物学和分子生物学方法,借助工程学的试验方法或技术,在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性,以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法的学科。
广义的细胞工程包括所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术,狭义的细胞工程则指细胞融合和细胞培养技术。
据对象不同,细胞工程可分动物细胞工程和植物细胞工程。
动物细胞工程包括:
细胞培养技术(包括组织培养、器官培养);细胞融合技术;胚胎工程技术(核移植、胚胎分割等);克隆技术(单细胞系克隆、器官克隆、个体克隆)。
植物细胞工程包括:
植物组织、器官培养技术;细胞培养技术;原生质体融合与培养技术;亚细胞水平的操作技术等。
细胞学说提出:
细胞是有机体,亦是生物体的基本结构单位,由它构成整个生物个体。
细胞全能性学说:
高等植物的组织、器官可以不断分割,直到单个细胞。
如果每个细胞都有植物个体一样的性质和能力,那么,可以通过植物细胞培养使单个细胞发育成为一个新个体
植物组织培养:
指用无菌方法使植物体的离体器官、组织和细胞在人为提供的条件下生长和发育的所有培养技术的总称,也可称离体培养。
或定义为:
利用植物体的器官、组织或细胞,通过无菌操作接种于人工配制的培养基上,在一定的光照和温度条件下进行培养,使之生长发育的技术。
组织培养按培养对象可分为:
植株培养、器官培养、组织培养、细胞培养、原生质体培养
1.植物细胞工程的理论基础
一.细胞全能性的一般概念
一个细胞所具有的产生完整生物个体的固有能力称之为细胞的全能性。
细胞全能性的绝对性与相对性:
不是所有基因型的所有细胞在任何条件下都具有良好的培养反应;即使对于植物细胞而言,细胞全能性也并不意味着任何细胞均可以直接产生植物个体;动、植物细胞全能性的表现程度存在明显的差异。
植物细胞全能性表现根据细胞类型不同从强到弱:
营养生长中心>形成层>薄壁细胞>厚壁细胞(木质化细胞)>特化细胞(筛管、导管细胞);
根据细胞所处的组织不同从强到弱为:
顶端分生组织>居间分生组织>侧生分生组织>薄壁组织(基本组织)>厚角组织>输导组织>厚壁组织。
二.离体培养中细胞的脱分化
脱分化:
外植体―→愈伤组织或↗体细胞胚↘完整植株
脱分化细胞↘不定器官↗
直接伸长
茎尖培养(较大时)――→完整植株。
发育
幼胚培养(较大时)――→完整植株
外植体:
植物组织培养中用来进行无菌培养的离体材料,可以是器官、组织、细胞和原生质体等。
脱分化后的细胞,经过细胞分裂,产生无组织结构、无明显极性的、松散的细胞团称为愈伤组织。
愈伤组织的种类
1、胚性愈伤组织:
表面光滑、组织结构紧凑、细胞小、再生力强。
胚性愈伤组织容易形成胚状体,所以被称为胚性愈伤组织。
2、非胚性愈伤组织:
表面粗糙、组织结构疏松、细胞大。
注意:
1、并不是所有的细胞脱分化的结果都必然形成愈伤组织。
有些植物体的细胞脱分化以后直接形成胚性细胞,进而形成体细胞胚。
2、多数愈伤组织内的细胞并不都是未分化的细胞,即同一愈伤组织内的细胞之间其状态存在一定的差异。
三.细胞分化:
是指导致细胞形成不同结构,引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。
分化也可以说是相同基因型的细胞所具有的各个不同的表现型。
时间上的分化:
一个细胞在不同的发育阶段上可以有不同的形态结构和功能;
空间上的分化:
对于多细胞生物来讲,同一细胞后代,由于所处的环境不同而可以有相异的形态结构和功能
1.细胞分化与基因组变化
细胞分化过程中,可以观察到的最常见的变化是染色体的反复复制,而并不进行细胞分裂。
核内染色体的复制过程可以区分出两种主要类型:
一是核内有丝分裂,导致核内多倍体,二是大量复制染色丝,导致形成多线染色体。
另一类基因组的变化是基因重排。
2.细胞分化与极性建立
极性是指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。
在很多情况下,细胞的不均等分裂是是细胞极性建立的标志。
无论是在活体还是在离体条件下,目前一般认为,极性的建立和维管成分的产生,是植物细胞分化的基本特征
4.影响细胞分化的因素
a.激素:
生长素能促进维管组织形成、细胞分裂素与木质部的发生有关b、蔗糖浓度
C、光照与温度:
光照对于维管组织的分化具有促进作用,适宜的温度对于维管组织的分化是必需的。
§2.器官发生
植物的离体器官的发生:
培养条件下的组织或细胞团(愈伤组织)分化形成不定根、不定芽等器官的过程。
不定根:
从茎、叶上生出的根叫做不定根。
不定芽:
不是从叶腋或枝顶发出,而是从叶子、根上或从树干上发出的芽
一.离体培养中器官发生的方式:
通过器官发生形成再生植株大体上有三种方式:
第一种方式是先芽后根;第二种方式为先根后芽;
第三种方式是在愈伤组织的不同部位形成芽和根,再通过维管组织的联系形成完整植株。
二.器官分化的过程
离体条件下,经过愈伤组织再分化器官一般要经过三个生长阶段
1.外植体经过诱导形成愈伤组织。
2.生长中心的形成。
当把愈伤组织转移到有利于有序生长的条件下以后,首先在若干部位成丛出现类似形成层的细胞群,称之为生长中心或拟分生组织,它们是愈伤组织形成器官的部位。
3.器官原基及器官形成。
生长中心形成后,按照其已确立的极性,某些细胞开始分化形成管状细胞,进而形成微管组织,开始形成不同的器官原基,进而分化出相应的组织和器官。
一般认为,芽和茎原基通常起源于培养组织中比较表层的细胞,即外起源,而根原基则发生在组织较深处,是内起源。
三.影响器官分化的因素
1.外植体-位置、状态及组织类型外植体的状态和组织类型影响诱导和分化的难易;外植体的部位直接影响器官分化的类型。
有变态器官(如鳞茎、球茎、块茎等)的植物,在培养中往往也容易形成相应的变态器官,
2.生长调节剂:
离体培养下的器官分化在大多数情况下是通过外源提供适宜的植物生长调节剂来实现的。
种类、浓度和不同类型生长调节剂的比例是影响根芽等分化的关键。
3.光照:
光照有利于维管组织和叶绿体形成进而分化芽。
愈伤组织的诱导培养一般是在黑暗或弱光照条件下进行的,细胞中完全没有维管成分,当转入强光照条件下以后,才能逐渐变绿并形成维管组织。
分化培养的初期连续光照能促进愈伤组织变绿,随后的昼夜交替则有利于细胞极性的建立,从而促进器官分化。
4.温度:
愈伤组织诱导培养时,温度可以适当提高,而分化温度比诱导温度要低。
如烟草,愈伤组织生长时33℃仍可良好生长,而分化则必需在18℃条件下才适宜。
与光周期相似,某些需要通过低温春化的植物,在离体培养中器官形成有时也需要低温处理
§3.离体培养下的遗传与变异
一、培养细胞变异的类型
离体培养中,组织、细胞、原生质体培养再生植株中,会有各种各样的变异。
例如,叶色、花色的变异,株高、果实大小的变异,染色体结构和数目的变异,由于离体培养条件下并没有发生雌雄配子的重组和交换。
由于它们没有发生有性过程,因此,我们把在组织培养条件下所表现的遗传与变异特征称之为体细胞遗传与变异,由此发展起来的遗传学分枝称为体细胞遗传学。
培养细胞变异的类型
1、自发产生的变异,即培养物在未加诱变因素的情况下产生变异。
2、诱发产生的变异,即培养物在诱变因素作用下产生变异
1、自发产生的变异
A.染色体多倍性和非整倍性
B.畸形变异最常见的变异是白化苗突变,其次是产生丛生芽、肉质茎芽等。
C.非遗传变异
a、外遗传变异:
在植物愈伤组织培养过程中,常常出现一种不涉及基因结构的变化,而只是在基因表达水平上的变异。
b、生理适应变异:
常是在某种外界条件存在时才表现出变异,外界条件不存在时,变异也随之消失。
二、变异原因:
1、 植物本身的异质性(嵌合性)(不是真正意义上的突变)
无性繁殖植物的体细胞中,存在广泛的异质性(如体细胞突变等原因造成),在整体中被掩盖,无法表现出来。
在离体培养中,原来具有不同类型的细胞被诱导分裂,由这些变异的细胞再生的植株为变异植株,经过一定的选择,选育新品种。
2、培养条件引起的变异:
1) 培养基中添加的激素2) 形成愈伤组织过程中,细胞分裂异常
3)环境条件的改变(温度、光照时间及强度与原来生长环境不同)
三.影响离体培养细胞遗传变异的因子
1、供体植株:
倍性水平、基因型、外植体细胞的分化程度
2、培养基及培养方式:
培养基的成分、物理状态及培养类型
原生质体培养的体细胞变异大于细胞培养的变异,而细胞培养的变异又大于组织器官培养的变异
3、继代培养的次数:
一般来讲,继代时间越长、继代次数越多,细胞变异的几率越大。
四.体细胞无性系变异的诱导
自发变异往往频率较低,为了增加变异频率,在培养基中添加化学诱变剂或使用物理方法处理,这样,细胞群体中就会产生各种各样的变异
诱变剂类型:
诱变剂包括物理的和化学的两大类。
物理诱变剂:
X射线、γ射线、中子、β粒子、α粒子和紫外线等。
化学诱变剂:
烷化剂、碱基类似物、移码诱变剂和某些抗生素类等。
五、优良变异的筛选方法
1、离体条件下体细胞无性系变异的筛选的优点:
(1)可以在小空间内对大量个体进行选择
(2)不受季节限制,筛选效率高
(3)诱变和筛选条件可以根据需要进行调节和控制,提高了试验的重复性。
(4)理化诱变剂可较均匀接触细胞,因此可以引起培养细胞较高频率发生突变,增加了选择机会
(5)变异是在单细胞水平上进行的,避免整株水平上常呈现出的嵌合体,可以省去变异分离的麻烦。
2、体细胞变异材料的选择
3、筛选方法
(1)直接筛选法
在设计的选择条件下,能使培养细胞或再生个体获得直接感官上的差异,因此能将突变个体和非突变个体分离。
最直接的做法是用一种含有特定物质的选择培养基,此培养基上只有突变细胞能够生长,而非突变细胞不能生长,从而直接筛选出突变体,如抗除草剂、抗盐突变体的筛选,均可直接在培养基中加入一定浓度的除草剂或增加渗透压的物质。
另外也可以在再生植株水平上进行筛选。
A培养及筛选过程(在细胞水平上):
组织、器官、愈伤组织、原生质体等
↓诱发变异处理、筛选压
耐性愈伤组织
↓
再生植株
↓鉴定
耐性植株
2、间接筛选法
间接选择法是一种借助于与突变表现型有关的性状作为选择指标的筛选方法。
当缺乏直接选择表型指标或直接选择条件对细胞生长不利时,可考虑采用间接筛选法。
七、变异的抑制
抑制变异可从以下几点考虑:
1、利用比较稳定的品种材料。
2、利用茎尖、幼胚等再生能力较强的组织进行培养。
3、避开使用高浓度激素。
4、不经过愈伤组织,而直接从脱分化细胞再生。
5、尽量促使植株早再生,使培养时间缩短。
2.细胞工程的基本设备和无菌操作
第一节基本设备。
植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的。
要做到无菌的条件,需要一定的设备、器材和用具,同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。
标准组织培养室包括:
洗涤室(区)、制备室(区)、灭菌室(区)、储放室(区)、操作室(区)、培养室(区)、观察室(区)、药品室(区)
实验室设计原则:
保证无菌操作,达到工作方便,防止污染
1、洗涤室
玻璃器皿和塑料器皿
1、洗涤 包括用自来水、洗液、洗涤剂清洗2、烘干 包括自然晾干和烘箱干燥
2、药品室存放常用的化学试剂无机盐类、有机物、生长调节剂等
3、制备室培养基的配制生理生化测定
4、储存室(区)存放配制后的培养基或未用完的培养基
5、灭菌室:
即消毒室,是培养基、玻璃器皿、塑料器皿和其他物品消毒灭菌的地方
6、操作室:
也称接种室,用于植物材料的消毒、接种、培养物的转移、试管苗的继代、原生质体的制备以及一切需要进行无菌操作的技术程序
要求:
干爽安静,清洁明亮。
墙壁光滑平整不易积污灰尘,地面平坦无缝便于清洗和灭菌。
7、培养室接种到培养瓶等器皿中的植物材料培养的场所。
培养室的大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。
其设计以充分利用空间和节省能源为原则。
培养室最重要的因子是温度,一般20—27℃左右,室内湿度也要求恒定,相对湿度在70%~80%为好,控制光照时间可安装定时开关钟,一般需要每天光照10-16h,现代组培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为主要能源,可节省能源,且组培苗接受太阳光生长良好,驯化易成活。
驯化室:
植物组织培养材料移到田间前,先移到驯化室进行练苗,待生根成活后,再移到田间苗圃。
二、基本设备
1、烘箱(洗涤室)
作用:
干燥洗净的器皿、高温干热灭菌、测定培养物的干重、气浴
2、冰箱(制备室)作用:
低温保存材料,存放药品、培养基母液、激素、酶制剂。
如超低温冰箱
3、灭菌锅(灭菌室):
类型:
普通医用消毒锅。
大高压灭菌锅作用:
培养基、水和各种器皿的消毒
4、超净工作台{操作室(接种室)}作用:
无菌操作平台
5、酸度计(制备室)作用:
测定培养基及酶制剂的pH值
6、显微镜(观察室)7、天平(制备室)作用:
称取大量元素、微量元素、酶制剂8、玻璃器皿
需大量的玻璃器皿。
要求由碱性溶解度小的硬质玻璃制成,以保证长期贮存药品及培养的效果;透光度好,能耐高压高温,能方便放人培养基和培养材料的器皿。
培养用的:
试管、三角瓶、培养皿等
显微镜下观察用的:
细胞微室、载玻片、培养皿等
最常使用的是三角瓶,规格有lOOml,250ml,500ml等,一般使用100ml三角瓶,无论静止或振荡培养皆适用。
其培养面积大,利于组织生长,受光也比试管好。
由于瓶口较小,亦不易污染。
培养皿:
要求上、下能密切吻合。
在游离细胞、原生质体、花粉等的静置培养、看护培养、无菌种子的发芽、植物材料的分离等都需采用。
试管:
18mmX180mm或20mmX200mm规格。
可用于培养较高的试管苗,另外也不易污染。
培养器皿还可就地取材,采用一些代用品。
广口的200ml罐头瓶:
加盖半透明的塑料盖,瓶口大,大量繁殖时操作方便、工作效率高,也减少了培养材料的损伤。
缺点:
易引起污染。
瓶口封塞:
一定的通气性和密闭性,以防止培养基干燥和杂菌污染。
棉塞封口:
夏季极易污染,且不易保持培养基的湿度。
现多采用聚丙烯塑料薄膜作为封口,以线绳结扎或橡皮圈箍扎。
为了增加通气性,可在里面衬一层硫酸纸或牛皮纸。
目前,培养容器和制备培养基所需的玻璃器皿逐渐被塑料器皿所代替。
塑料容器具有质轻、透明、不易破碎、成本低等优点,如培养容器多为平底方盒形,可提高培养空间利用率的植株数,并能一层层地叠摞起来,从而节约空间。
这类塑料制品多是采用聚丙烯材料制成,耐高温,可进行高压灭菌。
有些器皿为一次性消耗品,可节省洗涤人工,还可节省时间,提高效率。
一次性塑料容器或带螺丝帽的玻璃瓶,无须另外配盖,使用时比较方便。
9、接种用具
1.镊子类:
根据操作需要有各种类型,镊子过短.容易使手接触瓶口,造成污染。
镊子太长,使用起来不灵活。
如在分离茎尖幼叶时,用更小的钟表镊子。
2.剪刀类:
用于切断茎段、叶片等。
也可用弯形剪刀,可以深入到瓶口中进行剪切。
3.解剖刀:
切割较小材料和分离茎尖分生组织。
刀片要经常调换,使之保持锋利状态,否则切割时会造成挤压,引起周围细胞组织大量死亡,影响培养效果。
4.解剖针:
解剖针可深入到培养瓶中,转移细胞或愈伤组织。
也可用于分离微茎尖的幼叶,可自制。
10、微孔过滤器(细胞过滤器)灭菌用:
如激素一般用石棉滤膜
第二节无菌操作
一、灭菌
菌:
细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。
在自然条件下忍耐力强,生活条件要求简单,繁殖力极强,条件适宜时便可大量滋生。
灭菌是组织培养重要的工作之一。
有菌的范畴是:
凡是暴露在空气中的物体,接触自然水源的物体,至少它的表面都是有菌的。
无菌室等未经处理的地方、超净台表面、简单煮沸的培养基、我们使用的刀、剪在未处理之前、我们身体的整个外表及与外界相连的内表,即我们呼出的气体、培养容器无论洗得多干净等等都是有菌的。
无菌的范畴是:
经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体,经其他物理的或化学的灭菌方法处理后的物体。
灭菌是指用物理或化学的方法,杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体,即把所有生命的物质全部杀死。
消毒,它指杀死、消除或充分抑制部分微生物,使之不再发生危害作用,显然经过消毒,许多细菌芽孢、霉菌的厚壁孢子等不会完全杀死,
无菌操作:
通过严格灭菌的操作空间(接种室、超净台、等)和使用的器皿,以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。
在这样的条件下进行的操作。
常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类:
物理方法:
干热(烘烧和灼烧)、湿热(常压或高压蒸煮)、射线处理(紫外线、超声波、微波)、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施;
化学方法:
使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。
方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用。
具体措施如下:
1、湿热灭菌(培养基)
培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。
原理:
在0.1MPa的压力下,锅内温度达121℃。
可杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。
注意完全排除锅内空气,使锅内全部是水蒸气,使锅内均匀升温,灭菌才能彻底。
常用排气方法是:
关闭放气阀,通电后,待压力上升到O.05MPa时,打开放气阀,放出空气,待压力表指针归零后,再关闭放气阀。
关阀再通电后,压力表上升达到0.1MPa时压力0.1-0.15MPa,20min。
培养基灭菌要严格遵守保压时间,既要保压彻底,又要防止培养基中的成分变质或效力降低。
对于一些布制品,如实验服、口罩等也可用高压灭菌。
洗净晾干后用耐高压塑料袋装好,高压灭菌20-30min。
高压灭菌通常使培养基中的蔗糖水解为单糖,从而改变培养基的渗透压。
在8%-20%蔗糖范围内,高压灭菌后的培养基约升高0.43倍。
。
防止高压灭菌培养基变化的方法:
(1)经常注意搜集有关高压灭菌影响培养基成分的资料,及时采取有效措施。
(2)设计培养基配方时尽量采用效果类似的稳定试剂并准确掌握剂量。
如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇,以IBA代替IAA,控制活性炭的用量(在0.1%以下)注意pH值对高压灭菌下培养基中成分的影响等。
(3)配制培养基时应注意成分的适当分组与加入的顺序。
如将磷、钙和铁放在最后加入。
(4)注意高压灭菌后培养基pH值的变化及回复动态。
如高压灭菌后的pH值常由5.80升高至6.48。
而96h后又回降至5.8左右。
在实验中就可以根据这一规律加以掌握。
2.灼烧灭菌(用于无菌操作的器械)在无菌操作时,把镊子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中,使用之前取出在酒精灯火焰处灼烧灭菌。
冷却后,立即使用。
3.干热灭菌(玻璃器皿及耐热用具)
原理:
利用烘箱加热到160-180℃杀死微生物。
在干热条件下,细菌的营养细胞的抗热性大为提高,接近芽孢的抗热水平,通常采用170℃持续90min来灭菌。
干热灭菌的物品要预先洗净并干燥,工具等要妥为包扎,以免灭菌后取用时重新污染。
包扎可用耐高温的塑料。
灭菌时应渐进升温,达到预定温度后记录时间。
烘箱内放置的物品的数量不宜过多,以免妨碍热对流和穿透,待充分冷凉,才能打开烘箱。
缺点:
能源消耗太大,浪费时间。
4.过滤灭菌(不耐热的物质)
一些生长调节剂,如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素不耐热,不能用高压灭菌处理,通常采用过滤灭菌方法。
防细菌滤膜的网孔的直径为0.45μm以下,当溶液通过滤膜后,细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜网孔直径而被阻。
在需要过滤灭菌的液体量大时,常使用抽滤装置;液量小时,可用注射器。
使用前对其高压灭菌,
5.紫外线和熏蒸灭菌(空间)
(1)紫外线灭菌使细菌蛋白质和核酸发生结构变化。
紫外线以260nm的杀菌能力最强,但穿透物质的能力很弱,只适于空气和物体表面的灭菌,且要求距照射物以不超过1.2m为宜。
(2)熏蒸灭菌加热焚烧、氧化等使化学药剂变为气体状态扩散,以杀死空气和物体表面的微生物。
方法简便。
常用:
甲醛,用量5-8ml/m3,加5g/m3高锰酸钾氧化挥发。
房间可预先喷湿以加强效果。
冰醋酸也可。
化学消毒剂的种类很多,一般说来,温度越高,作用时间越长,杀菌效果越好。
另外,消毒剂要制成水溶状态,如升汞与高锰酸钾。
消毒剂一般是浓度越大,杀菌能力越强,但石炭酸和酒精例外。
6.喷雾灭菌(物体表面)物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。
如桌面、墙面、双手、植物材料表面等,70-75%的酒精反复涂擦灭菌l%-2%的来苏儿溶液0.25%-1%的新洁尔灭
7.植物材料表面消毒剂灭菌
从外界或室内选取的植物材料,都不同程度地带有各种微生物。
这些污染源一旦带入培养基,会造成培养基污染。
因此,植物材料必须经严格的表面灭菌处理。
材料经无菌操作手续接到培养基上的过程叫做接种。
主要步骤:
第一步:
材料水洗
切割成适当大小。
置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时。
易漂浮或细小的材料,可装入纱布袋内冲洗。
流水冲洗在污染严重时特别有用。
洗时可加入洗衣粉清洗,再用自来水冲净洗衣粉水。
可除去轻度附着在植物表面的污物,脂质性的物质。
最理想的清洗物表面活性物质:
吐温。
第二步:
对材料的表面浸润灭菌。
在超净台或接种箱内完成,准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、无菌水、手表等。
用70%酒精浸10~30s。
酒精使植物材料表面易被浸湿,70%酒精穿透力强,易杀伤植物细胞,故浸润时间不能过长。
有一些特殊的材料,如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗,多层鳞片的休眠芽等等,以及主要取用内部的材料,酒精处理可稍长。
第三步:
灭菌剂处理。
表面灭菌剂的种类较多,可根据情况选取1—2种使用。
除氯化汞,上述灭菌剂应现配现用。
次氯酸钠和次氯酸钙都是利用分解产生氯气来杀菌的,故灭菌时加盖较好;升汞是由重金属汞离子来达到灭菌的;过氧化氢是分解中释放原子态氧来杀菌的,残留的影响较小,灭菌后用无菌水涮洗3—4次即可。
灭菌时间是从倒入消毒液开始,至倒入无菌水时为止。
记录时间还便于比较消毒效果。
灭菌液要充分浸没材料,宁可多用些灭菌液。
在灭菌溶液中加吐温-80或TritonX效果较好,使药剂更易于展布,更容易浸入到灭菌的材料表面。
但吐温加入后对材料的伤害也在增加,应注意吐温的用量和灭菌时间。
第四步:
无菌水涮洗,每次3min左右,涮洗3-l0次左右。
可免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。
升汞残毒较难去除,应当多洗几次。
二、无菌操作
接种时由于有一个敞口的过程,极易引起污染,主要由空气中的细菌和工作人员本身引起,接种室要严格进行空间消毒。
接种室内保持定期用1%-3%的高锰酸钾溶液对设备、墙壁、地板等进行擦洗。
除了使用前用紫外线和甲醛灭菌外,还可在使用期间用70%的酒精或3%的来苏儿喷雾,使空气中灰尘颗粒沉降下来。
无菌操作可按以下步骤进行:
(1)接种4h前用甲醛熏蒸接种室,并打开其内紫外灯进行灭菌;
(2)接种前20min,打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯;
(3)先洗净双手,在缓冲间换好专用实验服,并换穿拖鞋等;
(4)上工作台后,用酒精棉球擦拭双手,特别是指甲处。
然后擦拭工作台面;
(5)先用酒精棉球擦拭接种工具,再将镊子和剪子从头至尾过火一遍,然后反复过火尖端处,对培养皿要过火烤干;
(6)接种时,双手不能离开工作台,不能说话、走动和咳嗽等;
(7)接种完毕后要清理干净工作台,可用紫外灯灭菌30min。
若连续接种,每5天要大强度灭菌一次。
三、接种
(1)材料吸干后,一手拿镊子,一手拿剪子或解剖刀,对材料进行适当的切割。
如叶片:
0.5cm见方的小块;茎:
含有一个节的小段。
微茎尖剥成只含l-2片幼叶。
接种过程中要经常灼烧接种器械,防止交叉污染。
(2)将切割好的外植体插植或放置到培养基上。
具体过程是:
揭开盖子→试管口过火→夹取材料
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