第4章 微生物的生长.docx

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第4章微生物的生长

第4章微生物的生长

本章的学习目的与要求

⑴ 掌握微生物生长的概念，个体生长与群体生长的关系。

⑵ 掌握衡量微生物群体生长的指标，微生物生长量的测定方法。

⑶ 了解微生物的群体生长规律和环境因素对微生物生长的影响。

1.  微生物生长

1.1微生物生长的概念

一个微生物细胞在合适的外界环境条件下，不断地吸收营养物质，并按其自身的代谢方式进行新陈代谢。

如果同化作用的速度超过了异化作用，则其原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加，于是出现了个体的生长现象。

如果这是一种平衡生长，即各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，从而引起个体数目的增加，这时，原有的个体已经发展成一个群体。

随着群体中各个个体的进一步生长，就引起了这一群体的生长，这可从其重量、体积、密度或浓度作指标来衡量。

所以：

个体生长→个体繁殖→群体生长

群体生长＝个体生长＋个体繁殖

这里需要强调的是，上述微生物生长的阶段性，对于单细胞微生物来说是不明显的，往往在个体生长的同时，伴随着个体的繁殖，这一特点，在细菌快速生长阶段尤为突出，有时在一个细胞中出现2或4个细胞核；除了特定的目的以外，在微生物的研究和应用中，只有群体的生长才有实际意义，因此，在微生物学中提到的“生长”，均指群体生长。

这一点与研究高等生物时有所不同。

微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映，因此，生长繁殖情况就可作为研究各种生理、生化和遗传等问题的重要指标；同时，微生物在生产实践上的各种应用或是对致病、霉腐微生物的防治，也都与它们的生长繁殖和抑制紧密相关。

下面对微生物的生长繁殖及其控制的规律作较详细的介绍。

1.2微生物生长量的测定

既然生长意味着原生质含量的增加，所以测定生长的方法也都直接地以此为根据，而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。

1.2.1 稀释平板菌落计数法 

是一种最常用的活菌计数法。

取一定体积的稀释菌液与合适的固体培养基在其凝固前均匀混合，或涂布于已凝固的固体培养基平板上。

在最适条件下培养后，从平板上（内）出现的菌落数乘上菌液的稀释度，即可计算出原菌液的含菌数。

在一个9cm直径的培养皿平板上，一般以出现50～500个菌落为宜。

这种方法在操作时，有较高的技术要求。

其中最重要的是应使样品充分混匀，并让每支移液管只能接触一个稀释度的菌液。

有人认为，对原菌液浓度为109个/mL的微生物来说，如果第一次稀释即采用10-4级（用10μL菌液至100mL无菌水中），第二次采用10-2级（吸1mL上述稀释液至100mL无菌水中），然后再吸此菌液0.2mL进行表面涂布和菌落计数，则所得的结果最为精确。

其主要原因是，一般的吸管壁常因存在油脂而影响计数的精确度（有时误差竟高达15％）。

这一稀释过程的示意图详见实验技术。

1.2.2 血球计数板法

是用来测定一定容积中的细胞总数目的常规方法（详见第十章实验五）。

这种方法的特点是测定简便、直接、快速，但测定的对象有一定的局限性，只适合于个体较大的微生物种类，如酵母菌、霉菌的孢子等；此外测定结果是微生物个体的总数，其中包括死亡的个体和存活的个体，要想测定活菌的个数，还必须借助其它方法配合。

1.2.3 称干重  

可用离心法或过滤法测定，一般干重为湿重的10%～20%。

在离心法中，将待测培养液放入离心管中，用清水离心洗涤1～5次后，进行干燥。

干燥温度可采用105℃、100℃或红外线烘干，也可在较低的温度（80℃或40℃）下进行真空干燥，然后称干重。

以细菌为例，一个细胞一般重约10-12～10-13g。

另一种方法为过滤法。

丝状真菌可用滤纸过滤，而细菌则可用醋酸纤维膜等滤膜进行过滤。

过滤后，细胞可用少量水洗涤，然后在40℃下真空干燥，称干重。

以大肠杆菌为例，在液体培养物中，细胞的浓度可达2×108个/mL。

100mL培养物可得10～90mg干重的细胞。

这种方法较适合于丝状微生物的生长量的测定，对于细菌来说，一般在实验室或生产实践中较少使用。

1.2.4 比浊法

细菌培养物在其生长过程中，由于原生质含量的增加，会引起培养物混浊度的增高。

最古老的比浊法是采用MoFarland比浊管。

这是用不同浓度的BaCl2与稀H2SO4配制成的10支试管，其中形成的Ba2SO4有10个梯度，分别代表10个相对的细菌浓度（预先用相应的细菌测定）。

某一未知浓度的菌液只要在透射光下用肉眼与某一比浊管进行比较，如果两者透光度相当，即可目测出该菌液的大致浓度。

如果要作精确测定，则可用分光光度计进行。

在可见光的450～650nm波段内均可测定。

为了对某一培养物内的菌体生长作定时跟踪，可采用不必取样的侧壁三角烧瓶来进行。

测定时，只要把瓶内的培养液倒入侧臂管中，然后将此管插入特制的光电比色计比色座孔中，即可随时测出生长情况，而不必取用菌液（图5-1）。

图5-1 测定生长用的侧臂三角烧瓶

1. 侧臂试管三角烧瓶；2. 侧臂试管；3. 侧臂试管插座；4. 比色架面板；

5. 连接螺丝；6. 比浊测定透光窗；7. 光路开关孔；8. 比色架底板

以上介绍了若干测定微生物的生长量或计算繁殖数的主要方法。

其中，最常用的为称干重、测浊度（用分光光度计）、用计数板测总菌数以及用平板菌落计数法测活菌数等方法。

必须指出的是，不管用什么方法，都有其优缺点和使用范围。

所以，在使用前，一定要根据自己的研究对象和研究目的的不同，选用最合适的方法。

1.3 微生物的群体生长规律

单细胞的微生物，如细菌、酵母菌在液体培养基中，可以均匀地分布，每个细胞接触的环境条件相同，都有充分的营养物质，故每个细胞都迅速地生长繁殖。

霉菌多数是多细胞微生物，菌体呈丝状，在液体培养基中生长繁殖的情况与单细胞微生物不一样，如果采取摇床培养，则霉菌在液体培养中的生长繁殖情况，近似于单细胞微生物。

因液体被搅动，菌丝处于分布比较均匀的状态，而且菌丝在生长繁殖过程中不会象在固体培养基上那样有分化现象，孢子产生也较少。

1.3.1典型的生长曲线

微生物生长繁殖的速度非常快，一般细菌在适宜的条件下，大约20~30分钟就可以分裂一次，如果不断迅速地分裂，短时间内可达惊人的数目，但实际上是不可能的。

在培养条件保持稳定的状况下，定时取样测定培养液中微生物的菌体数目，发现在培养的开始阶段，菌体数目并不增加，一定时间后，菌体数目就增长很快，继而菌体数目增长速度保持稳定，最后增长速度逐渐下降以致等于零。

如果以培养时间为横坐标，以以活菌数的对数值作纵坐标，就可作出一条生长曲线。

这生长曲线（growth curve）代表单细胞微生物从生长开始到衰老死亡的一般规律。

根据微生物的生长速率常数（growth rate constant），即每小时的分裂代数的不同，一般把典型的生长曲线粗分为延滞期、对数期、稳定期和衰亡期四个时期。

见图4-1：

⑴ 延滞期（lag phase）

又叫适应期、缓慢期或调整期，是指把少量微生物接种到新培养液刚开始的一段时间细胞数目不增加的时期，甚至细胞数目还可能减少。

延滞期有如下特点：

1）生长的速率常数为零。

2）细胞的体积增大，DNA、含量增多为分裂作准备。

3）合成代谢旺盛，核糖体、酶类和的合成加快，易产生诱导酶。

4）对不良环境敏感，例如pH、NaCl溶液浓度、温度和抗生素等化学物质。

延滞期出现的原因，可能是为了重新调整代谢。

当细胞接种到新的环境（如从固体培养基接种到液体培养基）后，需要重新合成必需的酶类、辅酶或某些中间代谢产物，以适应新的环境而出现生长的延滞期。

为了提高生产效率，发酵工业中常常要采取措施缩短延滞期，具有十分重要的意义，其方法主要有：

1）以对数期的菌体作种子菌，因对数期的菌体生长代谢旺盛，繁殖力强，抗不良环境和噬菌体的能力强，采用对数期的菌体作种子，延滞期就短。

2）适当增大接种量，生产上接种量的多少是影响延滞期的一个重要因素 ，接种量大，延滞期短，接种量小，则延滞期长。

一般采用3%~8%的接种量，根据生产上的具体情况而定，最高不超过1/10。

3）培养基的成分  为了缩短培养基的营养成分差异，常常在种子培养基中加入生产培养基的某些营养成分，即是种子培养基尽量接近发酵培养基，通常微生物生长在营养丰富的天然培养基中比营养单调的组合培养基中快。

⑵ 对数期（logarithmic phase）

又叫指数期，指在生长曲线中，紧接着延滞期后的一段时期。

此时菌体细胞生长的速率常数R最大，分裂快，细胞每分裂繁殖一次的增代时间（即代时，generation time）短，细胞进行平衡生长，菌体内酶系活跃，代谢旺盛，菌体数目以几何级数增加，群体的形态与生理特征最一致，抗不良环境的能力强。

在对数期中，以下三个参数尤为重要。

1）  繁殖代数（n）   

2）  生长速率常数（R） 

3）  代时（G）

影响微生物对数期增代时间的因素较多，主要有：

菌种 ：

不同微生物代时差别大，即使是同一菌种，由于培养基成分和物理条件（如培养温度、培养基的pH和营养物质的性质）的不同，其对数期的代时也不同。

但是，在一定条件下，各种菌的代时是相对稳定的，多数为20~30分钟，有的长达33小时，快的只有9.8分钟左右。

如表4-1。

表4-1  不同细菌的代时

细菌    培养基    温度（℃） 代时（分）

漂浮假单胞菌（Pseudomonas natriegenes）    肉汤        37    9. 8

大肠杆菌（Escherichia coli）    肉汤    37        17

蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）    肉汤    30    18

嗜热芽孢杆菌（Bacillus thermophilus）    肉汤    55    18.3

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）    肉汤    25    26 –32

巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）    肉汤    30    31

乳酸链球菌（Streptococcus lactis）    牛乳    37    26

嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）    牛乳    37    66 –87

伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi）    肉汤    37    23 .5

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）    肉汤    37    27 –30

霍乱弧菌（Vibrio cholerae）    肉汤    37    21 –38

丁酸梭菌（Clostridium butyricum）    玉米醪    30    51

大豆根瘤菌（Rhizobium japonicum）    葡萄糖    25    344 – 461

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）    合成    37    792 –932

活跃硝化杆菌（Nitrobacter agilis）    合成    27   1200

梅毒密螺旋体（Treponema pallidum）    家兔    37    1980

褐球固氮菌（Azotobacter chroococcum）    葡萄糖    25    240

营养成分：

同种细菌，营养丰富的培养基，其代时就短，反之则长。

培养温度：

温度是影响微生物生长速率的重要物理因素。

在微生物的最适生长温度范围时，代时就短。

如表4-2

表4 –2 大肠杆菌在不同温度下的代时

温度（℃）    代时（分）        温度（℃）    代时（分）

10    860        35    22

15    120        40    17.5

20    90        45    20

25    40        47.5    77

30    29            

⑶ 稳定期 （stationary phase）

又叫最高生长期或恒定期。

处于稳定期的微生物其特点是新繁殖的细胞数与衰亡细胞数几乎相等，即是正生长与负生长达动态平衡，此时生长速度逐渐趋向于零。

出现稳定期的原因主要有1）营养物质特别是生长限制因子的耗尽，营养物质的比例失调，例如C/N比值不合适等；2）酸、醇、毒素或过氧化氢等有害代谢产物的累积；3）pH、氧化还原势等环境条件越来越不适宜等。

稳定期是以生产菌体或与菌体生长相平行的代谢产物，例如单细胞蛋白、乳酸等为目的的一些发酵生产的最佳收获期，也是对某些生长因子例如维生素和氨基酸等进行生物测定的必要前提。

稳定期的微生物，在数量上达到了最高水平，产物的积累也达到了高峰，这时，菌体的总产量与所消耗的营养物质之间存在着一定关系。

此外，由于对稳定期到来的原因进行研究，促进了连续培养技术的产生和研究。

生产上常常通过补料、调节温度和pH等措施，延长稳定期，以积累更多的代谢产物。

⑷ 衰亡期（decline phase或 death phase）

稳定期后，微生物死亡率逐渐增加，以致死亡数大大超过新生数，群体中活菌数目急剧下降，出现了“负生长”（R为负值），此阶段叫衰亡期。

这时，细胞形态多样，例如产生很多膨大、不规则的退化形态；有的细胞内多液泡，革兰氏染色反应为阳性的变成阴性；有的微生物因蛋白水解酶活力的增强发生自溶（autolysis）；有的微生物在这时产生抗生素等次生代谢产物；对于芽孢杆菌，芽孢释放往往也发生在这一时期。

产生衰亡期的原因主要是外界环境对继续生长的微生物越来越不利，从而引起微生物细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，导致菌体死亡。

1.3.2 微生物的连续培养

连续培养（ continuous culture ）又叫开放培养（ open culture ），是相对分批培养（ batch culture ）或密闭培养（ closed culture ）而言的。

微生物置与于一定容积的培养基中，经过培养一段时间后，最后一次性地收获，称分批培养。

在分批培养中，培养基是一次性加入，不再补充，随着微生物的生长繁殖活跃，营养物质逐渐消耗，有害代谢产物不断积累，细菌的对数生长期不可能长时间维持。

连续培养是在研究典型生长曲线的基础上，认识到了稳定期到来的原因，采取在培养器中不断补充新鲜营养物质，并搅拌均匀；另一方面，及时不断地以同样速度排出培养物（包括菌体和代谢产物）。

这样，培养物就达动态平衡，其中的微生物可长期保持在对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率上。

连续培养不仅可随时为微生物的研究工作提供一定生理状态的实验材料，而且可提高发酵工业的生产效益和自动化水平，此法已成为目前发酵工业的发展方向。

连续培养的方法主要有两类：

（1） 恒浊法  其原理是根据培养器内微生物的生长密度，用光电控制系统（浊度计）来检测培养液的浊度（即菌液浓度），并控制培养液的流速，从而获得菌体密度高、生长速度恒定的微生物细胞的连续培养液。

当培养器中浊度增高时，通过光电控制系统的调节，可促使培养液流速加快，反之则慢，以此来达到恒密度的目的。

在恒浊器中的微生物，始终能以最高生长速率进行生长，并可在允许范围内控制不同的菌体密度。

在生产实践上，为了获得大量菌体或与菌体生长相平行的某些代谢产物如乳酸、乙醇时，可以采用恒浊法。

（2） 恒化法  与恒浊法不同的是，恒化法是使培养液流速保持不变，即控制在恒定的流速，使微生物始终在低于最高生长速率条件下进行生长繁殖的一种连续培养方法。

常常通过控制某一种营养物的浓度，使其成为限制性的因子，而其他营养物均为过量，这样，细菌的生长速率将取决于限制性因子的浓度。

随着细菌的生长，菌体的密度会随时间的增长而增高，而限制性生长因子的浓度又会随时间的增长而降低，两者互相作用的结果，出现微生物的生长速率正好与恒速加入的新鲜培养基流速相平衡。

这样，既可获得一定生长速率的均一菌体，又可获得虽低于最高菌体产量，但能保持稳定菌体密度的菌体。

恒化法连续培养主要用于实验室的科学研究中，特别是用于与生长速率相关的各种理论研究中。

连续培养如用于发酵工业中，就称为连续发酵（continuous fermentation）。

连续发酵与分批发酵相比有许多优点：

①自控性 ，便于利用各种仪表进行自动控制，②高效，它使装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等工艺简化了，缩短了生产时间和提高了设备的利用效率，③产品质量较稳定，④节约了大量动力、人力、水和蒸汽，使水、汽、电的负荷减少；但也存在不足之处：

①主要是菌种易于退化，使微生物长期处于高速繁殖的条件下，即使是自发突变率很低，也难以避免变异的发生，②容易污染，在连续发酵中，要保持各种设备无渗漏，通气系统不出任何故障，是极其困难的。

因此，“连续”是有时间限制的，一般可达数月至一年、两年，③连续培养中，营养物的利用率低于分批培养。

在发酵工业中，连续培养技术已广泛用于酵母单细胞蛋白的生产，乙醇、乳酸、丙酮和丁醇等发酵，以及用假丝酵母（Candida spp.）进行石油脱蜡或是污水处理中。

1.3.3 微生物的同步培养

如上所述，在分批培养中，细菌群体以一定速率生长，但所有细胞并非同时进行分裂，即是培养中的细胞不处于同一生长阶段，它们的生理状态和代谢活动也不完全一样。

要研究每个细胞所发生的变化是很困难的。

为了解决这一问题，就必须设法使微生物群体处于同一发育阶段，使群体和个体行为变得一致，所有的细胞都能同时分裂，因而发展了单细胞的同步培养（synchronous culture）技术。

获得细菌同步培养的方法主要有两类，其一是调整生理条件诱导同步性，主要是通过控制环境条件如温度、光线和处于稳定期的培养物添加新鲜培养基等来诱导同步；其二是机械法（又称选择法），它是利用物理方法从不同步的细菌群体中选择出同步的群体，一般可用过滤分离法或梯度离心法来达到。

在这两种方法中，由于诱导法可能导致与正常细胞循环周期不同的周期变化，所以不及选择法好，这在生理学研究中尤其明显。

在选择法中，有代表性的是硝酸纤维素薄膜法（Helmstetter-Cummings）。

根据某些细菌会粘附在硝酸纤维微孔滤膜上的原理，设计了一个具体的选择方法：

将非同步的细菌液体培养物通过微孔滤膜，让细胞吸附于其上；然后将滤膜反置，再以新鲜培养液滤过。

这时，一些没有粘牢固的细胞先被冲洗掉，接着脱落的是那些新分裂形成的细胞，于是就获得了同步生长。

见图4-3：

图4-3 用Helmstetter-Cummings法获得同步生长的细菌

值得注意的是，同步生长的细菌，在培养的过程中会很快丧失其同步性。

例如，在第一个细胞分裂周期中，开始细胞数一直不增加，到后来，数目突然增加一倍。

在第二个分裂周期时，情况就没有那么明显了，到第三个周期时，几乎完全丧失同步性。

其原因是不同个体间，细胞分裂周期一般都有较大的差别。

2. 环境因素对微生物生长的影响

影响微生物生长的外界因素很多，其一是前面讨论过的营养物质，其二是许多物理、化学因素。

当环境条件的改变，在一定限度内，可引起微生物形态、生理、生长、繁殖等特征的改变；当环境条件的变化超过一定极限时，则导致微生物的死亡。

研究环境条件与微生物之间的相互关系，有助于了解微生物在自然界的分布与作用，也可指导人们在食品加工中有效地控制微生物的生命活动，保证食品的安全性，延长食品的货架期。

本节将涉及各种物理、化学因素对微生物生长的抑制和致死的影响，以及在食品工业中的应用。

下面将介绍几个有关的术语。

防腐（Antisepsis） ：

是一种抑菌措施。

利用一些理化因素使物体内外的微生物暂时处于不生长繁殖但又未死亡的状态。

食品工业中常利用防腐剂防止食品变质，如面包、蛋糕和月饼的防霉剂，酸性食品用苯甲酸钠、山梨酸钾、山梨酸钠防腐、或利用低温、干燥、盐腌和糖渍、高酸度等。

消毒（Disinfection）：

是指杀死所有病原微生物的措施，可达到防止传染病的目的。

例如将物体在100℃煮沸10分钟或60-70℃加热30分钟，就可达到杀死病原菌的营养体，但芽孢杀不死。

食品加工厂的厂房和加工工具都要进行定期的消毒，严格的操作人员的手也要进行消毒。

具有消毒作用的物质称为消毒剂。

灭菌（Sterilization）：

是指用物理或化学因子，使存在于物体中的所有生活微生物，永久性地丧失其生活力，包括耐热的细菌芽孢。

这是一种彻底的杀菌方法。

商业灭菌（Commercial sterilization）：

这是从商品角度对某些食品所提出的灭菌方法。

就是指食品经过杀菌处理后，按照所规定的微生物检验方法，在所检食品中无活的微生物检出，或者仅能检出极少数的非病原微生物，并且它们在食品保藏过程中，是不可能进行生长繁殖的，这种灭菌方法，就叫做商业灭菌。

在食品工业中，常用“杀菌”这个名词，它包括上述所称的灭菌和消毒，如牛奶的杀菌是指消毒；罐藏食品的杀菌，是指商业灭菌。

无菌（Asepsis）：

即没有活的微生物存在的意思。

例如，发酵工业中菌种制备的无菌操作技术、食品加工中的无菌罐装技术等。

死亡（dead）：

是指微生物不可逆的丧失了生长繁殖的能力，即使再放到合适的环境中也不再繁殖。

由于不同微生物的生物学特性不同，因此，对各种理化因子的敏感性不同；同一因素不同剂量对微生物的效应也不同，或者起灭菌作用，或者起防腐作用。

在了解和应用任何一种理化因素对微生物的抑制或致死作用时，还应考虑多种因素的综合效应。

2.1温度

温度是影响微生物生长繁殖最重要的因素之一。

在一定温度范围内，机体的代谢活动与生长繁殖随着温度的上升而增加，当温度上升到一定程度，开始对机体产生不利的影响，如再继续升高，则细胞功能急剧下降以至死亡。

与其他生物一样，任何微生物的生长温度尽管有高有低，但总有最低生长温度、最适生长温度和最高生长温度这三个重要指标，这就是生长温度的三个基本点。

如果将微生物作为一个整体来看，它的温度三基点是极其宽的，由以下可看出：

最低生长温度（一般为–5 ~–10℃，极端为–30℃）

    嗜冷菌  

生长温度三基点    最适生长温度       中温菌

嗜热菌

最高生长温度（一般为80~95℃，极端为105~300℃）

就总体而言，微生物生长的温度范围较广，已知的微生物在零下12~100℃均可生长。

而每一种微生物只能在一定的温度范围内生长。

最低生长温度  是指微生物能进行繁殖的最低温度界限。

处于这种温度条件下的微生物生长速率很低，如果低于此温度则生长完全停止。

不同微生物的最低生长温度不一样，这与它们的原生质物理状态和化学组成有关系，也可随环境条件而变化。

最适生长温度  是指某菌分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度。

但是，同一微生物，不同的生理生化过程有着不同的最适温度，也就是说，最适生长温度并不等于生长量最高时的培养温度，也不等于发酵速度最高时的培养温度或累积代谢产物量最高时的培养温度，更不等于累积某一代谢产物量最高时的培养温度。

因此，生产上要根据微生物不同生理代谢过程温度的特点，采用分段式变温培养或发酵。

例如，嗜热链球菌的最适生长温度为37℃，最适发酵温度为47℃，累积产物的最适温度为37℃。

最高生长温度  是指微生物生长繁殖的最高温度界限。

在此温度下，微生物细胞易于衰老和死亡。

微生物所能适应的最高生长温度与其细胞内酶的性质有关。

例如细胞色素氧化酶以及各种脱氢酶的最低破坏温度常与该菌的最高生长温度有关。

见表4-3

表4-3  细胞色素氧化酶以及各种脱氢酶的最低