《酶工程与技术》郭勇 第二版 知识点大全.docx
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《酶工程与技术》郭勇第二版知识点大全
酶工程原理与技术(概论)
第1章绪论
1、酶的概念:
具有生物催化功能的生物大分子。
2、酶的来源:
适宜的细胞,在人工控制条件的生物反应器中生产各种所需的酶。
3、主要目标:
经过预先设计,通过人工操作,获得人们所需的酶,并通过各种方法使酶发挥其催化功能。
4、酶分类可采用4位标码:
第一位:
属于六大类中的哪一类;第二位:
属于该大类中的哪一亚类;第三位:
该亚类中的哪一小类:
第四位:
具体酶在该小类中的序号。
5、六大类酶:
(1)氧化-还原酶:
氧化-还原酶催化氧化-还原反应。
主要包括脱氢酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。
另有过氧化物酶,氧合酶,细胞色素氧化酶等
(2)转移酶:
转移酶催化基团转移反应,即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。
(3)水解酶:
水解酶催化底物的加水分解反应。
主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。
(4)裂合酶:
它能催化一个分子分成两个或多个分子,当然也可将两个或多个分子变成一个分子。
裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。
主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。
(5)异构酶:
异构酶催化各种同分异构体的相互转化,即底物分子内基团或原子的重排过程。
与转移酶不同,异构酶催化的是分子内部的基团转移。
(6)合成酶:
又称为连接酶,能够催化C-C、C-O、C-N以及C-S键的形成反应。
这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。
特点是需要三磷酸腺苷等高能磷酸酯作为结合能源,有的还需要金属离子辅助因子。
6、核酸类酶的分类与命名:
核酶本身是一种RNA,但它可特异性催化某个反应,特别是识别和剪切RNA的某个位点。
据酶催化反应的类型分为:
剪切酶、剪接酶、多功能酶据酶催化的底物分为:
分子内催化(自我剪切酶、自我剪接酶)、分子间催化(RNA剪切酶、DNA剪切酶、多糖剪接酶、多肽剪切酶、氨基酸酯剪切酶、多功能R酶)
7、酶分析:
以酶为分析对象,目的是检测食品、药物体液等生物样品中酶的含量或活性。
8、酶分析包括两种类型:
一是以酶为分析对象的分析,即一般所说的“酶活力测定”;二是以酶为分析工具或分析试剂的分析,称为“酶法分析”。
前者的目的在于检测生物样品中某种酶的含量或活性;后者则主要用于测定与生物学有关样品中酶以外其他物质的含量。
(1)原理:
都是利用酶的专一性、高效催化反应,通过酶反应速度的测定而检测相应的含量;在方法上也都有一个选择适宜反应条件和测定方法,以获得准确可靠的结果的问题。
酶法分析:
是一种以酶为分析工具(分析试剂)的分析法,分析的对象可以是底物、辅酶、活化剂、酶抑制剂。
主要用于测定与生物样品有关的样品中酶以外其他物质的含量。
酶活力:
是指酶催化一定化学反应的能力,其大小可用在一定条件下酶所催化的反应初速度。
(单位时间底物减少或产物增加).
(2)酶活力的测定通常包括两个阶段:
首先在一定的条件下,酶与底物反应一段时间,然后再测定反应液中底物或产物的变化量。
一般经过如下几个步骤:
①据酶催化的专一性,选择适宜的底物,并配置成一定浓度的底物溶液;
②据酶的动力学性质,确定酶催化反应的温度、pH值、底物浓度、激活剂浓度等反应条件;③在一定的条件下,将一定的酶液和底物溶液混合均匀,适时记下反应开始的时间;
④反应到一定的时间,取出适量的反应液,运用各种生化检测技术,测定产物的生成量或底物的减少量。
(3)终止酶反应的方法很多,常用的有:
①反应时间一到,立即取出适量反应液,置于沸水浴中,加热使酶失活②加入适宜的酶变性剂,如三氯醋酸等,使酶变性失活③加入酸或碱溶液,使反应液的pH值迅速远离催化反应的最适pH值而使反应终止④将取出的反应液立即置于低温冰箱或冰粒堆中,使反应液的温度迅速降低至10℃以下而终止反应。
9、有两种酶活力的标准单位P17:
开特(kat):
是酶活力的国际单位(SI),它规定在特定的体系下,反应速度为每秒转化1mol底物所需的酶量在两种不同的酶活力单位之间换算:
1Kat=6X107U酶的一个活力单位:
在该酶的最适条件下,在250C,一分钟内催化1mol(微摩尔)底物的酶量。
比活力:
特定条件下,单位重量酶活力:
是指在一定条件下,酶所催化的反应初速度
(mg)蛋白质或RNA所具有的酶活力单位数。
是酶纯度的量度,在酶的纯化过程中它的比活力增高,当酶提纯时,其比活力成为极大和恒定的值。
酶活力(或总活力)涉及在样品中酶的总单位,而比活力是每毫克蛋白质中酶单位的数量(U/mg)
10、测定酶活力的基本要求:
(1)要使反应系统中除待测酶浓度是影响反应速度的唯一限制性因素(反应速度定量酶活力);
(2)其余一切均应最适合于酶发挥作用(表现最大能力);
11、测定条件选择:
(1)底物种类选择:
最适底物
a)对于绝对专一的酶无可选择;若相对专一则选Km最小的底物,即所谓最适底物;一般选工作底物;
b)要求反应前后有可测定的理化性质变化
c)稳定浓度选择:
a)[s]>=100Km;b)有时不宜采用高底物浓度(有毒性、价高、溶解度小、抑制酶反应等)则根据具体条件,通过实验选一适当浓度。
(2)最适pH
a)选择最适pH并维持在这一范围。
b)pH稳定常借助缓冲系统来控制,要求稳定、无干扰、价廉。
c)离子种类和强度。
(3)最适温度
酶反应温度系数为每变化1摄氏度,反应速度相差10%以上。
所以测酶活力时温度保持恒定十分重要,一般应控制在正负1摄氏度以内。
多数哺乳动物的酶,其最适温度为37℃左右,但有些生物机体的酶适应在极端条件下起催化作用,这些酶称极端酶。
(4)样品对某一待测样品测定前,除了上述因素需考虑外,还要确定样品中有无干扰测定结果的因素(与待测酶作用同一底物或生成同一产物的其它酶)。
下面介绍几种常用的测定方法:
化学法:
是取样法的一种,比较古老,但目前仍普遍使用。
一是因为此法不需要特殊仪器,而且几乎所有的酶反应都可以根据产物或底物的化学性质找出具体的有特异性的测定方法。
(工作量大、误差大、不够准确)
光学法:
它是一种连续测定法,是根据底物和产物在某一波长或波段上有明显特征吸收差别而建立起来的方法。
(灵敏度高、快速、简便)。
光学法又可分为三种:
光吸收法;荧光法;旋光测定法。
①光吸收法:
这是几乎所有氧化还原酶都可采用的方法。
许多酶本身不能采用光吸收法,但其产物中有脱氢酶底物,则因此可用酶偶联进行测定。
②荧光法:
其原理是酶反应的底物或产物具有荧光性,用荧光变化速度即可测出反应速度。
荧光法的灵敏度比光吸收法高2-3个数量级,特别适于酶或底物量低的分析。
但荧光法干扰多,需要校正。
③旋光测定法:
某些酶反应过程中常伴随有底物或产物旋光性质变化。
可用自动旋光仪来测定这类酶的反应。
此法准确度、灵敏度不高,不方便,但在没有其它更好的方法时,可考虑采用此法。
电化学法:
也是一类连续测定法,其灵敏度和准确度都很高,可和光学法相比;而且测定系统被污染也不会影响结果,主要用电极进行测定,常用的是离子选择性电极和氧电极。
气体检测法:
主要用于有气体吸收或释放的反应,如氧化酶反应耗气、脱羧酶、脲酶等催化的产气反应。
常用瓦氏呼吸仪测定恒定体积内压力变化。
此法主要缺点是准确度、灵敏度不高,操作麻烦。
放射化学测定法:
测定时用同位素标记底物,在酶反应进行中,导致放射性标记产物定量形成,分离产物与底物,进行产物的放射性测定或未反应底物的放射性测定,这样就可测知反应进行的速度或酶的活性。
酶偶联分析法:
某些酶本身不能应用上述几种方法测定时,则可偶联一个酶反应进行测定。
酶的转换数与催化周期:
酶的转换数(KP),又称摩尔催化活性,是指每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数。
即每摩尔酶每分钟催化底物转化为产物的摩尔数,是酶催化效率的一个指标,一般酶的转换数103min-1
催化周期:
转换数的倒数固定化酶的活力测定:
振荡测定法、酶柱测定法、连续测定法。
固定化酶的概念:
与水不溶性载体结合,在一定的空间范围内起催化作用的酶。
固定化酶的比活力测定:
一般采用每克(g)干固定化酶所具有的酶活力单位数表示。
相对酶活力的测定:
相对酶活力的高低表明了固定化酶应用价值的大小。
(1)酶标免疫分析法:
它是将免疫学方法的抗体、抗原专一且定量结合的特点和酶的高效专一催化特点有机地结合在一起建立的一种高度特异、灵敏的分析方法。
(2)放射免疫分析:
是用放射性同位素标记抗原Ag+,该抗原与未标记抗原Ag竞争结合抗体(Ab)结合位点时的能力相同,所以反应生成的Ag+—Ab复合物与Ag的量呈负相关。
Ag+—Ab的生成量可通过测定其放射活性得到,然后根据已知浓度抗原的标准曲线就可以计算出样品中抗原浓度,这种分析方法称为放射免疫分析。
酶标免疫测定优点:
不需要特殊复杂的设备和仪器;灵敏度高;重复性好;对健康无害(无放射污染)。
(3)酶标免疫测定的几个操作问题:
①酶的要求:
专一性强、活性高;在标记测定储存条件下稳定;
测定方法简单、快速、灵敏;纯度高而价廉易得;
在被测液中无干扰酶活性测定的因素。
②酶的标记
(1)标记方法:
不影响酶活性和免疫活性、操作简便、产量高且稳定;现在最常用的是交联法特别是戊二醛交联法。
(2)标记物纯化:
酶标反应后必须除去未被标记的抗原或抗体以及未被结合的酶。
(3)免疫活性和酶活性测
③免疫原的制备
④特异性抗体制备
⑤抗体固定定
第一篇酶的生产
生产方法
1、提取分离法
2、生物合成法
3、化学合成法
第二章酶生物合成的基本理论——酶的生物合成及其调节
酶的生物合成:
通过细胞的生命活动合成各种酶的过程。
酶有蛋白质类酶(P酶)和核酸类酶(R酶)两大类别,酶的生物合成主要是指细胞内RNA和蛋白质的合成过程。
第1节RNA的生物合成——转录
第2节蛋白质的生物合成——翻译
第3节酶的生物合成的调节
第三章酶的生物合成法生产
第一节产酶细胞的选择
酶生产的细胞必须具备的条件:
1、酶的产量高
2、容易培养和管理
3、产酶稳定性好
4、利于酶的分离纯化
5、安全无毒
1、微生物
基本要求:
1不是致病菌
2发酵周期短,产酶量高
3不易变异退化
4最好是产生胞外酶的菌种,利于分离
5对医药和食品用酶,还应考虑安全性
6由非致病微生物制取的酶,需作短期毒性实验
7非常见微生物制取的酶,需做广泛的毒性实验,包括慢性中毒实验。
第2节培养基的配制
1、培养基的基本成分
1、碳源大多数产酶微生物采用淀粉或其水解产物,如糊精、淀粉水解糖、麦芽糖、葡萄糖等为碳源。
植物细胞以蔗糖为碳源;动物细胞以谷氨酰胺或谷氨酸为碳源。
2、氮源:
有机氮源和无机氮源两大类。
不同的细胞对氮源有不同的要求:
动物细胞要求有机氮源;植物细胞主要使用无机氮源;微生物细胞中,异养型细胞要求有机氮源,自养型细胞采用无机氮源。
在使用无机氮源时要注意铵盐和硝酸盐的比例
碳和氮两者的比例,即碳氮比(C/N),对酶的产量有显著影响。
所谓碳氮比一般是指培养基中碳元素(C)的总量与氮元素(N)总量之比。
2、培养基的设计原则
1、选择适宜的营养物质2、营养物的浓度及配比合适3、物理、化学条件适宜4、经济节约5、精心设计、试验比较
3、植物细胞培养基
1、植物细胞培养基的特点
(1)植物细胞的生长和代谢需要大量的无机盐
(2)植物细胞需要多种维生素和植物生长激素,如硫胺素、吡哆素、烟酸、肌醇、生长素、分裂素等。
(3)植物细胞要求的氮源一般为无机氮源(4)植物细胞一般以蔗糖为碳源
2、常用的植物细胞培养基
MS培养基:
硝酸盐浓度高,广泛应用于植物细胞、组织和原生质体培养
B5培养基:
铵盐浓度低,适于双子叶植物特别是木本植物的组织、细胞培养
White培养基:
无机盐浓度低,适合生根培养
KM-8P培养基:
有机成分种类全面,广泛应用与原生质体的培养
(一)动物细胞培养基的组分1氨基酸:
必需氨基酸、谷氨酰胺、谷氨酸2维生素:
无血清需补充VB、VC3无机盐:
调节渗透压4葡萄糖:
5激素:
胰岛素、生长激素、氢化可的松6生长因子:
无血清需添加适量的表皮生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子
(二)动物细胞培养基的配制
第3节产酶工艺条件及其控制
培养基中溶解氧的量决定于一定条件下氧气的溶解速度氧的溶解速度又称为溶氧速率或溶氧系数,以Kd表示。
溶氧速率是指单位体积的发酵液在单位时间内所溶解的氧的量。
其单位通常以[mmol氧/h·L]表示。
溶氧速率与通气量、氧气分压、气液接触时间、气液接触面积以及培养液的性质等有密切关系。
耗氧速率、细胞浓度的概念
第4节微生物发酵产酶
一、微生物发酵产酶的方式及其特点固体培养发酵液体深层发酵固定化细胞发酵固定化原生质体发酵
2、提高酶产量的措施
1、添加诱导物(诱导物的分类:
酶作用底物型诱导物酶的反应产物酶作用底物类似物作诱导物)酶最有效的诱导物往往不是酶的作用底物,也不是酶的反应产物,而是可以与酶结合又不能被酶催化的底物类似物。
2、控制阻遏物浓度
3、添加表面活性剂表面活性剂分为离子型和非离子型两大类适量的非离子型表面活性剂,如吐温(Tween)、特里顿(Triton)等可以加速胞外酶的分泌,而使酶的产量增加。
离子型表面活性剂对细胞有毒害作用4、添加产酶促进剂
3、酶发酵动力学
(1)酶生物合成的模式;
同步合成型延续合成型中期合成型滞后合成型
中期合成型酶的共同特点是:
酶的生物合成受到产物的反馈阻遏作用或分解代谢物阻遏作用,而且酶所对应的mRNA稳定性差
滞后合成型的酶,之所以要在细胞生长一段时间甚至进入平衡期以后才开始合成,主要原因是由于受到培养基中存在的阻遏物的阻遏作用。
只有随着细胞的生长,阻遏物几乎被细胞用完而使阻遏解除后,酶才开始大量合成。
若培养基中不存在阻遏物,该酶的合成可以转为延续合成型。
该类型酶所对应的mRNA稳定性很好,可以在细胞生长进入平衡期后的相当长的一段时间内,继续进行酶的生物合成。
在酶的发酵生产中,为了提高产酶率和缩短发酵周期,最理想的合成模式应是延续合成型。
对于滞后合成型的酶,要设法降低培养基中阻遏物的浓度,尽量减少甚至解除产物阻遏或分解代谢物阻遏作用,使酶的生物合成提早开始;
对于中期合成型的酶,则要在提高mRNA的稳定性以及解除阻遏两方面下功夫,使其生物合成的开始时间提前,并尽量延迟其生物合成停止的时间。
(2)细胞生长动力学
1950年,法国的莫诺德(Monod)首先提出了表述微生物细胞生长的动力学方程?
莫诺德方程中的μm和KS可以通过双倒数作图法求出?
宏观产酶动力学的研究表明:
产酶速率与细胞比生长速率、细胞浓度以及细胞产酶模式有关。
产酶动力学模型或称为产酶动力学方程可以表达为?
(1)固定化细胞发酵产酶的特点
(1)提高产酶率
(2)可以反复使用或连续使用较长时间
(3)发酵稳定性好,对温度、pH的适应范围扩大,基因工程菌的质粒稳定,不易丢失
(4)缩短发酵周期,提高设备利用率
(5)产品易于分离纯化
(6)只适用于胞外酶等胞外产物的生产
固定化原生质体的特点
(1)变胞内产物为胞外产物
(2)提高酶产率
(3)稳定性较好
(4)易于分离纯化
固定化原生质体发酵产酶在工艺条件控制方面需要注意下列问题:
(1)渗透压的控制
(2)防止细胞壁再生
(3)保证原生质体的浓度
第五节植物细胞培养产酶
1、植物细胞的特性
与微生物相比:
细胞大;生长速率、代谢速率低,倍增时间、生产周期长;营养要求简单;大多数植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的光照强度和光照时间;对剪切力敏感;主要目的产物为色素、药物、香精和酶
第6节动物细胞培养产酶
动物细胞主要用于生产疫苗、激素、多肽生长因子、酶:
胶原酶、尿激酶等
单克隆抗体、非抗体免疫调节剂
1、动物细胞的特性
没有细胞壁;适应环境的能力差,脆弱细胞大;以集群形式存在,细胞培养中大部分细胞具有群体效应、锚地依赖性、接触抑制性、功能全能性;营养要求复杂。
第4章酶的提取与分离纯化
第一节细胞破碎
1、机械破碎法
2、物理破碎法
(1、温度差破碎法:
热胀冷缩2、压力差破碎法:
高压冲击法突然降压法渗透压变化法超声波破碎法)
3、化学破碎法(有机溶剂表面活性剂)
4、酶促破碎法
自溶法
溶菌酶、β-葡聚糖酶、几丁质酶、纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶等
第二节提取
酶的提取是指在一定的条件下,用适当的溶剂或溶液处理含酶原料,使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。
也称为酶的抽提。
酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质,选择适当的溶剂。
一般说来,极性物质易溶于极性溶剂中,非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中,酸性物质易溶于碱性溶剂中,碱性物质易溶于酸性溶剂中。
酶都能溶解于水,通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取,有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团,则可用有机溶剂提取。
影响酶提取的主要因素
主要影响因素是酶在所使用的溶剂中的溶解度以及酶向溶剂相中扩散的速度。
此外,还受到温度、pH值、提取液体积等提取条件的影响
第3节沉淀分离
沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质,使酶的溶解度降低,而从溶液中沉淀析出,与其它溶质分离的技术过程沉淀分离的方法主要有:
盐析沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法、选择性变性沉淀法等
1、盐析沉淀法
盐析沉淀法简称盐析法,是利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性,通过在酶液中添加一定浓度的中性盐,使酶或杂质从溶液中析出沉淀,从而使酶与杂质分离的过程一般在低盐浓度的情况下,蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加,这种现象称为盐溶。
而在盐浓度升高到一定浓度后,蛋白质的溶解度又随盐浓度的升高而降低,结果使蛋白质沉淀析出,这种现象称为盐析
盐之所以会改变蛋白质的溶解度,是由于盐在溶液中离解为正离子和负离子。
由于反离子作用,使蛋白质分子表面的电荷改变,同时由于离子的存在改变了溶液中水的活度,使分子表面的水化膜改变
饱和度是指溶液中加入的饱和硫酸铵的体积与混合溶液总体积之比值饱和硫酸铵的配制方法:
过量硫酸铵——50~60℃保温——趁热过滤——0或25℃平衡1~2天——有固体析出即为饱和硫酸铵溶液
2、离心方法的选择
对于超速离心,可以根据需要采用差速离心、密度梯度离心或等密梯度离心等方法。
1、差速离心:
差速离心是指采用不同的离心速度和离心时间,使不同沉降速度的颗粒分批分离的方法。
2、密度梯度离心
样品在密度梯度介质中进行离心,使沉降系数比较接近的物质分离的一种区带分离方法。
3、等密梯度离心
当欲分离的不同颗粒的密度范围处于离心介质的密度范围内时,在离心力的作用下,不同浮力密度的颗粒或向下沉降,或向上飘浮,只要时间足够长,就可以一直移动到与它们各自的浮力密度恰好相等的位置(等密度点),形成区带。
这种方法称为等密梯度离心,或称为平衡等密度离心。
等密梯度离心常用的离心介质是铯盐,离心条件:
离心机、离心方法、离心介质、密度梯度、离心力(或离心速度)和离心时间
第5节过滤与膜分离
过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。
根据过滤介质的不同,过滤可以分为膜过滤和非膜过滤两大类。
根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同,过滤可以分为粗滤、微滤、超滤和反渗透等4大类
第6节层析分离
层析分离是利用混合液中各组分的物理化学性质(分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等)的不同,使各组分以不同比例分布在两相(固定相、流动相)中。
当流动相流经固定相时,各组分以不同的速度移动,从而使不同的组分分离纯化。
分离纯化酶常采用:
吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析等
1、吸附层析
1、吸附层析原理:
任何两个相之间都可以形成一个界面,其中一个相中的物质在两相界面上的密集现象称为吸附。
凡是能够将其它物质聚集到自己表面上的物质称为吸附剂。
吸附剂一般是固体或者液体,在吸附层析中通常应用的是固体吸附剂。
能聚集于吸附剂表面的物质称为被吸附物。
吸附剂与被吸附物之间的相互作用力主要是范德华力。
其特点是可逆的。
吸附层析通常采用柱型装置,先装柱、加液,而后洗脱在洗脱时,层析柱内不断发生解吸、吸附、再解吸、再吸附的过程。
适当时间后,不同物质在吸附柱内形成各自的区带
2、洗脱方法
三种方法:
溶剂洗脱法、置换洗脱法、前缘洗脱法
3、吸附剂与洗脱剂的选择
①吸附剂的选择:
吸附层析的关键因素极性物质容易被极性表面吸附;非极性物质容易被非极性表面吸附;溶解度越大的物质越难被吸附。
吸附剂可分为无机吸附剂和有机吸附剂。
吸附剂通常由一些化学性质不活泼的多孔材料制成,比表面积很大
②洗脱剂的选择:
要根据吸附剂的性质和被吸附物的特点来选择合适的洗脱剂。
对于极性组分,用极性大的溶剂洗脱效果较好。
而对于非极性组分,则用非极性溶剂洗脱较佳。
洗脱剂的种类有:
饱和烃、醇、酮、酚、醚、卤代烷、水等。
洗脱剂的选择要注意下列各点:
洗脱剂不会与吸附剂起化学反应,也不会使吸附剂溶解。
洗脱剂对混合液中的各组分的溶解度大,粘度小,流动性好,容易与被洗脱的组分分离。
洗脱剂要求一定的纯度,以免杂质对分离带来不利影响
2、分配层析
分配层析是利用各组分在两相中的分配系数不同,而使各组分分离的方法。
分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时,该溶质在两项溶剂中的浓度的比值。
在层析条件确定后,分配系数是一常数,以K表示。
3、离子交换层析
离子交换层析是利用离子交换剂上的可解离基团(活性基团)对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。
按活性基团的性质不同,离子交换剂可以分为阳离子交换剂和阴离子交换剂由于酶分子具有两性性质,所以可用阳离子交换剂,也可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。
在溶液的pH值大于酶的等电点时,酶分子带负电荷,可用阴离子交换剂(引入碱性基团)进行层析分离;
4、凝胶层析
又称为凝胶过滤,分子排阻层析,分子筛层析等。
是指以各种多孔凝胶为固定相,利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术
1、凝胶层析的基本原理凝胶层析柱中装有多孔凝胶,当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时,大分子物质以较快的速度流过凝胶柱。
而小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢,从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱,而达到分离的目的
凝胶层析的操作一般包括装柱、上柱、洗脱等过程
5、亲和层析原理
6、层析聚焦原理
(1)电场强度是指每厘米距离的电压降。
(2)溶液的pH值
(3)溶液的离子强度
(4)电渗
第7节电泳分离
电泳:
是指带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的现象。
利用电泳现象将多组分物质分离、分析的技术叫做电泳技术。
电泳的基本原理:
不同的物质,由于其带电性质、颗粒形状和大小不同,因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同,因此可使它们分离。
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