实时荧光定量pcr实验报告.docx
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实时荧光定量pcr实验报告
实时荧光定量pcr实验报告
篇一:
实时荧光定量PCR方法简介
实时荧光定量PCR方法简介
一.实时荧光定量PCR的基本原理
理论上,PCR过程是按照2n(n代表PCR循环的次数)指数的方式进行模板的扩增。
但在实际的PCR反应过程中,随着反应的进行由于体系中各成分的消耗(主要是由于聚合酶活力的衰减)使得靶序列并非按指数方式扩增,而是按线性的方式增长进入平台期。
因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性。
如采用常规的终点检测法(利用EB染色来判断扩增产物的多少,从而间接的判断起始拷贝量),即使起始模板量相同经PCR扩增、EB染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。
为了能准确判断样品中某基因转录产物(mRNA)的起始拷贝数,实时荧光定量PCR采用新的参数——Ct值,定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。
Ct值是如何得到的
在实时荧光定量PCR的过程中,靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行,定量PCR仪全程采集荧光信号,实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。
Ct值的定义
Ct值中的“C”代表Cycle(循环),“t”代表检测threshhold(阈值),其含义是PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数;也可以理解为扩增曲线与阈值线交点所对
应的横坐标。
Ct值与样品中模板的对应关系
Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系(y=ax+b,x代表起始模板拷贝数的对数,y代表Ct值)。
与终点法相比利用Ct值的优势
由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数,该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响,因此利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确,重复性也更好。
传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判断扩增产物的多少,从而间接的判断起始拷贝量,这种方法的精确度不高、重复性也不好。
下图中是96个复孔的实时扩增曲线(完全相同的反应体系、相同的反应protocol、相同的样品起始浓度),可以看到Ct值具有很好的重复性,而终点的荧光信号强度差异达到300个单位。
此外,采用实时荧光定量PCR还能从方法学上有效的防止PCR实验中交叉污染的问题。
因为荧光定量PCR中模板的扩增与检测是同时进行的,当实验完成后即可获得定量结果,
直接丢弃含有大量扩增产物的反应管,彻底避免了传统方法中取出扩增产物进行电泳鉴定时扩增产物对实验室造成二次污染的可能性。
二.荧光定量PCR的2类方法(按荧光产生的原理分类)染料法(SYBRGreen法)
染料法即利用SYBRGreen分子产生的荧光信号来进行样品定量。
该方法与常规的PCR类似,唯一的区别是在反应体系中加入了SYBRGreen染料分子。
该染料分子的激发波长为497nm,发射波长为520nm。
与EB的性能类似,SYBRGreen也是一种扁平状的分子,处于游离状态时具有很低的荧光本底,当反应体系中存在dsDNA时,SYBRGreen能特异性的与之结合并在497nm激发下。
染料法的优点:
1,无需设计、合成探针,实验成本低;2,使用方便,与常规PCR的操作几乎相同。
染料法的缺点:
1,由于SYBRGreen与dsDNA的结合只具有结构特异性而不具有序列特异性,除了与特异性的靶序列扩增产物结合外,还能与在PCR扩增过程中形成的引物二聚体、非特异性扩增产物结合,从而造成扩增效率的降低、结果的不准确。
因此采用该方法对于引物的设计及实验条件的优化要求很高,确保反应过程中没有非特异性产物的扩增;2,由于SYBRGreen的上述特点,该方法不能应用于MultiplexQPCR技术。
(在一个反应管中同时检测多个目的基因的表达情况)
探针法(以TaqMan探针为例)
探针法荧光定量PCR与常规PCR的不同之处在于:
在上、下游引物外还加入了具有序列特异性的探针(探针本身具有荧光标记),该探针根据需要扩增的靶序列设计因此只能与待检测序列结合,与染料法相比提高了实验的特异性。
目前市场上的探针主要种类有:
TaqMan、MolecularBeacon、Scorpions、Hybirdization等,其中以TaqMan探针应用最广泛。
TaqMan探针的结构:
长度与普通PCR引物类似,大约20bp左右。
在5’与3’端各标记有一个荧光基团,5’的荧光基团称为报告基团(Report),3’的荧光基团称为淬灭基团(Quencher)。
TaqMan探针的性能:
在探针结构完整的情况下用特定的波长激发报告基团,由于报告基团与淬灭基团的空间位置很近,因此报告基团能够通过FRET(FluorescenceResonanceEnergyTransfer)将接受的能量转移到淬灭基团,使后者以发射荧光或热量的方式释放能量,而报告基团并不发射特定波长的荧光信号。
TaqMan探针法工作原理:
?
变性(95°C):
模板dsDNA充分解链;
?
复性、延伸、酶切降解(60°C):
1,探针与靶序列结合;上、下游引物与靶序列结合;
3,上、下游引物在Taq酶的作用下合成互补链(5’→3’聚合功能);4,当上游引物延伸到TaqMan探针的5’端时,延伸不能继续,此时Taq酶发挥5’→3’外切功能将探针逐一水解并继续向前延伸直至完成互补链的合成;
?
荧光信号的检测:
由于TaqMan探针被水解,报告基团在受到激发后不能再通过FRET作
用将接受的能量转移给淬灭基团,因此可以检测到报告基团特定波长的荧光信号,起始模板浓度越高荧光信号越强。
与染料法相比TaqMan探针法的优点:
1,实验的特异性得到了提高;2,对探针的5’端采用不同的荧光标记就可以进行MultiplexQPCR。
与染料法相比TaqM
an探针法的缺点:
1,探针的使用提高了实验成本;2,探针的使用需要设计及优化。
三.确定样品起始模板拷贝数的2类方法
绝对定量
采用绝对定量的方法需要使用标准品(已知起始拷贝数的样品)建立标准曲线,建立Ct值与样品起始模板拷贝数的对数之间的线性关系,从而通过实验后样品的Ct值得出起始模板量。
标准品的种类:
含目的基因的质粒(经酶切线性化处理,其中的插入片段必须采用与QPCR实验中相同的引物扩增得到)、PCR扩增产物(经纯化,必须采用与QPCR实验中相同的引物扩增得到)、化学合成的寡聚核苷酸、cDNA、gDNA等,前2种标准品使用较为广泛。
标准品的定量:
UVA260、荧光分光光度检测等。
为了使实验最终得到的Ct值之间具有可比性,必须进行归一化的处理:
1,对各样品进行
细胞计数,使各样品的起始细胞数一致(可操作性不强,尤其是针对组织、肿瘤等样品);2,对纯化后得到的总RNA进行定量,使各样品进行RT-PCR时加入的RNA用量一致。
相对定量
与绝对定量不同,相对定量不关心每个样品中目的基因表达产物(mRNA)的具体拷贝数,而关注目的基因在不同的细胞类型、不同的发育周期等条件下不同的转录效率,即基因的差异化表达。
就研究目的而论,该方法比绝对定量的应用范围更广泛、更符合研究的目的。
某目的基因在样品与对照品间表达差异倍数的计算公式如下:
公式说明:
Rel.Quantity:
目的基因在样品与对照品间表达差异的倍数;
GOI:
目的基因(GeneofInterest);
Norm:
内参基因(ReferenceGene,Normalizer,HouseKeepingGene)
Eff:
PCR扩增效率,分子部分为目的基因扩增效率,分母部分为内参基因的扩增效率;使用该公式时,需要通过实验分别确定目的基因与内参基因的扩增效率然后代入公式进行计算;如果目的基因与内参基因的扩增效率都接近于100%且相差小于5%,也可将PCR扩增效率默认为100%,这样公式就简化为2-ΔΔCt。
?
为什么需要设立内参基因?
如果仅仅比较目的基因的ΔCt是不能准确反映样品间目的基因的表达差异的,最主要是受到3个变量的影响:
1,样品处理时不同的纯化得率;2,RT-PCR过程中不同的逆转录效率;3,QPCR反应体系中不同的cDNA加入量。
由于上述3个变量在样品间都很难控制在相同的水平上,因此需要引入内参基因来矫正上述变量进行归一化处理,使得所有样品目的基因表达水平的比较是在相同的水平上进行的,这样得出的结果才具有可信性与良好的重复性。
(注意:
内参基因的(1+EffΔCt)位于分母的位置,进行除法的运算。
)
?
如何选择内参基因?
符合什么标准的基因可以作为内参基因?
由于上述内参基因的用途,因此内参基因的选择必须满足以下3个条件:
1,在不同的细胞、组织中具有恒定的表达;2,在不同的细胞周期、发育周期中具有恒定的表达;3,在不同的实验状态下具有恒定的表达。
内参基因的ΔCt一般小于2(即小于1倍的表达差异),一般采用的内参基因都是一些管家基因,使用最多的为:
?
-actin、GAPDH、18sRNA等。
需要注意的是:
并非传统意义上的管家基因都能作为内参基因,还是需要与具体的实验结合起来综合考虑。
例如GAPDH在II型糖尿病病人中就明显的高表达,不能作为内参基因。
因此在选择内参基因时建议:
1,查阅相关文献;2,设立多个内参基因;3,采用表达谱的方法确定理想的内参基因。
?
采用Singleplex还是Multiplex?
篇二:
实时荧光定量PCR具体实验步骤
以下实验步骤仅供参考:
1样品RNA的抽提
①取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿,盖紧管盖。
手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育2到3分钟。
4℃下1XXrpm离心15分钟。
离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上层。
RNA全部被分配于水相中。
水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。
加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30℃孵育10分钟后,于4℃下1XXrpm离心10分钟。
此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗移去上清液,每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。
混匀后,4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时,先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
2RNA质量检测
1)紫外吸收法测定
先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。
然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:
100)后,读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,测定RNA溶液浓度和纯度。
①浓度测定
A260下读值为1表示40μgRNA/ml。
样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为:
A260×稀释倍数×40μg/ml。
具体计算如下:
RNA溶于40μlDEPC水中,取5ul,1:
100稀释至495μl的TE中,测得A260=0.21
RNA浓度=0.21×100×40μg/ml=840μg/ml或0.84μg/μl
取5ul用来测量以后,剩余样品RNA为35μl,剩余RNA总量为:
35μl×0.84μg/μl=29.4μg
②纯度检测
RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度,比值范围1.8到2.1。
2)变性琼脂糖凝胶电泳测定
①制胶
1g琼脂糖溶于72ml水中,冷却至60℃,10ml的10×MOPS电泳缓冲液和18ml的37%甲醛溶液(12.3M)。
10×MOPS电泳缓冲液
浓度成分
0.4MMOPS,pH7.0
0.1M乙酸钠
0.01MEDTA
灌制凝胶板,预留加样孔至少可以加入25μl溶液。
胶凝后取下梳子,将凝胶板
放入电泳槽内,加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
②准备RNA样品
取3μgRNA,加3倍体积的甲醛上样染液,加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10μg/ml。
加热至70℃孵育15分钟使样品变性。
③电泳
上样前凝胶须预电泳5min,随后将样品加入上样孔。
5–6V/cm电压下2h,电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。
④紫外透射光下观察并拍照
28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型),上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。
还有可能观察到一个更小稍微扩散的带,它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖体RNA)组成。
在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质,可能是由mRNA和其它异型RNA组成。
RNA制备过程中如果出现DNA污染,将会在28S核糖体RNA带的上面出现,即更高分子量的弥散迁移物质或者带,RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。
用数码照相机拍下电泳结果。
3样品cDNA合成
①反应体系
序号反应物剂量
1逆转录buffer2μl
2上游引物0.2μl
3下游引物0.2μl
4dNTP0.1μl
5逆转录酶MMLV0.5μl
6DEPC水5μl
7RNA模版2μl
8总体积10μl
轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。
②混合液在加入逆转录酶MMLV之前先70℃干浴3分钟,取出后立即冰水浴至管内外温度一致,然后加逆转录酶0.5μl,37℃水浴60分钟。
③取出后立即95℃干浴3分钟,得到逆转录终溶液即为cDNA溶液,保存于-80℃待用。
4梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因(β-actin)实时定量PCR
①β-actin阳性模板的标准梯度制备阳性模板的浓度为1011,反应前取3μl按10倍稀释(加水27μl并充分混匀)为1010,依次稀释至109、108、107、106、105、104,以备用。
②反应体系如下:
标准品反应体系
序号反应物剂量
1SYBRGreen1染料10μl
2阳性模板上游引物F0.5μl
3阳性模板下游引物R0.5μl
4dNTP0.5μl
5Taq酶1μl
6阳性模板DNA5μl
7ddH2O32.5μl
8总体积50μl
轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。
管家基因反应体系:
序号反应物剂量
1SYBRGreen1染料10μl
2内参照上游引物F0.5μl
3内参照下游引物R0.5μl
4dNTP0.5μl
5Taq酶1μl
6待测样品cDNA5μl
7ddH2O32.5μl
8总体积50μl
轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。
③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机,反应条件为:
93℃2分钟,然后93℃1分钟,55℃2分钟,共40个循环。
5制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板
①针对每一需要测量的基因,选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。
反应体系:
序号反应物剂量
110×PCR缓冲液2.5ul
2MgCl2溶液1.5ul
3上游引物F0.5ul
4下游引物R0.5ul
5dNTP混合液3ul
6Taq聚合酶1ul
7cDNA1ul
8加水至总体积为25ul
轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。
35个PCR循环(94℃1分钟;55℃1分钟;72℃1分钟);72oC延伸5分钟。
②PCR产物与DNALadder在2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
③将PCR产物进行10倍梯度稀释:
将PCR产物进行10倍梯度稀释:
设定PCR产物浓度为1×1010,依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。
6待测样品的待测基因实时定量PCR
①所有cDNA样品分别配置实时定量PCR反应体系。
体系配置如下:
序号反应物剂量
1SYBRGreen1染料10ul
2上游引物1ul
3下游引物1ul
4dNTP1ul
5Taq聚合酶2ul
6待测样品cDNA5ul
7ddH2O30ul
8总体积50ul
轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。
②将配制好的PCR反应溶液置于RealtimePCR仪上进行PCR扩增反应。
反应条件为:
93℃2分钟预变性,然后按93℃1分钟,55℃1分钟,72℃1分钟,共40做个循环,最后72℃7分钟延伸。
7实时定量PCR使用引物列表
引物设计软件:
PrimerPremier5.0,并遵循以下原则:
引物与模板的序列紧密互补;引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构;引物不在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。
8电泳
各样品的目的基因和管家基因分别进行RealtimePCR反应。
PCR产物与DNALadder在2%琼脂糖凝胶电泳,GoldView?
染色,检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
篇三:
生物实验4实时定量PCR实验报告
实验四定量PCR扩增
姓名:
李宗翰专业:
环境工程学号:
1432999同组人姓名:
刘雪飞
一、实验目的
复习定量PCR原理,熟悉绝对定量的操作流程
二、实验原理
实时荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积
实时监测整PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
在
PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,通过
Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析
三、实验仪器及材料
realtimePCR仪(ABI7500,RotorGene3000),微量移液器,Tip头,0.2ml光学薄
壁管,8联PCR管,1.5ml离心管,SYBRMix,引物及108copy/ul标准品
四、实验步骤
1、标准样品稀释:
取4个1.5ml的离心管,写上标记107,106,105,104,向每
管加入90μlddH2O,取10μl108copy/ul的标样加入到107管中,充分混匀
后,从管中取10μl107copy/ul的液体到106管中。
按上述操作依次稀释,得到
5个倍数的标准样品。
注意,每次稀释都要换Tip头。
2、配制预混液:
取119μlddH2O、7μl引物4204f、7μl引物4448r和7μlRox
到装有175μlSYBRMix液的1.5ml离心管中,混匀。
3、分装预混液:
取7个小离心管,分别标记108、107、106、105、104、UNK
(未知样)、NTC(阴性对照)。
向其中分别加入42μl预混液和4.7μl模板(1-5
号加标样、6号加未知样、7号加等量ddH2O),混匀。
4、戴上手套取两个8联管,并排放置管架上。
分别取上述样品20μl至第1-7
管中(第8管空出),每个样品两个重复,共14个样品。
将加好样的8联管振荡。
5、设置分析仪参数如下:
95℃3min;95℃15s+60℃40s为一个循环,循环次
数40,融解曲线温度范围60~95℃。
振荡好的样品进机进行PCR扩增。
6、扩增后利用软件分析CT值及未知样的定量结果。
五、实验结果与讨论
1、实验结果如何?
试分析。
答:
实验结果及分析如下。
(1)、实验具体数据见下表
Quantity
WellTaskCтCтMeanCтSDQuantityMeanQuantitySDCtThresholdA1STANDARD8.24888.25270.00550
A2STANDARD8.25658.25270.00550
B1STANDARD11.389311.65980.3825
B2STANDARD11.930311.65980.3825
C1STANDARD15.329214.96680.51261000000
C2STANDARD14.604314.96680.51261000000
D1STANDARD19.491219.30800.2590100000
D2STANDARD19.124919.30800.2590100000
E1STANDARD22.538522.41960.168110000
E2STANDARD22.300722.41960.168110000
F1UNKNOWN8.93708.96910.04541695285.625
F2UNKNOWN9.00128.96910.04541695285.625
G1NTC32.5329
G2NTC32.9549
其中,A-E为标准样品,F为位置样品,G为阴性对照。
每个样品做两个平行。
通过软件分析,由标准曲线得到的未知样品的定量结果约为5.83×107。
(2)、扩增曲线
从扩增曲线中可以看出,样品均经历了良好的扩增过程。
0.07120.07120.07120.07120.07120.07120.07120.07120.07120.07120.07120.07120.07120.0712
(3)、标准曲线
从标准曲线中可以看出,R2值较好,标准曲线可以使用。
但扩增效率一般。
其中106和107的两个平行样的CT偏差较大,这一现象可以从
(1)表中看出,其SD分别为0.5126和0.3825,相比其他点较大,一般认为SD大于0.5不理想。
(4)、融解曲线
图中,可以看出每条曲线均为单峰且在一个合理的温度范围内(82~86℃),所以扩增是正常的,不存在非特异性扩增。
2、实验过程中需要注意些什么细节?
答:
(1)、操作过程中尽量不要说话,以避免污染;
(2)、用微量移液器加样品时应保证枪头深入液面以下,这样样品不会留在管壁上;
(3)、不能在定量PCR管做标记,裸手不可以接触定量PCR管,操作时应戴手套。
(4)、8联定量PCR管加完样后,可先将盖子放上,等放到振荡机上再把盖子盖紧。
3、通过这个实验你有什么收获?
这个实验对你今后开展相关实验研究是否有帮助?
答:
通过实验我加深了对定量PCR的理论认识,熟悉了实
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