产碱性蛋白酶菌种的选育与诱变.docx
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产碱性蛋白酶菌种的选育与诱变
碱性蛋白酶产生菌的筛选和紫外诱变育种
(福建师范大学生命科学学院2010级生物工程第七组)
摘要:
目的:
筛选洗涤用碱性蛋白酶产生菌,为酶的分子改造和特效洗涤剂的制造提供材料基础。
方法:
通过在富含蛋白的场所针对性采样,菌落平板筛选,发酵后离心,取上清液加于打孔平板培养基上,测其水解圈大小,并通过紫外诱变提高产碱性蛋白酶菌株的产酶能力。
结果:
从4份土样中筛选出了2个出发菌株进行紫外诱变,取得了较为明显的成效。
结论:
成功筛选出了3株产量更高的菌株。
关键词:
筛选、碱性蛋白酶、水解圈、紫外诱变
蛋白酶是一种重要的工业化应用的酶制剂,占酶制剂市场的65%以上,广泛用于洗涤剂、制革、银回收、医药、食品加工、饲料、化学工业、废物处理等行业。
按最适反应pH分,蛋白酶可分为碱性,中性蛋白酶和酸性蛋白酶。
碱性蛋白酶的最适反应pH一般大于9.0,是当前市场上最为广泛使用的蛋白酶。
微生物来源的碱性蛋白酶适于工业化生产,由于具有培养简便、产量丰富等特点而得以广泛应用。
近三十年来,人们对微生物碱性蛋白酶的研究越来越深人,高产工程菌的选育以及对碱性蛋白酶的纯化、结构和性质研究又为大规模工业化生产及应用提供了坚实的基础。
本实验首先从福建师范大学各个餐饮点周边的土壤中筛选产碱性蛋白酶的菌株,在此基础上通过复筛挑出其中产酶量较大的菌株,并通过紫外诱变提高菌株的产酶能力,以期获得产酶能力较强的工程菌。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验材料
土壤样品采集于福师大各食堂垃圾堆等富含蛋白质的场所。
1.1.2试剂
纯牛奶、琼脂粉、酵母膏、蛋白胨、美兰等化学试剂。
1.1.3仪器
恒温水浴锅HH—4、冷冻高速离心机PC—6PLUS、紫外诱变箱、SHK—99—Ⅱ型台式恒温摇床、HRSP—H系列生化培养箱、不锈钢手提式灭菌器DSX——280B型、磁力搅拌器。
1.1.4培养基
牛奶琼脂固体培养基:
牛肉膏0.3%、蛋白胨1.0%、氯化钠1.0%、琼脂粉1.5~2.0%、纯牛奶1.0%、pH7.0~7.5。
LB斜面培养基:
蛋白胨1%、酵母膏0.5%、琼脂粉1.5~2.0%、氯化钠1.0%、pH7.0~7.5。
LB液体培养基:
蛋白胨1%、酵母膏0.5%、氯化钠1.0%、pH7.0~7.5。
碱性牛奶琼脂培养基(测酶活用):
琼脂粉1.5~2.0%、纯牛奶1.0%、pH9。
1.2方法
1.2.1产酶菌株的分离
取混合土样1g加入到装有99mL无菌水的锥形瓶中,并加入8颗玻璃珠,室温下震荡30min,静置,取其上层菌悬液于60℃水浴5min。
冷却后,进行10倍系列梯度稀释至10-5~10-7。
吸取0.1mL以上四个稀释度菌液,用无菌涂布棒均匀涂布于牛奶琼脂培养基上,在平板上做好标记,37℃恒温培养16~24h。
挑取具有蛋白水解圈的菌落于另一个平板上划线纯化,经斜面培养后于4℃冰箱中保存。
1.2.2产酶菌株的筛选
通过菌落形态和革兰氏染色的结果,筛选出地衣芽孢杆菌的菌株。
将得到的菌株分别在平板上划线,37℃倒置培养16~24h。
选择水解圈直径较大的菌落,接种于斜面培养后于4℃冰箱中重新保种,作为进一步复筛的出发菌株。
1.2.3产酶菌株的复筛
用接种环各取一环于2mL液体培养基中,于37℃、200r/min的摇床中培养30h。
取1mL至EP管中4℃、5000r/min离心10min。
取上清液,用牛奶琼脂培养基进一步确定不同菌株
水解蛋白质能力的大小,筛选出产酶活力最高的菌株,斜面保种。
1.2.4高产菌株的紫外诱变
1.2.4.1诱变菌悬液的制备
将出发菌株接入液体培养基中,37℃、200r/min振荡培养过夜后,离心,弃上清,用无菌生理盐水洗涤沉淀,再离心,弃上清,重复上述步骤三次。
最后加入5mL生理盐水恢复成菌悬液,用血球计数板在显微镜下直接计数,逐步添加生理盐水将菌浓度调至108/mL。
取诱变前的0.5mL菌悬液进行10-1~10-7稀释,取10-5、10-6、10-7三个稀释度菌液各100μL涂布于平板上,37℃倒置培养24h,以备平板菌落计数,作为诱变对照组。
1.2.4.2紫外诱变
打开紫外灯,预热20min。
分别取4mL加入到3个带有回形针的小平皿中,并先后置于磁力搅拌器上准备诱变,调整磁力搅拌器的高度使平皿距离紫外灯管约20cm。
轻轻摇匀后,打开皿盖分别处理60s、90s、120s。
待诱变结束后在仅有红光的暗室下各取0.5mL进行梯度浓度稀释,然后取10-5、10-6、10-7三个稀释度菌液100μL于平板上涂布,共涂9个平板,作为实验组。
结束后用黑色包装袋包好37℃倒置培养(避光培养)。
当菌落长至合适大小后进行平板菌落计数。
1.2.5菌株致死率的计算与蛋白酶活性的平板检测
1.2.5.1菌株致死率的计算
致死率=(对照组菌落数-实验组菌落数)/对照组菌落数*100%
1.2.5.2蛋白酶活性的平板检测
挑取水解圈较大的菌株进行斜面保种,同时于LB液体培养基进行发酵培养6-12h后,再取其培养液10%再于LB液体培养基进行发酵培养24h。
各取1mL发酵液离心,取上清,点于1%牛奶平板上,放置24h后观察水解圈的大小,并测量其直径大小。
2结果与分析
2.1菌株镜检结果
图1菌株革兰氏染色镜检图
图中菌体呈杆状,清晰可见孢子的存在,并结合其菌落形态,可以判定其为地衣芽孢杆菌。
2.2诱变后菌株生长情况
图310-690s的菌落生长情况
图210-590s的菌落生长情况
图5对照组与实验组生长情况对照图
图410-790s的菌落生长情况
以上三幅图是菌体诱变90s,培养后得到的菌落的生长情况。
图2表示的是细菌液是10-5;图3的菌液浓度为10-6;图4的菌液浓度为10-7;图5为对照组与实验组菌落的生长趋势对比图
2.3致死率的计算
项目
时长
对照组
60s
90s
10-5
5000
1080
400
10-6
4200
860
62
10-7
2400
160
32
表1诱变后菌株的存活数(注:
120s组实验染菌严重,已剔除)
由表中数据计算可得:
紫外照射60s的致死率:
浓度10-5:
78.4%
浓度10-6:
79.5%
浓度10-7:
93.3%
紫外照射90s的致死率:
浓度10-5:
92.0%
浓度10-6:
98.5%
浓度10-7:
98.7%
作图得:
图6致死率与菌液浓度、照射时长的关系
由图可得诱变的的菌液浓度以10-7为宜,照射时长以90s为宜。
2.4诱变后各菌株酶活的平板检测结果
时长
项目
出发菌株
60s
90s
120s
10-5/cm
1.05
1.00
1.05
1.05
10-6/cm
0.95
1.30
1.35
1.05
10-7/cm
1.10
1.50
1.60
1.30
表2诱变后各菌株酶活平板测定结果
作图得
图7量度酶活的直径与菌液浓度、照射时长的关系
由图可得诱变的的菌液浓度以10-7为宜,照射时长以90s为宜。
2.5致死率与酶活分析
由致死率分析得:
在菌液浓度为10-7,照射时长为90s时,致死率达到最高,故诱变的的菌液浓度以10-7为宜,照射时长以90s为宜。
由酶活分析得:
诱变后的酶活多数比诱变前的酶活高,且在菌液浓度为10-7,照射时长为90s时,量度酶活的直径达到最大,故诱变的菌液浓度以10-7为宜,照射时长以90s为宜。
综上分析得:
诱变的菌液浓度以10-7为宜,照射时长以90s为宜。
3讨论
国内外研究碱性蛋白酶产生菌株筛选的报道较多,但少有能运用于工业化生产的高产菌株,这严重的限制了碱性蛋白酶作为高效去污剂的推广。
针对这一点,本实验小组在偏碱且富含蛋白质的地方如食堂垃圾堆旁取得土样,以提高筛选出产碱性蛋白酶菌株的机率。
并通过加热富集芽孢杆菌,平板培养后镜检,并结合其菌落形态,确认其地衣芽孢杆菌。
而后通过紫外诱变获得了更为高产的菌株。
实验最终得以完成,并筛选出了3株酶活较高的菌株,但在实验的开展过程中存在着诸多问题,比如对实验流程不熟悉、实验操作不规范等。
鉴于该实验本身就是为了提供小组成员一个实践的机会,所以基本的错误就不再赘述。
4参考文献
[1]邓菊云.微生物碱性蛋白酶研究进展[J].现代食品科技,2008.
[2]谢承佳,王雪.微生物碱性蛋白酶的性质研究进展[J].黑龙江科技信息,2009,(34):
70-71.
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- 碱性 蛋白酶 菌种 选育 诱变
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