显齿蛇葡萄叶中二氢杨梅素的制备及其脂溶性修饰研究.docx
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显齿蛇葡萄叶中二氢杨梅素的制备及其脂溶性修饰研究
单位代码分类号
申请号密级
论文题目:
显齿蛇葡萄叶中二氢杨梅素的制备及其脂溶性修饰研究二0一二届姓名:
陈晓静
硕士学位论文
显齿蛇葡萄叶中二氢杨梅素的制备
及其脂溶性修饰研究
学科、专业:
食品科学与工程
研究方向:
农产品加工及贮藏工程
作者姓名:
导师姓名、职称:
2012年6月
PreperationofDihydromyrieetininAmpelopsisGrossedentataandMaxam-GilbertofFatSolution
ADissertationSubmitted
inPartialFulfillmentoftheRequirements
fortheDegreeofMasterofAgronomy
Candidate:
ChenXiaojing
Supervisor:
Prof.ZhaoRuixiang
HenanInstituteofScienceandTechnology
June,2012
独创性声明
本人郑重声明:
所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的成果。
除文中特别加以标注和致谢的地方外,文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果,也不包括为河南科技学院或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料,对本文的研究作出重要贡献的个人和集体,均已在文中做了明确的说明,并表示了谢意。
本声明的法律责任由本人承担。
论文作者签名:
导师签名:
日期:
年月日日期:
年月日
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本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时,第一署名单位仍然为河南科技学院。
注:
保密论文在解密后应遵守此规定。
论文作者签名:
导师签名:
日期:
年月日日期:
年月日
摘要
显齿蛇葡萄(Ampelopsisgrossedentata),属葡萄科,蛇葡萄属,为多年生野生藤本植物,是一种典型的类茶植物,主要分布于湖南、广东、广西、云南、贵州、湖北、江西、福建等省海拔400-1300m山坡的混交林中。
显齿蛇葡萄中富含黄酮醇类化合物二氢杨梅素(dihydromyrieetin,简写为DMY,又名双氢杨梅树皮素、福建茶素、蛇葡萄素等)。
在显齿蛇葡萄分布地区,当地人民将其嫩叶经过杀青、揉捻、烘干而成的类茶饮料称为藤茶,也称“茅岩莓茶”、“甘露茶”、“甜茶藤”、“白茶”等,用于治疗感冒发热、咽喉肿痛、黄疽型肝炎、高血压等症。
有关显齿蛇葡萄的研究主要集中在其活性成分的分离鉴定和主要成分的药用疗效等方面。
本文探讨了显齿蛇葡萄中总类黄酮的纯化工艺,并对显齿蛇葡萄中DMY的抗氧化活性和脂溶性修饰进行了初步研究。
1.总类黄酮的提取工艺。
以显齿蛇葡萄叶为原料,以乙醇-水为溶剂,加热回流提取其叶中的总类黄酮,通过响应面实验优化得到了最适提取工艺条件:
提取温度70℃,加热时间60min,乙醇浓度58%,液固比为40,提取一次。
在此条件下总类黄酮提取率可达到73.93%。
2.二氢杨梅素的抗氧化活性。
对两种不同的类黄酮提取物进行比较,A产物通过传统的溶剂法制的,B产物通过重结晶法制的。
采用紫外(UV)、红外(IR)、电喷雾质谱(ESI-MS)、核磁共振(NMR)、高效液相色谱(HPLC)分析,这两种产物中主要的类黄酮被确定为二氢杨梅素。
通过高效液相色谱还测得显齿蛇葡萄叶,A产物和B产物中的二氢杨梅素含量分别为32.96±1.18%,77.15±1.98%,95.12±2.86%,不同的抗氧化实验表明其抗氧化能力能与特丁基对苯二酚(TBHQ)相比较。
3.二氢杨梅素的脂溶性修饰。
为了提高二氢杨梅素的脂溶性,将一定量的二氢杨梅素和卵磷脂溶于四氢呋喃中,反应完全后水浴蒸发除去溶剂得到二氢杨梅素-卵磷脂复合物。
采用紫外(UV),红外(IR),扫描电子显微镜(SEM),差示量热扫描(DSC),X-射线衍射(XRD)等方法研究了该复合物的理化性质。
分析结果表明二氢杨梅素与卵磷脂并没有形成一种新的化合物,二者是通过非极性键相结合的。
通过形成复合物,二氢杨梅素在正辛醇的溶解度显著提高。
在DPPH自由基清除试验和油脂抗氧化试验中,该复合物的抗氧化活性显著高于2,6-二叔丁基对甲基苯酚(BHT)。
关键词:
显齿蛇葡萄,二氢杨梅素,制备,类黄酮,抗氧化,卵磷脂复合物
Abstract
Ampelopsisgrossedentata,atypicaltea,belongstotheAmpelosisintheVitaceaeMiehxfamilyofwildliane,andmainlydistributesinthemixedforest400to1300metersabovesealevelintheProvincesofHunan,Guangdong,Guangxi,Yunnan,Guizhou,Hubei,Jiangxi,Fujianetc.Therearerichflavonoidsdihydromyrieetin(DMY)inAmpelopsisgrossedentata.Beingofgreatvalueinmedicine,theleaveshasbeenusuallyprocessedintodrysampletoblewanddrink,andifonegetsacold,hasafeverorasorethroat,itisalwaysapplied.ThestudyonAmpelopsisgrossedentatamainlyfocusesontheisolationandidentificationofitsactiveingredientandthetherapeuticvalueoofitsconstituents.Thisthesismakesreseachesonpurificationmethodsoftotalflavonoid,antioxidativeactivityandMaxam-GilbertofFatSolutionofDMYinAmpelopsisgrossedentata.
1.Purificationmethodsoftotalflavonoid.Theflavonoidinampelopsisgrossedentataleaveswasextractedbyrefluexingwithethanol-water.Throughresponsesurfacemethodology,theoptimumconditionwasdeterminedasfollowing:
extractingtemperature70°C,extractingtime60min,ethanolconcentration58%,andratioofmaterialtosolvent40.Underthiscondition,theflavonoidyieldwasashighas73.93%.
2.AntioxidativeactivityofDMY.Twokindsofflavonoid-richextractsfromleavesofA.grossedentatawerepreparedbytraditionalsolventextraction(productA)andrecrystallization(productB).Byanalysisofultraviolet-visible(UV)spectrometry,infrared(IR)spectrometry,electrosprayionizationmassspectrometry(ESI-MS),nuclearmagneticresonance(NMR)spectrometryandhigh-performanceliquidchromatography(HPLC)-ESI/MS,themajorflavonoidintwoproductswasidentifiedas(+)-dihydromyricetin(DMY).Also,byHPLC,thecontentsofDMYinleaves,productAandproductBweremeasuredtobe32.96±1.18%,77.15±1.98%and95.12±2.86%,respectively.Variousantioxidanttests(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazylradicalscavenging,reducingpower,antioxidantactivityinlinoleicacidsystem)showedthattheantioxidantactivityoftheflavonoid-richextractscouldbecomparablewiththatoftertiarybutylhydroquinone.
3.Maxam-GilbertofFatSolutionofDMY.Inordertoimprovethelipophilicpropertyofdihydromyricetin,dihydromyricetinandlecithinwereresolvedintotetrahydrofuran.Aftertetrahydrofuranwasremoved,dihydromyricetin-lecithincomplexwasformed.Thephysicochemicalpropertiesofthecomplexwereanalyzedbyultraviolet-visiblespectrometry(UV),infraredspectrometry(IR),scanningelectronmicroscopy(SEM),differentialscanningcalorimetry(DSC),X-raydiffractometry(XRD).Theresultshoweddihydromyricetinandlecithininthecomplexwerecombinedbynon-covalent-bond,notforminganewcompound.Byformingthecomplex,thesolubilityofdihydromyricetininn-octanolwassignificantlyenhanced.Itwasfoundthatdihydromyricetin-lecithincomplexwassuperiortoBHTinDPPHradicalscavengingtestandintheRancimatantioxidanttest.
KEYWORDS:
Ampelopsis,grossedentata,dihydromyrieetin,preparation,flavonoid,LecithinComplex
第一章绪论
显齿蛇葡萄(Ampelopsisgrossedentata),属葡萄科,蛇葡萄属,为多年生野生藤本植物,是一种典型的类茶植物,由显齿蛇葡萄的嫩叶经过杀青、揉捻、烘干而成的类茶饮料称为藤茶,也称“茅岩莓茶”、“甘露茶”、“甜茶藤”、“白茶”等。
主要分布于湖南、广东、广西、云南、贵州、湖北、江西、福建等省海拔400-1300m山坡的混交林中[1-4]。
显齿蛇葡萄全株药用,味甘、淡、性凉,具有清热解毒、祛风湿、强筋骨等功效。
湖南、广西等地壮族和瑶族地区常用于治疗咽喉肿痛、感冒发热、黄疽型肝炎、痈疥、高血压等症[5-11]。
近年来,随着绿色革命的兴起,人们越来越重视从天然物质中寻找强身祛病的保健品,国内外对显齿蛇葡萄的研究逐渐活跃,但对其主要成分提取工艺和理化性质研究还不够质研究还不够系统全面。
1显齿蛇葡萄研究现状
1.1作为茶饮
显齿蛇葡萄作为“藤茶”在民间饮用已经有一千多年的历史,随着显齿蛇葡萄内生理活性物质的不断提取及其药理作用的不断深入研究,越来越显现出作为茶饮的广阔开发利用空间,在野生储量比较大的地区,依靠一些传统的简易加工技术,每年都有一定的产品投入市场,湖南张家界的“茅台霉茶”、福建宁远的“宁远藤茶’,广东的“广东白茶”,已经发展为特色产业,对带动当地农村经济发展具有十分重要的意义[12-14]。
为了使显齿蛇葡萄产品多样化,易诚对藤茶制作工艺进行了研究,针对藤茶的特点,通过对产品质量进行比较,选择最佳工艺途径,结果表明:
在150~160℃的温度杀青,再经手工揉捻20~25min,在40~50℃下焖青6~12h,再在太阳光下晒或烘至产品呈白霜状,得到高质量的藤茶产品[15]。
陈加勇等采用不同茶类与藤茶直接拼和的方式,通过感官审评的方法,进行了不同类型茶与藤茶复合茶风味探讨,结果表明:
以藤茶为原料,以35%或15%的红茶或花茶为辅料拼和而成的新藤茶风味较佳[16]。
1.2作为药材
显齿蛇葡萄茎、叶中有多种营养成分和矿质元素,尤其是Ca,Mg,Fe,Zn含量较高,还有对人体有保健作用的活性微量元素Se。
在含有的17种天然氨基酸中,其中9种为人体必需氨基酸。
含有的活性成分主要为黄酮类、福建茶素、龙涎香醇、杨梅黄素、β-谷甾醇和杨醇苷等,有降血脂、抗氧化和杀菌等作用[6-10]。
自古以来,产地群众将其嫩叶制成保健茶,用于治疗感冒发热、咽喉肿痛、黄疸型肝炎、疮疖等疾病,已有数千年应用历史[11]。
在显齿蛇葡萄分布面积比较大的地区,当地的村民每年都要采摘一些叶片,通过简单的加工,一些作为藤茶饮用,一些作为中草药使用,主要用作治感冒、清热解毒、助消化、治腹胀,喉炎肿痛、高血压等[5-6]。
近年来,随着显齿蛇葡萄产品加工工艺的研究不断深入,许多药效作用比较大的新产品不断出现。
张雁等将显齿蛇葡萄粗提物制成主治咽喉发炎的“含化片”已经上市;将显齿蛇葡萄茎叶经筛选取、粉碎、浸泡、过滤、浓缩等工艺制成显齿蛇葡萄浓缩汁,配以山梨糖醇、麦芽糖醇、柠檬酸、明胶、琼脂等经调配均匀、杀菌、装罐、杀菌冷却等工序制成了显齿蛇葡萄保健果冻,将显齿蛇葡萄的加工提高到了一个新的高度[17,18]。
1.3显齿蛇葡萄化学成分研究
为了使显齿蛇葡萄这种要用植物得到很好地开发利用,研究人员对显齿蛇葡萄的化学成分进行祥尽的研究,张友胜等从显齿蛇葡萄中分离了5种化合物单体[19]。
在对其所含黄酮类成分的研究中,周天达等从显齿蛇葡萄的幼嫩茎叶混合物中首次分离得到一种双氢黄酮醇的成分,鉴定为3,3′,4′,5,5′,7-六羟基-2,3-双氢黄酮醇,即双氢杨梅素[20]。
之后,覃洁萍等对此次研究进行了确证[21]。
何桂霞测定其总黄酮含量为43.4%~44.0%,RSD1.56%;双氢杨梅素含量为37.4%~38.5%,RSD1.85%~2.65%;杨梅素含量为1.72%~1.78%,RSD2.86%~3.21%;对瑶族显齿蛇葡萄的药用成分进行研究,主要要用成飞为3,5,7,3′,4′,5′-六羟基黄酮,即杨梅树皮素。
采用薄层扫描法测定了显齿蛇葡萄中二氢杨梅素和杨梅素的含量,建立了藤茶的药用品质质控方法,并以二氢杨梅素为指标,采用分光光度法对藤茶中总黄酮类成分的含量进行了测定,为该药材及其制剂的质量控制提供了标准[22-26]。
袁阿兴等从显齿蛇葡萄的地上部分又分得4个化合物:
龙延香醇(ambrein)、β-谷甾醇(β-sitosterol),杨梅素(myricetin)和杨梅苷(myricetrin)[27]。
王定勇等从显齿葡萄的乙酸乙酯提取物中分离得到9种化合物,经波谱分析、化学分析及与已知的化合物对照,分别鉴定为:
棕榈酸、β-谷甾醇、大黄素、没食子酸甲酯、槲皮素、槲皮素3-0-a-葡萄糖花旗松素、洋芹菜素和蛇葡萄素,9个化合物均为首次从该植物中分离得到。
王定勇从显齿蛇葡萄的正丁醇提取物中分离得到一种新化合物4′-羟基-3′-甲氧基异黄烷-7-O-á-L-吡喃鼠李糖甙,从显齿蛇葡萄的乙醇提取物中分离得到4′-羟基-3′-甲氧基异黄烷-7-O-á-L-鼠李糖(1→6)-β-D葡萄糖甙[9,28,29]。
张友胜等对显齿蛇葡萄基本成分进行了研究,结果表明:
显齿蛇葡萄粗蛋白含量为13.94%;溶性蛋白质含量为0.55%:
氨基酸总量为2.53%,其中,包括人体必需的8种氨基酸总量为0.4539%,非必需的9种氨基酸总量为1.8009%;总多酚18.5%;通过水浸提取总黄酮38.965%,其中二氢杨梅素单体含量达30.598%。
并从显齿蛇葡萄中分离出五羟基黄酮-3-芸香糖苷(即芦丁)没食子酰-a-D葡萄糖,没食子酸乙酯,没食子酸。
此外,他还针对春、夏季节不同的显齿蛇葡萄挥发油化学成分进行了分析,初步鉴定出春季样挥发油26种成分,夏季样17种成分。
应用色谱峰面积归一法测定各成分相对百分率,春季样和夏季样挥发油化学成分相差较大,但主要成分均为叶绿醇、正十六酸、雪松醇等[10,30,31]。
在同属植物的研究中,陈科力等等从蛇葡萄(Ampelopsissinica)根中分离并鉴定了六种成分:
羽扇豆醇(lupeol)、β-谷甾醇(betasitosterol)、胡萝卜苷(daucosterol)、儿茶素(Catechin)、蔗糖(Sucrose)和棕榈酸(palmiticacid),其中,羽扇豆醇系首次从蛇葡萄属中分离[32]。
徐志红等证明东北蛇葡萄Ampelopsisbrevipedunculata(Maxim)Trautv.根中含有黄酮类化合物、缩合鞣质、甾醇、三萜、维量生物碱、小分子酚性化合物及大量不饱和脂醇,并证明其乙醇浸出物具有抑制蛋白激酶C(pkc)的作用。
从中分得5种化合物:
β-谷甾醇、胡萝卜苷、没食子酸、三羟基(3-β,24S)-5-稀豆甾烷。
之后,又从中首次分离到8种单体:
β-香树脂醇(betaamyrin)、白桦脂醇(betulin),香草酸(vanillicacid)、没食子酸乙酯(ethylgallate)、山奈酚(Kaempferol)、3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲酯(3,5dimthoxy4hydroxybenzoicacid)、香橙素(aromadendrol)和藜芦醇(resveratrol)。
其中,没食子酸乙酯和香橙素具有抑制PKC蛋白激酶的作用[33,34]。
OshimaY等从其变种AmpelopsisbrevipedunculataVar.hancei的根中分离了白敛素F和G(AmpelopsinsF、G),两者均含有不常有的二苯并双环辛二烯结构;其根的甲醇提取液表现出明显的抗四氯化碳和半乳糖胺所导致的肝损伤[35]。
之后从中又分离了四种白敛素D、F、H(ampelopsinsD、F、H)和反式ampelopsinE(cisampelopsinE)以及已知化合物:
(—)表儿茶素(epicatechin)、pallidol、miyabenolc、piceid、cispiceid和白藜芦醇(3,4,5-三羟基芪、resveratroloside)等物质,其中ampelopsinE和反式ampelopsinE表现出抗肝炎毒素作用。
羽叶蛇葡萄Ampelopsischaffanjonii(levl)Rehd.系葡萄科蛇葡萄属植物,主要分布于云南东北部、四川、贵州、湖北、江西、安徽南部和福建西北部[2]。
李斌等从该植物中分离了新的三萜皂苷-蛇葡萄苷(ampelopsisoside)和7个已知化合物后,又于1997年从中分离到双氢杨梅素即蛇葡萄素(ampelopsin)[36,37]。
从AmpelopsisRadix的粗提液中与分离了石竹素葡萄糖苷(oleanolicacidglycoside)和菠菜甾醇3βD—吡喃葡糖苷(chondrillasterol3betaDglucopyranoside)等物质,之后证实AmpelopsisRadix的提取液中抗肿瘤的活性成分为石竹素糖苷中的苦瓜定Ⅰ、Id和Ie化合物(momordinI、Id、Ie)[38-39]。
1.4显齿蛇葡萄药用机理研究
近年来,研究学者对显齿蛇葡萄的功能研究主要集中在消炎、抑菌、止咳、镇痛、保肝、消脂、抗高血压等方面。
(1)消炎、止咳、祛痰、镇痛。
林建峰等证实其对小鼠巴豆油性耳廓水
肿、大鼠角叉菜胶性、甲醛性足跖肿胀及腹腔毛细血管通透性、急性、亚急性炎症的渗出过程均有抑制作用;对小鼠醛酸性扭体反应和热水反应显示有一定的镇痛作用,能提高小鼠的痛阈水平[40]。
钟正贤等在给小鼠做了一系列的实验,结果表明:
二氢杨梅素大小剂量组(1.0g·kg-1,0.5g·kg-1)和阳性对照药氯化胺(1.0g·kg-1)的酚红排泌量,与对照组比较均有明显升高,证实二氢杨梅素有明显祛痰作用;同时,二氢杨梅素能明显延长咳嗽潜伏期和减少咳嗽次数,其中大剂量组(1.0g·kg-1)的止咳作用强度与对照组咳必清相当[41]。
索朗等采用足肿胀、耳廓肿胀、腹腔毛细血管通透性、碳粒廓清、小鼠扭体等实验方法,对藤茶水提物的抗炎镇痛作用进行了研究,结果表明:
藤茶水提物在所用试剂量范围内[2、4、8g/(kg.d)-1]具有较明显的抗炎作用,但各剂量组对醋酸致小鼠扭体次数,对小鼠网状内皮系统的吞噬功能均无明显影响。
通过以上药理实验证实:
藤茶具有较明显的抗炎作用,它能显著抑制角叉菜胶致小鼠足肿胀,显著抑制巴豆油所致小鼠耳廓胀,抑制醋酸引起的小鼠腹腔毛细血管通透性的增高[42]。
除对藤茶进行研究外,很多学者针对复方藤茶进行了祛痰试验,表明该药具有较好的祛痰作用。
镇痛作用试验提示复方藤茶40g/kg组或20g/kg组对醋酸所致的腹险刺激疼痛具有较好的疗效,效果稍逊于罗通定。
对热板致痛的痛阈提高率比较,只有复方藤茶40g/kg组与生理盐求组比有显著差异,复方藤茶20g/kg组虽然可提高痛阈,但复方藤茶是生药,含镇痛物质较少,罗通定则是镇痛的纯生物碱[43,44]。
藤茶民间多用于清热解毒,镇咳化痰、祛凤湿、壮筋骨,现代药理试验证明藤茶能较好地镇痛。
藤茶水煎剂有明显发汗作用,防感藤茶乙醇提取液能显著降低致热后家兔体温,促进汗液和唾液的分泌,增强巨噬细胞的吞噬功能和溶血素抗体的形成[40]。
水煎
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